生物化学与分子生物学八课件25市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

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cloning),技术，是指在体外,利用酶学办法,将目的,DNA,片段与能自主复制遗传元件（又叫载体）连接，形成重组,DNA,分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而取得单一,DNA,分子大量拷贝。,克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用办法及相关工作统称为基因工程（,genetic engineering,）。因此，重组,DNA,技术又称为基因工程技术。,第3页,第3页,*,重组,DNA,技术发展简史,1865,年,G.J.Mendel,豌豆杂交试验,1944,年,O.T.Avery,肺炎球菌转化试验,1972,年,P.,Berg,构建第一个重组,DNA,分子,(,猿猴病毒,DNA,和,噬菌体,DNA),1973,年,S.Cohen,初次将,DNA,片段与质粒连接，并转化入,E.coli,1977,年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工，程公司，专门应用重组,DNA,技术制造医学上主要药物,1980,年 开始建造第一家应用重组,DNA,技术生产胰岛素工厂,1997,年 英国罗林研究所成功地克隆了“多莉”羊,Mendel,Paul Berg,Ian Wilmut and“Dolly”,第4页,第4页,第 一 节,重组,DNA,技术中惯用,工具酶,Frequently Used Enzymes in Recombinant DNA Technology,第5页,第5页,限制性核酸内切酶,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,反转录酶,末端脱氧核苷酰转移酶（末端转移酶）,DNA,聚合酶,DNA,聚合酶,I,大片段,Taq,DNA,聚合酶,多核苷酸激酶,工具酶在重组,DNA,技术中含有,特殊用途,第6页,第6页,重组,DNA,技术中惯用工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,辨认特异序列，切割DNA,DNA,连接酶,催化DNA中相邻5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,反转录酶,合成cDNA；替换DNA聚合酶I进行填补，标识或DNA序列分析,末端脱氧核苷酰转移酶,在,3,羟基末端进行同聚物加尾,DNA,聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接；缺口平移制作高比活性探针；,DNA,序列分析；填补,3,末端,Klenow,片段,又名DNA聚合酶I大片段，含有完整DNA聚合酶I53聚合、35外切活性，而无53外切活性。惯用于cDNA第二链合成，双链DNA 3末端标识等,Taq,DNA,聚合酶,惯用于PCR；产物3末端带有A，可用于T-A克隆,多核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标识探针,第7页,第7页,一、限制性核酸内切酶用于切割,DNA,定义,:,限制性核酸,内切,酶,(restriction endonuclease,RE),是辨认,DNA,特异序列,并在辨认位点或其周围切割双链,DNA,一类内切酶。,限制性核酸内切酶是重组,DNA,技术中主要工具酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,第8页,第8页,分类：依据酶识别切割特性、催化条件及是否含有修饰酶活性可分为、型三大类（基因工程技术中惯用型）,型：属于复合功效酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作为催化辅因子，在DNA降解时伴随有ATP水解。即它含有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。