生物化学与分子生物学八市公开课金奖市赛课一等奖课件.pptx

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,目 录,目 录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,目 录,第 十 章,三羧酸循环,Tricarboxylic Acid Cycle,第1页,第1页,第 一 节 三羧酸循环发觉,Dis,covery of the Citric Acid Cycle,第2页,第2页,糖原,三酯酰甘油,蛋白质,葡萄糖,脂酸,+,甘油,氨基酸,乙酰,CoA,TCA,循环,2H,呼吸链,H,2,O,ADP+Pi,ATP,CO,2,*,营养物在生物体内氧化普通过程,一、三羧酸循环是三类营养物质氧化分解（共同）第二阶段,第3页,第3页,在真核生物，,TCA,循环在,线粒体,中进行，与呼吸链在功效和结构上相偶联。,第4页,第4页,三羧酸循环,亦称柠檬酸循环（,citric acid cycle,），这是由于循环反应中第一个中间产物是一个含三个羧基柠檬酸。由于,Krebs,正式提出了三羧酸循环学说，故此循环又称为,Krebs,循环。,二、,Krebs,发觉三羧酸循环,第5页,第5页,1937年，Hans Krebs利用鸽子胸肌（这块肌肉在飞行中有相称高呼吸频率，因此尤其适合于氧化过程研究）组织悬液，测定了在不同有机酸作用下，丙酮酸氧化过程中耗氧率，初次提出在动物组织中丙酮酸氧化路径假说。,第6页,第6页,Albert Szent-Gyorgyi,等已经发觉动物肌肉组织中一些,4,碳二羧酸（,琥珀酸、延胡索酸、苹果酸和草酰乙酸,）能刺激氧消耗。,Krebs,证实了这项发觉，并且发觉它们也可刺激,丙酮酸,氧化过程。并且他还发觉肌肉中丙酮酸氧化还可被,6,碳三羧酸，如,柠檬酸、顺乌头酸和异柠檬酸,及,5,碳,-,酮戊二酸,激活。上述有机酸激活效应是明显，任何一个这些有机酸增长，甚至是很少许增长都能大大激活丙酮酸氧化过程。,第7页,第7页,Krebs,第二项重大发觉是观测到丙二酸对丙酮酸有氧氧化克制作用。,丙二酸是琥珀酸类似物，是琥珀酸脱氢酶竞争性克制剂，在肌肉悬浮液中，无论加入上述哪一个有机酸，只要丙二酸存在，丙酮酸有氧氧化过程就会被克制。,这表明在涉及丙酮酸氧化酶促反应中，琥珀酸和琥珀酸脱氢酶必定是很关键成份。,Krebs,进一步发觉，当用丙二酸去克制肌肉组织悬液中丙酮酸有氧氧化时，在这个悬液介质中就会有柠檬酸、,-,酮戊二酸和琥珀酸积累，,这表明柠檬酸和,-,酮戊二酸通常为琥珀酸前体。,第8页,第8页,依据上述试验观测和一些其它证据，,Krebs,得出一个结论：上述有机三羧酸和二羧酸能够以一个符合化学逻辑序列排列。由于用丙酮酸和草酰乙酸与肌组织共同孵育，即可造成溶液介质中柠檬酸堆积，因此,Krebs,推理这一系列反应是以循环方式而不是以线性方式存在，即它开始和结尾是连在一起。,第9页,第9页,从这些简朴试验和逻辑推理中，,Krebs,假定他所称柠檬酸循环是肌肉中碳水化合物氧化主要路径。柠檬酸循环也称,TCA,循环，由于在,Krebs,提出这个循环假说若干年以后，还不拟定柠檬酸或者一些其它三羧酸，比如异柠檬酸是否是由丙酮酸和草酰乙酸反应所形成第一个产物。自,Krebs,提出,TCA,循环假设后，研究发觉该循环不但在肌肉组织中起作用，并且在需氧动物和植物所有组织中，以及许多需氧微生物中均发挥着功效。,第10页,第10页,TCA,循环最初只是建立在试验基础上假说。随后，在体外对参与循环中酶研究证实并阐明了该循环细节。但是这些酶是否在完整活细胞循环中真正发挥功效？