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目目录录 基因诊断与基因治疗基因诊断与基因治疗Gene Diagnosis and Gene Therapy第二十八章第二十八章第1页第1页目目录录目目录录F第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础F第二节第二节 遗传病基因诊断遗传病基因诊断F第三节第三节 传染病基因诊断传染病基因诊断F第四节第四节 肿瘤基因诊断肿瘤基因诊断F第五节第五节 基因基因诊诊断在法医学上断在法医学上应应用用 F第六节第六节 基因治疗概念及策略基因治疗概念及策略 本章内容提纲本章内容提纲第2页第2页目目录录目目录录第一节第一节 基因诊断学基础基因诊断学基础Basis of Gene Diagnostics第3页第3页目目录录目目录录基因诊断之父基因诊断之父简悦威简悦威1976年年加加州州大大学学华华裔裔科科学学家家KanYW用用核核酸酸分分子子杂杂交交技技术术初初次次对对一一例例地地中中海海贫贫血进行诊断。血进行诊断。第4页第4页目目录录目目录录一、一、基因基因诊诊断概念、特点及断概念、特点及临临床意床意义义 定义：定义：利利用用分分子子生生物物学学技技术术，通通过过检检测测基基因因及及基基因因表表示示产产物物存存在在状状态态，对对人人体体疾疾病病作作出出诊诊断断办办法法。基基因因诊诊断断检检测测目目的的分分子子是是DNADNA、RNARNA，也也能够是蛋白质或者多肽。能够是蛋白质或者多肽。第5页第5页目目录录目目录录诊断依据诊断依据(遗传物质改变遗传物质改变)lDNA、RNA或或蛋蛋白白质质水水平平改改变变，如如病病毒毒基基因因及及其其转转录录产产物物在在体体内内从从无无到到有有、癌癌基基因因表表示示水水平平从低到高；从低到高；l基基因因结结构构改改变变，如如点点突突变变引引起起基基因因失失活活、染染色色体转位引起基因异常激活或灭活。体转位引起基因异常激活或灭活。第6页第6页目目录录目目录录基因诊断特点基因诊断特点高特异性高特异性高灵敏性高灵敏性早期诊断性早期诊断性应用广泛性应用广泛性第7页第7页目目录录目目录录二、基因诊断中惯用分子生物学技术二、基因诊断中惯用分子生物学技术n核酸分子杂交（核酸分子杂交（Nucleicacidhybridization）n聚合酶链式反应聚合酶链式反应(PCR)n单链构象多态性（单链构象多态性（SSCP）n限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（RFLP）nDNA序列测定（序列测定（DNAsequencing）n生物芯片（生物芯片（biochips）nWestern免疫印迹（免疫印迹（Westernblotting）n免疫组织化学诊断免疫组织化学诊断第8页第8页目目录录目目录录（一）核酸分子杂交（一）核酸分子杂交 Nucleicacidhybridization 指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离指两条单链核酸在一定条件（温度、盐离子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补原则重新子和有机溶剂浓度）下，按碱基互补原则重新配对形成双链过程。配对形成双链过程。第9页第9页目目录录目目录录核酸分子杂交流程核酸分子杂交流程 待测核酸制备待测核酸制备滤膜上核酸固化滤膜上核酸固化杂交杂交清除未杂交探针清除未杂交探针检测杂交信号检测杂交信号核酸探针制备核酸探针制备探针标识探针标识加入标识探针加入标识探针第10页第10页目目录录目目录录提提取取DNA限限制制性性内内切切酶酶消消化化DNA以以产产生生特特定定长长度度片片段段凝凝胶胶电电泳泳分分离离变变性性处处理理DNA转转印印到到膜膜上上并并使使其其牢牢固固结结合合将将标标识识探针与膜上探针与膜上DNA片段杂交，分析杂交信号。片段杂交，分析杂交信号。1.Southern印迹杂交印迹杂交(Southernblotting)第11页第11页目目录录目目录录RNA经经变变性性琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳后后，转转移移到到固固相相支支持持物物上上，通通过过度度子子杂杂交交检检测测特特定定mRNA分子含量与大小。分子含量与大小。2.Northern印迹杂交印迹杂交(Northernblotting)第12页第12页目目录录目目录录3.