若识别位点上两条DNA链均未甲基化，则行使内切酶功效，并在切割DNA同时或之后转变为ATP酶；若位点上只有1条链被甲基化则发挥修饰功效，使另一条链也甲基化；若位点上两条链均甲基化就与位点解离。其显著特点是识别位点和切割部位不一致，无固定切割位点，普通在识别位点以外1kb（不少于400bp）到几kb（可多达7kb）处随机切割，不产生特异片段，故在基因重组中没有应用价值。,型：与型酶特性类似，也有甲基化功效，但无ATP酶和DNA解旋酶活力；不同是它能在DNA链上特异位点切割，其切割位点在识别位点以外，对基因工程意义也不大。,第9页,第9页,限制酶作用,与甲基化酶共同构成细菌限制修饰系统，限制外源,DNA,，保护本身,DNA,，犹似高等动物免疫系统。,型：就是通常指,DNA,限制性内切酶，在基因工程技术中惯用。特点：分子量小，仅需,Mg,2+,作为催化反应辅助因子，它们能辨认双链,DNA,特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异,DNA,片段。,类酶辨认序列特点为,回文结构，普通为,46bps,（有些为,8,或,8,个以上碱基序列）,，且富含,GC,。,GGA,TCC,CCT,AGG,第10页,第10页,第一个字母取自产生该酶细菌属名，用大写斜体；,第二、第三个字母是该细菌种名，用小写斜体；,第四个字母（有时无）代表株（可大写或小写）；,用罗马数字表示发觉先后顺序。,命名,H,in,d,属,种,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株第三种酶,（一）重组,DNA,技术中通常使用,型限制酶,第11页,第11页,E,=,Escherichia,，埃希氏菌属,co,=,coli,，大肠杆菌菌种,R=RY13,，菌株名,I=,第一个被分离到内切酶,命名,E,co,R,属,种,株,序,第12页,第12页,（二）,型限制性内切酶含有一些共性和特性,1.,含有特定辨认和切割位点,限制性内切酶,辨认位点,限制性内切酶,辨认位点,Apa,I,GGGCCC,CCCGGG,Sma,I,CCCGGG,GGGCCC,Bam,H I,GGATCC,CCTAGG,Sau,3A I,GATC,CTAG,Pst,I,CTGCAG,GACGTC,Not,I,GCGGCCGC,CGCCGGCG,Eco,R I,GAATTC,CTTAAG,Sfi,I,GGCCNNNNNGGCC,CCGGNNNNNCCGG,II,型限制性内切酶辨认位点举例（,示切割位点）,第13页,第13页,2.,辨认核苷酸序列通常为回文结构（,palindrome,）,第14页,第14页,第15页,第15页,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,黏端切口,3.,切割双链,DNA,分子后产生黏端或平端,（,sticky end,）,（,blunt end,）,第16页,第16页,第17页,第17页,同尾酶,（,isocaudarner,）,有些限制性内切酶即使辨认序列不完全相同，但切割,DNA,后，产生相同黏端，,这样酶彼此互称为同尾酶,。这两个相同黏端称为,配伍末端,(compatible end),。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,4.不同酶能够产生一样末端,第18页,第18页,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,CCCGGG,GGGCCC,C,CCCGG,CCGGG,G,+,Xma,CCCGGG,GGGCCC,CCC,GGG,GGG,CCC,+,Sma,能识别同一序列（切割位点可同或不同）但起源不同两种酶互称同工异源酶（isoschizomer）或同裂酶。,5.不同酶能够识别同一个序列,第19页,第19页,6.,切割会受其它原因影响,限制性内切酶通常不能切割在辨认位点内有特异碱基甲基化序列。,缓冲液或环境温度也会影响一些酶特异性。比如，,Eco,R I,在正常情况下辨认“,-GAATTC-,”序列，但在甘油浓度不小于,5%,（,v/v,）或反应温度较低时辨认序列可变为“,-AATT-,”或“,-,嘌呤嘌呤,AT,嘧啶嘧啶,-,”，这种现象称为星号活性（,star activity,），以,Eco,R I*,表示。