细胞内该循环效率是否足以解释动物组织中葡萄糖氧化效率？这些问题已经通过用同位素标识代谢物研究（如丙酮酸或乙酸酯分子中特定碳原子,13,C,或,14,C,标识等同位素示踪试验），证实,TCA,循环确实以很高效率在活细胞中存在。现在,TCA,循环已被公认为是营养物分解代谢必经路径。,第11页,第11页,第 二 节三羧酸循环反应过程,Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle Reactions,第12页,第12页,TCA,循环是一个由一系列酶促反应构成循环反应系统，在该反应过程中，首先由,乙酰,CoA,（主要来自于三大营养物质分解代谢）与,草酰乙酸,缩合生成含,3,个羧基,柠檬酸,（,citric acid,），再通过,4,次脱氢、,2,次脱羧，生成,4,分子还原当量（,reducing equivalent,）和,2,分子,CO,2,，重新生成,草酰乙酸,这一循环反应过程称为,三羧酸循环,。,第13页,第13页,还原当量（,reducing equivalent,）,普通是指以氢原子或氢离子形式存在一个电子或一个电子当量。,第14页,第14页,一、,TCA,循环由八步反应构成循环反应路径,第15页,第15页,（一）乙酰,CoA,与草酰乙酸缩合成柠檬酸,乙酰辅酶,A,（,acetyl CoA,）与草酰乙酸（,oxaloacetate,）缩合成柠檬酸（,citrate,）；,反应由,柠檬酸合酶（,citrate synthase,）,催化。,第16页,第16页,（二）柠檬酸经顺乌头酸转变为异柠檬酸,此反应是由,顺乌头酸酶,催化异构化反应。,由两步反应构成，,(1),脱水反应；,(2),水合反应。,第17页,第17页,（三）异柠檬酸氧化脱羧转变为,-,酮戊二酸,异柠檬酸在,异柠檬酸脱氢酶,（,Isocitrate dehydrogenase,）作用下，氧化脱羧而转变成,-,酮戊二酸（,-Ketoglutarate,）。,第18页,第18页,（四）,-,酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰,CoA,在,-,酮戊二酸脱氢酶复合体,催化下,-,酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰,CoA(succinyl-CoA),；,该脱氢酶复合体构成及催化机制与丙酮酸脱氢酶复合体类似。,第19页,第19页,（五）琥珀酰,CoA,合成酶催化底物水平磷酸化反应,在,琥珀酰,CoA,合成酶,催化下，琥珀酰,CoA,高能硫酯键水解与,GDP,磷酸化偶联，生成琥珀酸、,GTP,和辅酶,A,。,这是三羧酸循环中唯始终接生成高能磷酸键反应。,第20页,第20页,GTP,GDP,ATP,ADP,核苷二磷酸激酶,目 录,第21页,第21页,（六）琥珀酸脱氢生成延胡索酸,此步反应由,琥珀酸脱氢酶,催化，其辅酶是,FAD,，是三羧酸循环中唯一与内膜结合酶。,第22页,第22页,（七）延胡索酸加水生成苹果酸,延胡索酸酶,催化此步反应,第23页,第23页,（八）苹果酸脱氢生成草酰乙酸,苹果酸脱氢酶,催化此步反应，辅酶是,NAD,+,。,目 录,第24页,第24页,CoASH,NADH+H,+,NAD,+,CO,2,NAD,+,NADH+H,+,CO,2,GTP,GDP+Pi,FAD,FADH,2,NADH+H,+,NAD,+,H,2,O,H,2,O,H,2,O,CoASH,CoASH,H,2,O,柠檬酸合酶,顺乌头酸酶,异柠檬酸脱氢酶,-,酮戊二酸脱氢酶复合体,琥珀酰,CoA,合成酶,琥珀酸脱氢酶,延胡索酸酶,苹果酸脱氢酶,GTP,GDP,ATP,ADP,核苷二磷酸激酶,目 录,第25页,第25页,2CO,2,4,2H,第26页,第26页,二、一次,TCA,循环生成,2,分子,CO,2,在,TCA,循环反应过程中，从,2,个碳原子乙酰,CoA,与,4,个碳原子草酰乙酸缩合成,6,个碳原子柠檬酸开始，重复地脱氢氧化。