斑点杂交（斑点杂交（dotblotting）将将RNA或或DNA变变性性后后直直接接点点样样于于硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜上上，用用于于基基因因组组中中特特定定基基因因及其表示产物定性及定量研究。及其表示产物定性及定量研究。第13页第13页目目录录目目录录4.反向斑点杂交反向斑点杂交（reversedotblotting）先先将将探探针针固固定定于于硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜或或尼尼龙龙膜膜上上，将将样样品品RNA或或DNA标标识识变变性性后后进进行行杂杂交交。改改变变了了老老式式杂杂交交办办法法中中一一次次杂杂交交只只能能检检测测一一个个样样品品局局限限，大大大大提提升升了了基基因因诊诊断效率断效率。第14页第14页目目录录目目录录寡寡核核苷苷酸酸中中碱碱基基错错配配会会大大大大影影响响杂杂交交分分子子稳稳定定性性，可可用用人人工工合合成成针针对对正正常常和和突突变变ASO探探针针进进行行反反向向斑斑点点杂杂交交，检检测测点点突突变变，大大大大提提升升检测结果可靠性。检测结果可靠性。等位基因特异性寡核苷酸等位基因特异性寡核苷酸(allelespecificoligonucleotide,ASO）第15页第15页目目录录目目录录5.5.原位分子杂交原位分子杂交n荧光原位杂交荧光原位杂交(fluorescencein situhybridization,FISH）n挂锁挂锁FISH(FISHwithpadlock)第16页第16页目目录录目目录录荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）第17页第17页目目录录目目录录6.固相夹心杂交法固相夹心杂交法(sandwichhybridization)待待测测靶靶基基因因序序列列上上两两个个相相邻邻但但不不重重叠叠DNA片片段段（A、B片片段段），分分别别作作为为捕捕获获探探针针（不不标标识识A片片段段）和和检检测测探探针针（标标识识B片片段段），同同时时与与靶靶基基因因杂杂交交。先先将将捕捕获获探探针针吸吸附附于于固固相相支支持持物物上上，与与靶靶基基因因序序列列A部部分分杂杂交交，再再加加入入标标识识检检测测探探针针，检检测测探针与靶基因序列探针与靶基因序列B部分杂交，检测杂交信号。部分杂交，检测杂交信号。第18页第18页目目录录目目录录固相夹心杂交法示意图固相夹心杂交法示意图 第19页第19页目目录录目目录录（二）（二）聚合酶链式反应聚合酶链式反应 (polymerasechainreaction,PCR）模板模板引物引物dNTPMg2+Taq DNA聚合酶聚合酶变性变性延伸延伸退火退火第20页第20页目目录录目目录录PCR在基因诊断中应用在基因诊断中应用nRT-PCRRT-PCRn荧光定量荧光定量PCRPCRn多重多重-PCR-PCRnPCR-ASOPCR-ASOnAS-PCRAS-PCRnPCR-SSCPPCR-SSCPnPCR-RFLPPCR-RFLP第21页第21页目目录录目目录录1.RT-PCR第22页第22页目目录录目目录录2.荧光定量荧光定量PCR荧光标识引物荧光标识引物第23页第23页目目录录目目录录3.多重多重PCR 多重多重PCRPCR示意图示意图 A A：普通：普通PCRPCR；B B：多重：多重PCRPCR第24页第24页目目录录目目录录4.PCR-ASON N：正常基因；：正常基因；H H：杂合子基因；：杂合子基因；M M：突变基因：突变基因ASO1ASO2NHM第25页第25页目目录录目目录录（三）（三）单链构象多态性分析单链构象多态性分析（single-strandconformationpolymorphism,SSCP）n DNA 突变造成DNA片段中碱基序列不同，变性为单链后在中性聚丙烯酰胺凝胶中构象不同（单链构象多态性），利用迁移率差异可使各种序列不同单链分离开来。第26页第26页目目录录目目录录PCR-SSCP分析原理示意分析原理示意第27页第27页目目录录目目录录正常人正常人纯合突变纯合突变杂合突变杂合突变+PCR-SSCP分析分析 第28页第28页目目录录目目录录 （四）限制性片段长度多态性分析（四）限制性片段长度多态性分析 （restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）因为DNA 变异产生新酶切位点或原有酶切位点消失，在用限制性核酸内切酶消化时产生不同长度或不同数量片段。可借助核酸分子杂交或PCR进行检测。