,第20页,第20页,二、,DNA,连接酶用于催化,DNA,片段连接,DNA,连接酶（,DNA ligase,）：催化两个相邻,3-OH,和,5-,磷酸基团形成,3,，,5-,磷酸二酯键，从而使,DNA,片段或单链断裂形成缺口连接起来。,连接酶作用机制,第21页,第21页,BamH,I,第22页,第22页,1.,大肠杆菌染色体编码,DNA,连接酶,需,NAD,+,作为辅因子,2.,大肠杆菌,T4,噬菌体,DNA,编码,T4 DNA,连接酶,需,ATP,作为辅因子,DNA,连接酶起源,第23页,第23页,三、重组,DNA,技术中还需使用其它惯用工具酶,（一）碱性磷酸酶能清除核酸分子末端磷酸基团,（二）反转录酶以,RNA,为模板合成,cDNA,（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给,DNA,末端加尾以构成,黏,性末端,（四）,DNA,聚合酶,I,主要用于合成,DNA,（五）,DNA,聚合酶,I,大片段保留了有用酶活性,（六）,Taq,DNA,聚合酶惯用于,PCR,（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链,5,羟基末端磷酸化,第24页,第24页,来自于大肠杆菌（,bacterial alkaline phosphatase,，,BAP,）或小牛肠（,calf intestinal alkaline phosphatase,，,CIP,）。用于脱去,DNA,（,RNA,）,5,末端磷酸基团，使,5-P,成为,5-OH,，该过程称核酸分子脱磷酸作用。,（一）碱性磷酸酶能清除核酸分子末端磷酸基团,P,5,OH,3,OH,3,P,5,OH,5,OH,3,OH,3,OH,5,第25页,第25页,（二）反转录酶以,RNA,为模板合成,cDNA,反转录酶,（,reverse transcriptase,）,反转录酶催化,cDNA,合成,RNA,RNA,5,3,AAAAAA,AAAAAA,TTTTTT,5,3,cDNA,cDNA,随机引物,Oligo-dT,第26页,第26页,5,3,5,5,3,3,5,3OH,GGG,GG,dGTP,末端转移酶,（三）末端脱氧核苷酰转移酶用于给,DNA,末端加尾以构成黏端,第27页,第27页,大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,（,DNA polymerase I,）是基因工程中惯用,DNA,聚合酶。其除含有,53,聚合酶活性外，尚有,35,及,53,核酸外切酶活性。因其含有,53,核酸外切酶活性而惯用于,DNA,探针缺口平移法（,nick translation,）标识。,（四）,DNA,聚合酶,I,主要用于合成,DNA,第28页,第28页,DNA,聚合酶,I,大片段（,large fragment of DNA polymerase I,）为,DNA,聚合酶,I,用枯草杆菌蛋白酶（,subtilisin,）裂解后产生大片段，这个片段也称为,Klenow,片段（,Klenow fragment,）。其保留了,53,聚合酶活性及,3 5,外切酶活性，失去了,5 3,外切酶活性。它含有,35,外切酶活性能确保,DNA,复制准确性，即把,DNA,合成过程中错配核苷酸清除，再把正确核苷酸接上去（该活性称为校对活性）。,Klenow,片段主要用途有：补齐双链,DNA,3,末端，使其转变成平端；或通过补齐,3,端而使,3,末端标识；在,cDNA,克隆中，用于第二股链合成；用于,DNA,序列分析。,（,五）,DNA,聚合酶,I,大片段保留了有用酶活性,第29页,第29页,将黏端转变成平端,G,C T T A A,OH 3,5,3,5,GA A T T,C T T A A,5,3,3,5,对,5-,黏端片段，利用大肠杆菌,DNA,聚合酶,I,Klenow,片段，在,3-OH,端延伸，可填平末端凹陷并将其转变成平端,。,DNA,聚合酶,Eco,R,第30页,第30页,将黏端转变成平端,C T G C A,G,5,3,5,C,G,5,3,3,对,3,黏端片段，应用如,T4 DNA,聚合酶,35,核酸外切酶活性可切去未配正确序列，将其转变成平端。