,TCA,循环中通过脱羧方式生成,CO,2,。,1,个二碳单位进入,TCA,后，有,2,次脱羧反应，生成,2,分子,CO,2,，这是体内,CO,2,主要起源。,TCA,循环过程中，共有,4,次脱氢，其中,3,次脱氢由,NAD,+,接受，,1,次由,FAD,接受。,第27页,第27页,TCA,循环过程中，共有,4,次脱氢，其中,3,次脱氢由,NAD,+,接受，,1,次由,FAD,接受。,TCA,循环本身每循环一次只能以底物水平磷酸化生成,1,个,ATP,。,TCA,循环总反应式：,CH,3,COSCoA+3NAD,+,+FAD+GDP+Pi+2H,2,O,2CO,2,+3NADH+3H,+,+FADH,2,+HSCoA+GTP,第28页,第28页,三、,TCA,循环中间产物本身并无量改变,TCA,循环中间产物包括草酰乙酸在内起着催化剂作用，本身并无量改变。,不也许通过,TCA,直接从乙酰,CoA,合成草酰乙酸或其它中间产物；同样，这些中间产物也不也许直接在,TCA,循环中被氧化生成,CO,2,和,H,2,O,。,TCA,循环中草酰乙酸主要来自丙酮酸直接羧化，也可通过苹果酸脱氢产生。无论何种起源，其最后起源是葡萄糖。,第29页,第29页,第 三 节三羧酸循环调控,Regulation of Tricarboxylic Acid Cycle,第30页,第30页,一、丙酮酸脱氢酶复合体活性改变可影响乙酰,CoA,生成,别构调整,当脂肪酸或乙酰,CoA,充足时，或,ATP/ADP,和,NADH/NAD_,比值增高时，该酶活性被别构克制；,而当机体需要能量时，或,ATP/ADP,减少时，该酶被,AMP,等变构激活。,化学修饰调整,当胞内,ATP,增高时，丙酮酸脱氢酶复合体成份中丙酮酸脱氢酶（,E1,）由于磷酸化而失活；,当,ATP,减少时，磷蛋白磷酸酶清除,E1,上磷酸基团而激活该复合体。,第31页,第31页,二、,TCA,循环受底物、产物和调整酶活性调整,TCA,循环速度和流量主要受种原因调控：,底物供应量,催化循环最初几步反应酶反馈别构克制,产物堆积克制作用,第32页,第32页,（一）,TCA,循环中有个调整调整酶,TCA,循环中催化个不可逆反应酶：,柠檬酸合酶,异柠檬酸脱氢酶,-,酮戊二酸脱氢酶,第33页,第33页,乙酰,CoA,柠檬酸,草酰乙酸,琥珀酰,CoA,-,酮戊二酸,异柠檬酸,苹果酸,NADH,FADH,2,GTP,ATP,异柠檬酸,脱氢酶,柠檬酸合酶,-,酮戊二酸,脱氢酶复合体,ATP,+,ADP,ADP,+,ATP,柠檬酸,琥珀酰,CoA,NADH,琥珀酰,CoA,NADH,+,Ca,2+,Ca,2+,ATP,、,ADP,影响,产物堆积引起克制,循环中后续反应中间产物别位反馈克制前面反应中酶,其它，如,Ca,2+,可激活许多酶,三羧酸循环调整,第34页,第34页,（二）,TCA,循环与上游和下游反应协调,在正常情况下，（糖）酵解路径和,TCA,循环速度相协调；,氧化磷酸化速率对,TCA,循环运转也起着非常主要作用。,第35页,第35页,三、,TCA,循环各种酶以复合体形式存在于线粒体,TCA,循环中酶在线粒体中是以各种酶构成复合体形式存在，这种酶复合体被称为代谢区室（,metabolons,），它在细胞内能够有效地将代谢中间产物从一个酶传递给另一个酶。这些复合体含有高效介导中间产物流通功效，因此也可影响代谢速率。