第29页第29页目目录录目目录录设设计计适适当当扩扩增增引引物物，使使扩扩增增片片段段包包括括某某一一个个或或数数个个限限制制性性内内切切酶酶辨辨认认序序列列，在在PCR扩扩增增后后用用该该限限制制酶酶切切割割PCR产产物物，依依据据电电泳泳后后酶酶切切片段长度改变，即可作出诊断。片段长度改变，即可作出诊断。PCR-RFLP第30页第30页目目录录目目录录ABCDEFGDEFBGCAGAATTCCTTAAGEFBG C+DAEcoR限制性内切酶位点改变限制性内切酶位点改变第31页第31页目目录录目目录录（五）（五）DNA序列测定（序列测定（DNAsequencing）第32页第32页目目录录目目录录DNA序列测定原理序列测定原理(双脱氧末端终止法双脱氧末端终止法)第33页第33页目目录录目目录录左侧：正常；右侧突变左侧：正常；右侧突变 序列分析用于基因诊断研究序列分析用于基因诊断研究第34页第34页目目录录目目录录（六）生物芯片（六）生物芯片（biochips）n基因芯片（基因芯片（genechips）n蛋白质芯片蛋白质芯片(proteinchip)第35页第35页目目录录目目录录基因芯片杂交流程示意图基因芯片杂交流程示意图第36页第36页目目录录目目录录基因诊断中惯用分子生物学办法比较基因诊断中惯用分子生物学办法比较办法长处与问题处理方案核酸分子杂交核酸分子杂交结果可靠但操作繁琐结果可靠但操作繁琐选择适当探针 PCRPCR灵敏度、特异性高灵敏度、特异性高设计适当引物 SSCPSSCP操作简便、检出率不高操作简便、检出率不高选择适当片段 RFLPRFLP结果可靠但限制较多结果可靠但限制较多选择适当限制酶 DNADNA测序测序可自动化，但不宜广泛使用与与PCRPCR配合使用配合使用生物芯片生物芯片效率高，成本高，不宜广泛使用选择适当芯片第37页第37页目目录录目目录录三、三、基因诊断技术路线与办法基因诊断技术路线与办法 n直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表直接诊断：直接分析致病基因分子结构及表示是否异常示是否异常n间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因间接诊断：利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析进行连锁分析 依据对致病基因或相关基因理解程度决定依据对致病基因或相关基因理解程度决定基因诊断技术路径选择。基因诊断技术路径选择。第38页第38页目目录录目目录录（一）直接诊断路径（一）直接诊断路径 必要条件：必要条件：被检测基因改变与疾病发生有直接因果关系被检测基因改变与疾病发生有直接因果关系 被检基因正常分子结构已被拟定被检基因正常分子结构已被拟定 被检基因致病分子机制（突变位点或表示改变）已被检基因致病分子机制（突变位点或表示改变）已知知第39页第39页目目录录目目录录5/5/3/3/RFLP1.1.点突变检测点突变检测（1 1）有限制性内切酶位点改变）有限制性内切酶位点改变第40页第40页目目录录目目录录斑点杂交、反向斑点杂交斑点杂交、反向斑点杂交AS-PCR、PCR-SSCP、PCR-ASO、PCR产物直接测序产物直接测序5/5/3/3/（2 2）无限制性酶切位点改变）无限制性酶切位点改变 第41页第41页目目录录目目录录在在DNA序序列列上上有有一一段段较较长长序序列列重重新新排排布布。包包括括数数十十个个碱碱基基到到数数千千个个碱碱基基丢丢失失、插插入入、替替换换、重重复复和和倒倒位位等等，以以及及染染色色体体突突变变或或畸畸变变，包包括括染染色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。色体易位、缺失或染色三体（如唐氏综合征）等。2.2.基因重排检测基因重排检测核酸分子探针杂交与核酸分子探针杂交与PCR第42页第42页目目录录目目录录BamHIBamHI212 10 kb14 kbprobe -珠蛋白生成障碍性贫血珠蛋白生成障碍性贫血直接基因诊断直接基因诊断-珠蛋白基因不同程度缺失可引发不同类型-珠蛋白生成障碍性贫血第43页第43页目目录录目目录录 依据引物依据引物33端互补是否，设计一对与正常端互补是否，设计一对与正常或突变模板配正确特异引物或突变模板配正确特异引物等位基因特异等位基因特异PCRAS-PCR（allelespecificPCR）第44页第44页目目录录目目录录3.基因表示异常检测基因表示异常检测mRNA相对定量分析相对定量分析mRNA绝对定量分析绝对定量分析mRNA长度分析长度分析第45页第45页目目录录目目录录（二）间接诊断路径（二）间接诊断路径1.1.