,核酸外切酶,Pst,5,3,第31页,第31页,（六）,Taq,DNA,聚合酶惯用于,PCR,Taq,DNA,聚合酶含有良好聚合活性和热稳定性，惯用于,PCR,。该酶含有,53,聚合酶活性及,53,外切酶活性，但没有,35,外切酶活性，因而无,35,校对活性，故在,PCR,反应中假如发生碱基错配，该酶没有校正功效。针对此不足，当前研发出各种高保真耐高温,DNA,聚合酶，大大减少了,PCR,过程中碱基错配率。,另外，,Taq,DNA,聚合酶含有末端转移酶作用，能在所合成,DNA,链,3,末端加上一个单独腺苷酸残基（,A,）。这样,PCR,产物可直接与带有,3-T,线性化载体（,T,载体）连接（即,T-A,克隆）。,第32页,第32页,（七）多核苷酸激酶可使寡核苷酸链,5,羟基末端磷酸化,惯用是,T4,多核苷酸激酶（,T4 polynucleotide kinase,），该酶含,5,多核苷酸激酶和,3,磷酸酶活性，能催化,ATP,-,位磷酸向,DNA,和,RNA,5-,羟基转移。,该酶惯用于：,DNA,或,RNA,5,末端标识；使没有,5-,末端磷酸,DNA,片段磷酸化，以供连接和克隆之用。,第33页,第33页,第二节,目的,DNA,获取,Preparation of Interested DNA,第34页,第34页,一、化学合成法可直接合成目DNA,要求：已知目的基因核苷酸序列或其产物氨基酸序列,应用：普通用于小分子肽类基因合成,第35页,第35页,*化学合成法获取目DNA,由已知氨基酸序列推测也许,DNA,序列,色 苯丙 蛋 赖,第36页,第36页,第一步：构建,基因组,DNA,文库,（是指包括某一个生物细胞或组织所有基因组,DNA,序列随机克隆群体，以,DNA,片段形式贮存了所有基因组,DNA,信息）。,第二步：筛选含有目的基因克隆。,二、从基因组DNA文库中获取目DNA,第37页,第37页,组织或细胞染色体,DNA,基因片段,克隆载体,重组,DNA,分子,含重组分子转化菌,限制性内切酶或机械剪切,受体菌,基因组,DNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带所有基因组,DNA,片段集合,*从基因组DNA文库获取目基因,第38页,第38页,三、从,cDNA,文库中获取目的,DNA,第一步：构建,cDNA,文库,（包括某一组织细胞在一定条件下所表示所有,mRNA,经反转录而合成,cDNA,序列克隆群体，它以,cDNA,片段形式贮存了所有基因表示信息）。,第二步：筛选含有目的,cDNA,克隆。,第39页,第39页,cDNA,文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带所有,cDNA,片段集合,第40页,第40页,基因组,DNA,文库和,cDNA,文库构建,第41页,第41页,从,基因组,DNA,文库或,cDNA,文库中筛选目的,DNA,策略,1.,菌落或噬斑原位杂交,2.,针对表示文库，可用抗原,-,抗体或配体,-,受体结合原理（亲和筛选法）筛选,第42页,第42页,*从基因组DNA文库获取目基因,菌落原位杂交法等办法，可从文库中筛选含有目的基因噬菌体,第43页,第43页,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,AAAAAA,cDNA synthesis,Infect cells,cDNA library,从cDNA文库获取目基因,第44页,第44页,假如已经知道目的基因序列，就能很以便地用,PCR,反应，从基因组,DNA,或,cDNA,中取得目的基因，可不必要通过复杂,DNA,文库构建过程。,PCR,是一个高效快速体外,DNA,聚合程序,四、经PCR获取目DNA,第45页,第45页,PCR,体系,模板,引物,耐热,DNA,聚合酶,dNTPs,含,Mg,2+,缓冲液,第46页,第46页,PCR,过程,变性,(Denaturing),:,经加热使模板,DNA,从,dsDNA,变成,ssDNA,退火,(Annealing),:,引物与模板,DNA,杂交,延伸,(Extension),:DNA,合成,第47页,第47页,ing,第48页,第48页,PCR,头三个循环,第49页,第49页,酵母单杂交系统,五、通过特异杂交系统获取一些转录因子编码,DNA,A.,无转录因子：汇报基因不表示,“,诱饵”,DNA,序列,B.,有转录因子：汇报基因表示,C.,有转录因子,AD/DNA,结合蛋白融合蛋白：汇报基因表示,转录因子,AD,转录因子,DNA,结合蛋白,汇报基因,汇报基因,汇报基因,.,第50页,第50页,.,汇报基因,汇报基因,酵母双杂交系统,B.,有互相作用蛋白质，汇报基因表示,启动子,A.,无互相作用蛋白质，汇报基因不表示,“,诱饵”,“,猎物,”,AD,BD,上游激活序列,启动子,BD,“,诱饵,”,“,猎物,”,AD,上游激活序列,第51页,第51页,第三节,重组,DNA,技术中,DNA,载体,DNA