,第36页,第36页,第四节三羧酸循环生理意义,Physiologic Significance of Tricarboxylic Acid Cycle,第37页,第37页,一、,TCA,循环是一条,“,两用代谢路径,”,TCA,循环在大多数生物中是分解代谢路径,;,各种生物合成路径也利用,TCA,循环中间产物作为合成反应起始物。,（一）,TCA,循环参与合成和分解路径构成,第38页,第38页,TCA,中间产物,（二）,TCA,循环中间产物是合成糖、脂肪酸和氨基酸前体,1.TCA,循环中间产物能够异生为糖,草酰乙酸,异生为葡萄糖,氨基酸,第39页,第39页,乙酰,CoA,2.TCA,循环中间产物可为脂酸合成提供原料,合成脂酸,柠檬酸,-,丙酮酸循环,第40页,第40页,-,酮戊二酸,+NH,4,+,3.TCA,循环中间产物可为非必需氨基酸合成提供碳架,谷氨酸,谷氨酸脱氢酶,NADH+H,+,NAD,+,第41页,第41页,第42页,第42页,（三）添补反应补充,TCA,循环中间产物,参与其它代谢路径而消耗,TCA,循环中间产物必须及时补充，才干保持,TCA,循环顺利进行。这类反应被称为,添补反应（,anaplerotic reaction,）,。,最主要添补反应是由丙酮酸羧化酶催化，从丙酮酸生成草酰乙酸反应。,丙酮酸,+CO,2,草酰乙酸,丙酮酸羧化酶,ATP,ADP+Pi,第43页,第43页,乙酰,CoA,是丙酮酸羧化酶激活剂；,TCA,循环中酶促反应能够将草酰乙酸转变为其它中间产物；,另外，可由别路径生成一些中间产物，如：,奇数碳链脂肪酸,琥珀酰,CoA,一些氨基酸,-,酮戊二酸、草酰乙酸,第44页,第44页,二、,TCA,循环在三大营养物质代谢中含有主要生理意义,（一）,TCA,循环是三大营养物质最后代谢通路,（二）,TCA,循环是糖、脂肪和氨基酸代谢联系枢纽,第45页,第45页,第五节三羧酸循环关键反应分析原理,Analytical Principles of Key Reactions of Tricarboxylic Acid Cycle,第46页,第46页,一、采用分光光度法测定硫氢辅酶,A,生成量分析柠檬酸合酶活性,反应生成辅酶,A,和,5,5-,二硫代双（,2-,硝基苯甲酸）（,DNTB,）在,pH 7.4,、,0.1 M,三乙醇胺和,0.2 M,乙二胺四乙酸钙钠（,EDTA,）溶液中反应生成硫氢辅酶,A,，其在,412 nm,时有吸取峰，通过度光光度计测定吸光度，测定硫氢辅酶,A,生成量。以此反应柠檬酸合酶酶活性。,第47页,第47页,二、采用分光光度法检测,NADH,生成量分析异柠檬酸脱氢酶活性,反应中异柠檬酸脱氢酶酶活性检测主要通过测定生成,NADH,在,340 nm,吸光度。检测体系包括,120 mM,D,，,L-,异柠檬酸三钠,，,30 mM,硫酸锰,20 mM,NAD+,及异柠檬酸脱氢酶。,第48页,第48页,三、采用分光光度法测定,NADH,生成量分析,-,酮戊二酸脱氢酶活性,通过测定,NADH,在,340 nm,时吸光度改变反应,-,酮戊二酸脱氢酶复合体酶活性。检测体系包括,1.0 ml,磷酸盐；,0.15 ml,辅酶,A,；,0.1 ml,半胱氨酸,;0.1 ml NAD,+,；,0.5ml,酶。,第49页,第49页,四、采用分光光度法测定顺乌头酸生成量分析顺乌头酸酶活性,检测体系包括,100 mmol/L,氯化钠，,30 mmol/L,柠檬酸钠,20,mmol/L,Tris/HCl,和酶，在,1.00 ml,反应终体积，,pH 7.4,溶液中，反应在,25,进行，通过检测顺乌头酸在,240nm,吸光度反应顺乌头酸酶酶活性。,第50页,第50页,