采用原因采用原因致病基因未知或基因结构不拟定致病基因未知或基因结构不拟定致病突变机制不清致病突变机制不清致病位点不便检测致病位点不便检测第46页第46页目目录录目目录录 DNA多态性：指群体中DNA分子存在最少两种不同类型，即个体间同一染色体相同位置上核苷酸序列存在一定差异或变异。多在进化中形成，本身并不致病，只是与一些遗传性致病基因有一定连锁关系。2.2.遗传标识遗传标识第47页第47页目目录录目目录录间接诊断：检测与致病基因连锁遗传标识间接诊断：检测与致病基因连锁遗传标识三代遗传标识：三代遗传标识：RFLP（基于核酸分子杂交技术）（基于核酸分子杂交技术）VNTR(variablenumberoftandemrepeats);STR(shorttandemrepeats)SNP(singlenucleotidepolymorphism)第48页第48页目目录录目目录录7.6kb13kb患患者者正正常常HBS间接基因诊断间接基因诊断RFLP标识连锁分析标识连锁分析Hap7.6kb13kbSouthernSouthern印迹杂交印迹杂交N H PN N：正常；：正常；H H：杂合子；：杂合子；P P：患者（纯合子）；黄色区域为探针：患者（纯合子）；黄色区域为探针第49页第49页目目录录目目录录 第二节第二节 遗传病基因诊断遗传病基因诊断Gene Diagnosis of Hereditary Diseases第50页第50页目目录录目目录录一、血红蛋白病（一、血红蛋白病（hemoglobinopathy）（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症二、血友病（二、血友病（Hemophilia）甲型血友病基因诊断甲型血友病基因诊断三、脆性三、脆性X综合征综合征第51页第51页目目录录目目录录（一）镰状细胞贫血病（一）镰状细胞贫血病一、血红蛋白病一、血红蛋白病1.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法2.HBS限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析3.HBSPCR-RFLP分析分析第52页第52页目目录录目目录录n正常（正常（N）ASO探针：探针：5-ACTCCTGAGGAGAAGTCTGC-3n突变（突变（M）ASO探针：探针：5-ACTCCTGTGGAGGAAGTCTGC-31.镰状红细胞贫血患者基因诊断镰状红细胞贫血患者基因诊断ASO杂交法杂交法第53页第53页目目录录目目录录斑点杂交结果斑点杂交结果 N N：正常；：正常；M M突变突变镰状红细胞贫血患者镰状红细胞贫血患者ASO杂交法检测杂交法检测N-ASOM-ASO正常正常 突变突变 突变突变纯合子纯合子 杂合子杂合子 纯合子纯合子第54页第54页53正常基因正常基因1.15kb(CCT GAG G)53突变基因突变基因1.35kb(CCT GTG G)镰状红细胞贫病限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫病限制性内切酶谱分析Mst酶切位点酶切位点（CCTNAGG）2.HBS限制性内切酶谱分析限制性内切酶谱分析目目录录第55页第55页0.2kb1.15kb1.35kb正常人正常人突变携带者突变携带者患者患者镰状红细胞贫血病限制性内切酶谱分析镰状红细胞贫血病限制性内切酶谱分析目目录录第56页第56页目目录录目目录录3.HBSPCR-RFLP分析分析 正常人扩增产物经正常人扩增产物经 MstMst 消化可生成消化可生成54bp54bp和和56bp56bp两个片段，而镰状细胞两个片段，而镰状细胞贫血症患者贫血症患者DNADNA片段不被酶切，仍为片段不被酶切，仍为110bp110bp，杂合子可见三条带，杂合子可见三条带正常人正常人杂合体杂合体患者患者Marker第57页第57页目目录录目目录录1.PCR-RFLP分析分析-珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子珠蛋白生成障碍性贫血症基因密码子17突变检测突变检测M：pBR322DNA/MspI;1:未酶解片段；未酶解片段；2：bA/bA；3：bA/bT；4：bT/bT注：由于注：由于54 bp、114bp、72bp片段及分子量原则中低于片段及分子量原则中低于200bp片段太小，在片段太小，在0.8琼脂糖凝胶中不易被观测到琼脂糖凝胶中不易被观测到（二）（二）-珠蛋白生成障碍性贫血症珠蛋白生成障碍性贫血症第58页第58页目目录录目目录录-珠蛋白生成障碍性贫血症反向斑点杂交分析珠蛋白生成障碍性贫血症反向斑点杂交分析2.2.