Vectors in Recombinant DNA Technology,第52页,第52页,载体（,vector,）,是为携带感兴趣外源,DNA,，实现外源,DNA,在受体细胞中无性繁殖或表示故意义蛋白质所采用一些,DNA,分子,按功效分,克隆载体（,cloning vector,）,表示载体（,expression vector,）,按基本元件起源不同,质粒载体,噬菌体载体,黏粒载体,病毒载体,人工染色体载体等,载体概述,第53页,第53页,克隆载体,(cloning vector),为使插入外源,DNA,序列被扩增而特意设计载体称为,克隆载体。,表示载体,(expression vector),为使插入外源,DNA,序列可转录和翻译成多肽链而特意设计载体称为,表示载体。,第54页,第54页,一、克隆载体用于外源,DNA,克隆和无性繁殖,（一）克隆载体应具备主要特点,至少有一个复制起点（,origin of replication,ori,）,至少有一个选择性标志（,selection marker,）,有适宜限制性内切酶单一切点：称为多克隆位点（,multiple cloning sites,，,MCS,）,应有较高拷贝数。,pBR322,质粒图谱,第55页,第55页,1.,质粒,(plasmid),特点：能在宿主细胞内独立自主复制；带有一些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,（二）惯用克隆载体有各种,第56页,第56页,严紧型质粒:质粒与细菌染色体同时复制，处于严密控制之下，其拷贝数较低。,松弛型质粒:质粒复制快于细菌染色体复制（即质粒复制不受严格控制），其拷贝数很高。重组DNA技术中使用质粒通常是松弛型。,不同质粒必须兼容才干共存于同一细胞中，这对复合转染（或转化）有参考价值。,当前，已经有一系列商品化质粒克隆载体可供选择，如pUC系列、pGEM系列等。,质粒载体通常所能容纳外源DNA长度在10 kb以内，外源DNA片段越长，质粒越不稳定。,第57页,第57页,pUC,系列质粒图谱,第58页,第58页,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适合用于,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适合用于基因组,DNA,克隆）,cos,位点,:,噬菌体,DNA,为线性双链分子，两端各有一条由,12,个碱基构成、彼此完全互补且,5,单链突出序列（即粘性末端），称,cos,位点,2.,噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,第59页,第59页,3.,穿梭载体（,shuttle vector,）,人工构建，含有不止一个复制起点，能携带外源DNA序列在不同种类宿主细胞中复制、扩增。,第60页,第60页,表示载体是指用来在宿主细胞中表示外源基因载体,依据其宿主细胞不同可分为:,原核表示载体（prokaryotic expression vector）,真核表示载体（eukaryotic expression vector）,二、表示载体用于外源,DNA,表示,第61页,第61页,（一）,原核表示载体用于在原核细胞中表示外源基因,从克隆载体发展而来，其除了具备克隆载体普通特点外，还需有调控外源基因有效转录和翻译序列，如启动子、核糖体结合位点、转录终止序列等。当前应用最广泛原核表示载体是大肠杆菌表示载体。