反向斑点杂交反向斑点杂交第59页第59页目目录录目目录录二、血友病（二、血友病（Hemophilia）n甲甲 型型 血血 友友 病病 是是 由由 于于 血血 浆浆 凝凝 血血 因因 子子VIII（FVIII）缺点造成。）缺点造成。n甲甲型型血血友友病病基基因因突突变变类类型型已已有有300余余种种，其其中中点点突突变变占占174种种；另另有有部部分分患患者者是是由由于于缺缺失或插入突变或内含子失或插入突变或内含子22基因倒位所致。基因倒位所致。第60页第60页目目录录目目录录1.FVIII基因倒位基因倒位DNA印迹分析印迹分析将将基基因因组组DNA用用NcoI，DraI或或BclI等等内内切切酶酶（酶酶切切位位点点位位于于互互换换点点两两侧侧）消消化化，用用特特异异探探针针进进行行杂杂交交分分析析，正正常常人人表表现现为为21.5kb、14kb和和16kb三三种种类类型型。I型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、17.5和和14kb三三种种类类型型；型型倒倒位位患患者者表表现现为为20、16和和15.5kb三三种种带带型型。在在一一些重型甲型血友病家系中尚有其它异常带型出现。些重型甲型血友病家系中尚有其它异常带型出现。第61页第61页目目录录目目录录2.FVIII基因突变检测基因突变检测（1）依赖于）依赖于FVIII基因内或旁侧多态性标识连基因内或旁侧多态性标识连锁分析锁分析（2）RFLP连锁分析连锁分析（3）VNTR分析分析（4）短串联重复序列（）短串联重复序列（STR）连锁分析）连锁分析第62页第62页目目录录目目录录三、脆性三、脆性X综合征综合征n脆性脆性X智力低下基因智力低下基因1（FMR1）5非翻译区遗传不稳非翻译区遗传不稳定定(CGG)n三核苷酸重复序列异常扩增以及相邻三核苷酸重复序列异常扩增以及相邻CpG岛岛异常甲基化。异常甲基化。n正常人中约为正常人中约为850拷贝。拷贝。n男性和女性携带者增多到男性和女性携带者增多到52200拷贝，相邻拷贝，相邻CpG岛未岛未被甲基化，称为前突变（被甲基化，称为前突变（premutation）。）。n男性患者和脆性部位高表示女性中，达到男性患者和脆性部位高表示女性中，达到2001000拷拷贝，相邻贝，相邻CpG岛也被甲基化，称为全突变（岛也被甲基化，称为全突变（fullmutation）。）。n全突变可关闭相邻全突变可关闭相邻FMR1基因表示，基因表示，FMR1mRNA在几在几乎所有患者不表示或只有低表示，从而出现临床症状。乎所有患者不表示或只有低表示，从而出现临床症状。第63页第63页目目录录目目录录脆性脆性X综合征惯用基因诊断办法综合征惯用基因诊断办法1PCR-ASO2DNA连锁分析连锁分析3Souhern印迹杂交法印迹杂交法4PCR扩增扩增第64页第64页 第三节第三节 传染病基因诊断传染病基因诊断 Gene Diagnosis of Infectious Diseases目目录录第65页第65页 一、病毒性疾病一、病毒性疾病n甲型肝炎病毒（甲型肝炎病毒（HAV）HAV系系RNA病病毒毒，利利用用RT-PCR技技术术可可从从粪粪便便中检测出甲型肝炎病毒基因组中检测出甲型肝炎病毒基因组RNA。n乙型肝炎病毒（乙型肝炎病毒（HBV）设设计计保保守守区区序序列列引引物物，扩扩增增各各型型HBVDNA片片段段；设设计计位位于于可可变变区区引引物物扩扩增增某某一一亚亚型型HBVDNA，以便分型。以便分型。n丙型肝炎病毒（丙型肝炎病毒（HCV）HCV为为正正链链RNA病病毒毒，先先反反转转录录成成cDNA，再再进行巢式进行巢式PCR检测检测HCV。目目录录第66页第66页目目录录目目录录二、细菌引起疾病二、细菌引起疾病n结核分枝杆菌结核分枝杆菌先先设设计计一一对对特特异异性性引引物物，用用PCR技技术术扩扩增增出出一一383bp序序列列，再再用用探探针针杂交，灵敏度可达到杂交，灵敏度可达到100个细菌水平。个细菌水平。n幽门螺杆菌（幽门螺杆菌（HP）主主要要采采用用PCR技技术术：检检测测HP染染色色体体DNA特特异异片片段段；检检测测HP尿尿素素酶酶A基因；基因；用用PCR-RFLP判别判别HP菌株。菌株。第67页第67页目目录录目目录录三、寄生虫及衣原体感染三、寄生虫及衣原体感染n疟原虫疟原虫n卡氏肺孢子虫卡氏肺孢子虫n衣原体感染衣原体感染诊断办法：核酸杂交和诊断办法：核酸杂交和PCR技术技术第68页第68页目目录录目目录录第四节第四节 肿瘤基因诊断肿瘤基因诊断Gene Diagnosis of Malignant Tumors第69页第69页目目录录目目录录一、原癌基因与抑癌基因检测一、原癌基因与抑癌基因检测 二、常见肿瘤基因诊断二、常见肿瘤基因诊断 乳腺癌乳腺癌 结肠癌结肠癌 第70页第70页目目录录目目录录一、原癌基因与抑癌基因检测一、原癌基因与抑癌基因检测1原癌基因检测原癌基因检测ras基基因因家家族族由由H-ras、K-ras和和N-ras构构成成。最最常常见见突变是第突变是第12、13、59或第或第61位密码子点突变。位密码子点突变。胰胰腺腺癌癌、结结肠肠癌癌、肺肺癌癌以以K-ras突突变变为为主主，如如第第12位位密密码码子子突突变变，由由编编码码甘甘氨氨酸酸GGT突突变变为为TGT、GTT或或GAT，少数突变为，少数突变为GCT。急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病等以N-ras突变为主；泌尿系统肿瘤则以突变为主；泌尿系统肿瘤则以H-ras突变为主。突变为主。第71页第71页目目录录目目录录PCR及及PCR-SSCP分分析析：扩扩增增ras 基基因因第第12位位密密码码子子点点突突变变部部位位，再再用用SSCP技技术术进进行行分分析，或者直接测序拟定患者析，或者直接测序拟定患者ras原癌基因点突变。原癌基因点突变。核苷酸杂交技术（如核苷酸杂交技术（如ASO）：）：检测检测ras基因基因第第12位密码子点突变。位密码子点突变。2.ras原癌基因突变惯用检测办法原癌基因突变惯用检测办法第72页第72页目目录录目目录录3抑癌基因抑癌基因p53检测检测np53基基因因以以密密码码子子第第175位位、第第248位位、第第249位位、第第273位位及及第第282位位点点突突变变率率最最高高。在在结结直直肠肠癌癌、乳乳腺腺癌癌、小小细细胞胞肺肺癌癌，都都可可见见异异常常p53基基因因蛋蛋白。白。np53基因诊断办法有基因诊断办法有（1）PCR-SSCP分析技术分析技术（2）DNA序列分析序列分析（3）PCR-RFLP分析分析第73页第73页目目录录目目录录（一）乳腺癌（一）乳腺癌1乳腺癌常见基因变异乳腺癌常见基因变异5%10%乳乳腺腺癌癌患患者者有有家家族族遗遗传传性性。乳乳腺腺癌癌高高危危家家族族中中常常有有抑抑癌癌基基因因BRCA基基因因（breastcancergene）突变。）突变。BRAC1突突变变易易致致乳乳腺腺癌癌。突突变变分分布布于于整整个个编编码码序序列列，没没有有明明显显突突变变簇簇或或突突变变热热点点。70%缺缺失失或或插插入入造造成成编编码码序序列列框框移移和和翻翻译译提提前前终终止止。BRCA1在在N端端二二分分之之一一部部位位截截短短，与与乳乳腺腺癌癌和和卵卵巢巢癌癌高高风风险险相关；而在相关；而在C端截短则主要与乳腺癌高危相关。端截短则主要与乳腺癌高危相关。BRCA2基基因因在在30%40%散散发发性性乳乳腺腺癌癌有有杂杂合合性缺失（性缺失（LOH）。突变提升乳腺癌易感性。）。突变提升乳腺癌易感性。二、常见肿瘤基因诊断二、常见肿瘤基因诊断第74页第74页目目录录目目录录（1）PCR法检测法检测BRCA1基因突变基因突变（2）荧光原位杂交（）荧光原位杂交（FISH）检测）检测BRCA2基基因扩增因扩增2乳腺癌基因诊断办法乳腺癌基因诊断办法第75页第75页目目录录目目录录（二）结肠癌（二）结肠癌n 1.结肠癌常见基因变异n 在癌发展过程不同阶段发生不同基因突变。n APC（adenomatous polyposis coli）是结肠癌发生过程中第一个突变基因。K-ras原癌基因突变也是结肠癌形成早期事件。n DCC（deletion of colorectal cancer）基因失活是结肠癌发展晚期事件。抑癌基因DPC4和MADR2也可能会因18q等位基因丢失而失活。n p53基因突变是结肠癌发展过程晚期现象。n DNA修复基因也与结肠癌相关。如hMSH2、hMLH1、hPMS1或hPMS2基因突变所致DNA错配修复缺点与遗传性非息肉性结肠癌发生相关。二、常见肿瘤基因诊断二、常见肿瘤基因诊断第76页第76页目目录录目目录录（1）PCR-SSCP法：法：对腺瘤样息肉病人对腺瘤样息肉病人APC基基因因PCR-SSCP技术进行分析。技术进行分析。（2）异源双链）异源双链PCR法：法：检测检测APC基因变异。基因变异。（3）蛋白质免疫印迹法：）蛋白质免疫印迹法：检测因基因突变而缩检测因基因突变而缩短了短了APC蛋白。蛋白。