原核表示载体基本构成下列：,R,：调整序列；,P,：启动子；,SD,：,SD,序列；,TT,：转录终止序列,大肠杆菌表示载体,第62页,第62页,Lac,启动子（乳糖启动子）,Trp,启动子（色氨酸启动子）,Tac,启动子（乳糖和色氨酸杂合启动子）,P,L,和,P,R,启动子（,噬菌体左向和右向启动子）,T7,启动子,1.,启动子是启动外源基因表示必需元件，其能被,RNA,聚合酶所辨认：,当前原核表示载体常使用启动子有下列几种,第63页,第63页,2.SD,序列提供核糖体结合位点,mRNA,在细菌中翻译严格依赖于核糖体结合位点（,ribosome binding site,）存在。,SD,序列（,Shine-Dalgarno sequence,）位于转录起始位点上游,8,13 bp,处，为富含嘌呤短片段，其能与核糖体,30S,小亚基中,16S rRNA 3,端部分序列互补结合。,SD,序列作为核糖体结合位点，确保了翻译起始复合物形成。,第64页,第64页,3.,转录终止序列有助于外源基因高效表示,尽管载体中没有转录终止序列，也可表示一些外源蛋白，但表示效果通常不抱负。因此，多数原核表示载体中都带有转录终止序列。,转录终止序列长短不一，短只有几十,bp,，长可达几百,bp,。,转录终止序列有助于使,RNA,聚合酶重点转录克隆外源基因，控制所转录,RNA,长度，提升,RNA,稳定性。,位于启动子上游转录终止序列可制止其它启动子通读，减少本底；位于多克隆位点下游转录终止序列可预防因外源基因表示而干扰载体稳定性。,第65页,第65页,4.,几种常见原核表示载体各有特点,依据表示目的蛋白方式，可将原核表示载体分为,（,1,）非融合型表示载体,（,2,）融合型表示载体,（,3,）分泌型表示载体,第66页,第66页,（,1,）非融合型表示载体用于表示非融合蛋白,非融合蛋白是指不与细菌任何蛋白或多肽融合在一起进行表示蛋白。表示该类蛋白载体称为非融合型表示载体。,使用强启动子,tac,，紧接,tac,启动子是多克隆位点，目的基因克隆于启动子和,SD,序列下游。在多克隆位点下游包括一个很强,rrnB,核糖体,RNA,转录终止子，其作用是为了稳定载体系统，由于上游强,tac,启动子控制转录必须由强终止子克制，才不至于干扰与载体本身稳定性相关基因表示。载体其余部分来自,pBR322,。,使用,pKK223-3,时，应配套使用,LacI,q,宿主菌，在无,IPTG,诱导时，,tac,启动子受阻遏，当加入,IPTG,后，便可去阻遏，从而使外源基因表示。,第67页,第67页,将一段特殊蛋白质（或短肽）基因构建入载体，使之与目的蛋白融合表示可形成融合蛋白（,fusion protein,）。表示该类蛋白载体称为融合型表示载体，如,pGEX,系统。,pGEX,系统包括各种载体，如,pGEX-lT,、,pGEX-2T,、,pGEX-3X,、,pGEX-4T,、,pGEX-5X,、,pGEX-6P,等。该系统载体使用强启动子,tac,，紧接启动子是,SD,序列及其下游,GST,基因，然后是多克隆位点。用,IPTG,可诱导目的基因表示，表示产物与,GST,融合，故可利用该标签对蛋白进行纯化,。,（,2,）融合型表示载体用于表示融合蛋白,第68页,第68页,该类载体长处是能把在受体细菌内表示外源蛋白有效地分泌到周质腔，甚至穿过细胞外膜进入培养基中。,在构建该类载体时，除有普通表示载体应有启动子等元件外，还需含有编码信号肽序列（通常置于,SD,序列下游）。,分泌型载体既可用于非融合蛋白表示，也可用于融合蛋白表示。,pIN,系列载体是较惯用分泌型表示载体，可使所表示蛋白分泌到宿主菌周质腔中。该系列载体以,pBR322,为基础构建而成，带有大肠杆菌中最强启动子之一，即,lpp,（脂蛋白基因）启动子，其中编码信号肽序列取自大肠杆菌中分泌蛋白基因,ompa,（外膜蛋白基因）。,（,3,）分泌型表示载体用于外源基因分泌表示,pIN 系列载体有3种，即pIN-ompA1、pIN-ompA2和pIN-ompA3，分别适合用于使用不同密码子框架目标基因插入，克隆位点分别为EcoR、Hind和BamH。,第69页,第69页,（二）真核表示载体用于在真原核细胞中表示外源基因,真核表示载体包括在大肠杆菌中起作用复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表示载体中还含有：,真核表示调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、,poly A,加尾信号等,真核细胞复制起始序列,真核细胞药物抗性基因,第70页,第70页,Ori,Pro,：原核复制起始序列；,P,：启动子；,MCS,：多克隆位点；,TT,：转录终止序列；,ori,euk,：真核复制起始序列。注：不是所有真核表示载体都有整合序列,真核表示载体基本构成,第71页,第71页,真核开启子和增强子在不同类型细胞中活性差异很大。一些起源于病毒开启子和增强子，其真核宿主细胞范围较广，如Rous肉瘤病毒基因组长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）、SV40病毒早期基因开启子和增强子、人类巨细胞病毒（CMV）开启子等。这些开启子和增强子组合可在广泛宿主细胞中起作用，故在真核表示载体中被普遍使用。,第72页,第72页,真核表示载体带有poly A 加尾信号可确保新转录mRNA能有效地加上poly A。,为mRNA加上poly A依赖于mRNA 3末端AAUAAA和其下游GU或U富含区。,尽管全长cDNA克隆可能已带有AAUAAA序列和一段poly A，但这些序列仍不足以确保poly A有效形成。因此，载体中必须带有poly A 加尾信号。,惯用来自SV40poly A加尾信号为237 bp，其中同时含有针对早期和晚期转录子切割和poly A 加尾信号。两套信号作用方向相反，并分别位于不同DNA链上，对mRNA加工均很有效。,第73页,第73页,酵母表示载体,昆虫表示载体,哺乳类细胞表示载体,依据真核宿主细胞不同，真核表示载体可主要分为 ：,第74页,第74页,（,1,）酵母表示载体适于在酵母细胞中表示外源蛋白,依据载体在酵母细胞中复制方式不同，可将酵母载体分为五类，,YIp：酵母整合型质粒,YRp：酵母复制型质粒,YCp：酵母着丝粒型质粒,YEp：酵母游离型质粒,YLp：酵母线性质粒,除YLp外，其余各类既可在大肠杆菌，又可在酵母细胞中复制与扩增。,第75页,第75页,依据在转化酵母细胞中复制机制，又可将酵母载体分为两个基本类型：,整合型载体，如,YIp,包括一个酵母,ura3,标志基因、大肠杆菌复制起始序列以及抗生素抗性基因。该质粒缺乏在酵母细胞中进行自主复制元件，其需通过质粒,DNA,与酵母,DNA,同源序列重组而整合至酵母基因组中,。,自主复制型载体，这类载体因在酵母细胞中有自我复制能力而得名，属于这类载体有：,YRp,、,YEp,和,YCp,。,第76页,第76页,YRp,含有酵母自主复制序列，但转化后缺乏有效分离，故在有丝分裂后，质粒在亲代细胞分布极多而在子代细胞较少或丢失，在遗传学方面极不稳定。,YEp,含有可诱导型启动子、信号肽编码序列（惯用交配因子,序列）和酵母质粒,2m,环片段，这类质粒可在染色体外自主复制（约,50100,拷贝,/,细胞），其转化效率高且质粒稳定，因此惯用该类载体在酵母细胞中高效表示外源基因。,YCp,是由自主复制序列与着丝点序列连接而成，该类载体特性是单拷贝（,1,2,拷贝,/,细胞），遗传性极其稳定。着丝点序列存在于酵母细胞每条染色体中，该序列在有丝分裂和减数分裂中能使染色体稳定而准确地复制，这是保持该类载体稳定关键原因。,第77页,第77页,（,2,）昆虫表示载体可在昆虫细胞中表示真核基因,昆虫表示载体主要有两类：,杆状病毒表示载体。载体启动子为多角体蛋白,(polyhedrin),基因启动子，所使用外泌信号序列来自蜜蜂,milittin,序列，其可在宿主细胞（如,Sf9,或,Sf20,）中高水平表示外源蛋白。,果蝇表示载体。载体上启动子有,Ac5,（果蝇黑素激动蛋白,5C,基因）启动子和,MT,（果蝇黑素金属硫蛋白基因）启动子，所使用外泌信号序列为,Bip,序列，其可连续表示或诱导表示外源蛋白。,第78页,第78页,（,3,）哺乳类细胞表示载体适宜在哺乳类细胞中表示真核基因,据载体进入宿主细胞方式分为病毒载体和质粒载体,据载体在宿主细胞内是否整合于细胞染色体,DNA,，可将其分为整合型和非整合型载体,整合型载体普通是随机整合入染色体，但所携带外源基因表示受插入位点影响，同时还也许会改变宿主细胞生长特性，整合型载体通惯用于外源基因稳定表示；非整合型载体通惯用于外源基因瞬时表示,最惯用哺乳类细胞表示载体是病毒载体,第79页,第79页,一个抱负病毒表示载体，通常应具备下列条件：,使用安全，对宿主细胞无毒副效应；,能容纳较大外源,DNA,片段且转染效率高；,所产生病毒效价高；,外源基因在靶组织或靶细胞中能长期、稳定表示,病毒靶向性强；,外源基因表示含有可控性。