2结肠癌基因诊断办法结肠癌基因诊断办法第77页第77页第五节第五节 基因诊断在法医学上应用基因诊断在法医学上应用Application of Gene Diagnosis in Forensic Medicine目目录录第78页第78页目目录录目目录录n重复序列以各自关键序列（重复单元）首尾相连重复序列以各自关键序列（重复单元）首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态性。群中存在变异，形成多态性。n串联重复序列散在分布于染色体上。串联重复序列散在分布于染色体上。n重复单位重复单位625bp长，称为小卫星长，称为小卫星DNA。重复单位重复单位26bp长，如（长，如（TA）n,(CGG)n等，等，称为微卫星称为微卫星DNA。一、一、DNADNA指纹与多态性遗传标识指纹与多态性遗传标识第79页第79页目目录录目目录录n 可变数目串联重复序列(VNTR)n n 人类染色体上小卫星DNA高度可变区（HVR）是由头尾相连串联重复序列（tandem repeat，TR）组成，TR关键序列同源性很高，等位HVR长度因为TR重复次数不同而有很大差异，具高度多态性。第80页第80页目目录录目目录录DNA长度多态除可用长度多态除可用Southern印迹杂交法印迹杂交法检测外，还能够通过检测外，还能够通过PCR扩增后电泳来检出。扩增后电泳来检出。扩增片段长度多态扩增片段长度多态（amplifiedfragmentlengthpolymorphism,Amp-FLP）第81页第81页1985年年，英英国国遗遗传传学学家家Jeffeys等等人人用用TR关关键键序序列列为为探探针针进进行行RFLP分分析析时时，检检测测到到许许多多HVR，并并产产生生相相应应图图谱谱，所所得得图图谱谱含含有有高高度度个个体体特特异异性性，达达到到了了如如同同人人类类指指纹纹那那样样高高度度专专一一性性，因因此此称称其其为为DNA指指纹纹图图谱谱（DNAfingerprinting）。）。Alec John JeffreysOxford,United Kingdom 目目录录第82页第82页目目录录目目录录人类人类DNADNA指纹图指纹图第83页第83页目目录录目目录录二、二、DNA指纹与法医学诊断指纹与法医学诊断n个个体体辨辨认认和和亲亲子子鉴鉴定定：DNA指指纹纹技技术术是是从从基基因因水水平平检检测测DNA高高度度多多态态性性，个个体体辨辨认认率率高。高。n以以往往在在刑刑事事案案件件法法医医学学鉴鉴定定中中应应用用是是血血型型、血血清清蛋蛋白白型型、红红细细胞胞酶酶型型和和HLA分分型型，个个体体分分辨辨能能力力不不够够，只只能能排排除除，不不能能做做到到统统一一认认证。证。第84页第84页目目录录目目录录法医案检中基因诊断技术法医案检中基因诊断技术nVNTR（可变数目串联重复序列（可变数目串联重复序列/小卫星）核小卫星）核酸分子杂交分析酸分子杂交分析nSTR（短串联重复序列（短串联重复序列/微卫星）微卫星）PCR分析分析nSNP基因芯片检测基因芯片检测第85页第85页目目录录目目录录1单位点探针检测及单位点探针检测及PI值计算值计算父父权权指指数数（PaternityIndex，PI）值值、父父权权相相对对指指数数或或亲亲子子关关系系概概率率值值计计算算办办法法基基本本一一致。致。PI值值表表示示争争议议父父作作为为亲亲父父比比随随机机男男人人作作为为亲亲父父也也许许性性大大多多少少倍倍，PI值值不不小小于于1表表示示倾倾向向必必定定父父子子关关系系，数数值值越越大大，也也许许性性越越大大；等等于于0时表示排除父子关系时表示排除父子关系。第86页第86页目目录录目目录录2DNA指纹图与亲权鉴定指纹图与亲权鉴定多多位位点点VNTR系系统统和和DNA指指纹纹图图电电泳泳分分离离后后片片段段数数目目较较多多，各各等等位位基基因因频频率率分分布布计计算算复复杂杂，进进行行亲亲权权鉴鉴定定和和个个体体辨辨认认时时匹匹配配概概率率计计算算影影响响原原因因较较多多，当当前前尚尚无无一一个公认最合理计算办法。个公认最合理计算办法。当当前前处处理理亲亲权权纠纠纷纷最最简简朴朴办办法法是是先先在在孩孩子子DNA指指纹纹图图中中找找出出非非母母片片段段并并计计数数为为P，然然后后分分析析争争议议父父DNA指指纹纹图图，看看P条条非非母母带带在争议父中出现多少条。在争议父中出现多少条。第87页第87页目目录录目目录录亲权鉴定与亲权鉴定与DNA指纹图指纹图由此图可推断出：由此图可推断出：A和和C是亲生女儿；是亲生女儿；B为妻子和其前夫所生；为妻子和其前夫所生；D为养女。为养女。