,然而，遗憾是，到当前为止，还没有任何一个病毒载体能满足以上所有抱负条件。,第80页,第80页,病毒表示载体由各种病毒,DNA,衍生而来，其构建时普通都把细菌质粒复制起点放置其中，使病毒载体及其所携带目的,DNA,能以便地在细菌中繁殖和克隆，然后再转入真核细胞。,通过质粒化改建病毒载体通常都包括病毒启动子、包装元件、遗传标识和质粒复制起点等几种部分。,第81页,第81页,当前，惯用病毒表示载体包括下列各种：,反转录病毒（,retrovirus,RV,）载体,RV,属,ssRNA,病毒。,构建,RV,载体时，将,RV,DNA,插入,pBR322,质粒，同时删除,RV,三个编码基因，保留两端,LTR,和病毒颗粒包装序列,，再加入供筛选标识基因。,5LTR,具启动子和增强子活性并具转录起始信号，,3LTR,具转录终止信号。,RV,载体含有较高整合和表示外源基因能力，广泛用于转基因动物和基因治疗研究，但因其随机整合，其安全性问题需加以考虑。,第82页,第82页,慢病毒（lentivirus,LV）载体,LV载体是以HIV-1（I型人类免疫缺点病毒）为基础发展起来表示载体；,与普通RV载体不同是，它对分裂细胞和非分裂细胞均含有感染能力；,该载体可将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而取得持久表示；,该载体宿主细胞较广，在表示目标蛋白和小干扰RNA方面都有广泛应用。,第83页,第83页,腺病毒（,Adenovirus,AV,）载体,AV,属线性,dsDNA,病毒；,当前，普遍使用是,AV,第三代载体，载体中清除了所有,AV,编码基因，仅保留了,5,和,3,末端反向重复序列（,inverted terminal repeats,，,ITR,）及病毒包装序列,，病毒载体外壳包装需要辅助病毒提供编码序列；,第三代,AV,载体能容纳较大,DNA,片段，能较长时间地表示外源基因，其毒性和免疫原性都大大减少。,第84页,第84页,腺相关病毒（,adenovirus-associated virus,，,AAV,）载体,AAV,属于线性,ssDNA,病毒。,构建,AAV,载体时，用外源基因及其调整序列取代病毒,rep,和,cap,编码区，仅保留两端,145 bp,ITRs,，负责病毒获救、复制、包装与整合；而辅助质粒则保留所有编码序列而无,ITRs,。两种质粒间无重复序列，重组,AAV,复制和壳化所需,rep,和,cap,基因，由辅助质粒直接以蛋白表示方式提供，故不会发生野生型病毒序列重组、复制和包装。当,AAV,载体与辅助质粒共转染辅助病毒（,AV,）感染细胞时，即能获救、复制并包装成重组,AAV,颗粒。,AAV,载体含有能稳定表示外源基因、特异整合至人,19,号染色体长臂末端、病毒稳定且宿主范围广、不引起免疫反应等长处,。,第85页,第85页,痘苗病毒（,vaccinia virus,，,VV,）载体,VV,属,dsDNA,病毒。,构建,VV,载体时，通常以胸苷激酶（,thymidine kinase,tk,）基因作为筛选标志。,tk,序列中插有该病毒早期启动子和下游多克隆位点。含有外源,DNA,重组,VV,载体,tk,基因不表示，当与野生型,VV,共转染宿主细胞并经,tk,同源序列重组，便可取得既有外源基因又有,tk,基因重组,VV,颗粒，进而导入,tk,缺点细胞后，可在含有次黄嘌呤、氨蝶呤和胸苷培养基中筛选，只有,tk,表示细胞才干生长。,VV,载体含有克隆容量大（可插入,25,40 kb,外源,DNA,片段）、可插入多个外源基因、病毒宿主细胞广且使用安全等长处。,第86页,第86页,猿猴空泡病毒,40,（,simian vacuolating virus 40,，,SV40,）载体,SV40,基因组为双链环状,DNA,人工构建,SV40,载体主要有重组病毒质粒载体和取代型重组病毒载体两种类型，前者是将,SV40,基因组复制起点序列插入质粒载体中，从而构建成病毒,-,质粒载体；后者是用外源基因取代病毒基因组中与其大小相称一个片段，从而形成取代型重组病毒载体,第87页,第87页,单纯疱疹病毒（,herpes simplex virus,，,HSV,）载体,HSV,为线性,DNA,病