第88页第88页第六节第六节 基因治疗概念及策略基因治疗概念及策略 Concept and Strategy of Gene Therapy目目录录第89页第89页n基因治疗：基因治疗：指将目的基因通过基因转移指将目的基因通过基因转移技术（病毒载体介导或者非病毒载体介技术（病毒载体介导或者非病毒载体介导基因转移技术）导入靶细胞内，目的导基因转移技术）导入靶细胞内，目的基因表示产物对疾病起治疗作用。基因表示产物对疾病起治疗作用。目目录录第90页第90页 狭义基因治疗：狭义基因治疗：指目的基因导入靶细胞后与宿指目的基因导入靶细胞后与宿主细胞内基因发生整合、成为宿主基因组一部分，主细胞内基因发生整合、成为宿主基因组一部分，目的基因表示产物起治疗疾病作用。目的基因表示产物起治疗疾病作用。广义基因治疗：广义基因治疗：外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因表示产物以外源正常基因导入病变细胞，产生正常基因表示产物以补充缺失或失去正常功效蛋白质；补充缺失或失去正常功效蛋白质；采用适当技术克制细胞内过度表示基因；采用适当技术克制细胞内过度表示基因；将特定基因导入非病变细胞，在体内表示特定产物；将特定基因导入非病变细胞，在体内表示特定产物；向功效异常细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在向功效异常细胞（肿瘤细胞）中导入该细胞中本来不存在基因（如自杀基因），利用这些基因表示产物达到治疗疾病基因（如自杀基因），利用这些基因表示产物达到治疗疾病目的。目的。目目录录第91页第91页本节内容提纲本节内容提纲 一、基因治疗策略一、基因治疗策略二、基因转移技术二、基因转移技术三、基因干预三、基因干预四、基因治疗应用研究四、基因治疗应用研究五、基因治疗前景与问题五、基因治疗前景与问题目目录录第92页第92页目目录录基因治疗分类基因治疗分类体细胞体细胞(somaticcell)基基因治疗因治疗生殖细胞生殖细胞(germline)基基因治疗因治疗v只限于某一体细胞基只限于某一体细胞基因改变因改变v只限于某个体当代只限于某个体当代v对缺点生殖细胞进行对缺点生殖细胞进行矫正矫正v当代及子代当代及子代第93页第93页目目录录目目录录 一、基因治疗策略一、基因治疗策略第94页第94页目目录录 （一）基因置换（一）基因置换（genereplacement）定定义义：指指将将特特定定目目的的基基因因导导入入特特定定细细胞胞，通通过过定定位位重重组组，导导入入正正常常基基因因，以以置置换换基基因因组组内内原原有有缺缺点基因。点基因。目的：目的：将缺点基因异常序列进行桥正。将缺点基因异常序列进行桥正。对对缺缺点点基基因因缺缺点点部部位位进进行行准准确确原原位位修修复复，不不涉及基因组任何改变。涉及基因组任何改变。第95页第95页目目录录n定定向向整整合合条条件件:转转导导基基因因载载体体与与基基因因组组DNA含含有有相相同同序序列列。带带有有目目的的基基因因载载体体就就能能找找到到同同源重组位点，进行部分基因序列互换。源重组位点，进行部分基因序列互换。n基基因因同同源源重重组组技技术术又又称称为为基基因因打打靶靶(genetargeting）n细胞内基因同源重组发生率很低。细胞内基因同源重组发生率很低。基因同源重组技术基因同源重组技术第96页第96页目目录录（二）（二）基因添加基因添加（geneaugmentation）定定义义:通通过过导导入入外外源源基基因因使使靶靶细细胞胞表表示示其其本本身身 不表示基因。不表示基因。类型类型:n在在有有缺缺点点基基因因细细胞胞中中导导入入相相应应正正常常基基因因，而而细细胞胞内内缺缺点点基基因因并并未未除除去去，通通过过导导入入正正常常基基因表示产物，补偿缺点基因功效；因表示产物，补偿缺点基因功效；n向向靶靶细细胞胞中中导导入入靶靶细细胞胞本本来来不不表表示示基基因因，利利用其表示产物达到治疗疾病目的。用其表示产物达到治疗疾病目的。第97页第97页目目录录（三）基因干预（三）基因干预（geneinterference）定义：定义：采采用用特特定定方方式式克克制制某某个个基基因因表表示示，或或者者通通过过破破坏坏某某个个基基因因结结构构而而使使之之不不能能表表示示，以以达到治疗疾病目的。达到治疗疾病目的。第98页第98页目目录录n定定义义：将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码酶酶能能使使无无毒毒性性药药物物前前体体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应，从而达到清除肿瘤
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