生物大分子的制备公开课一等奖优质课大赛微课获奖课件.pptx

生物大分子制备技术生物大分子制备技术 蛋白质、核酸分离和提纯蛋白质、核酸分离和提纯第1页第1页 硕士物大分子，首先要得到高度纯化并含有生物活性目标物质。基本原理不外乎两方面：一是利用混合物中几个组分分派率差异，把它们分派到可用机械方法分离两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，经过物理力场作用使各组分分派于不同区域而达到分离目标，如电泳、超速离心、超滤等。第2页第2页 而在所有这些办法应用中必须注意保留生物大而在所有这些办法应用中必须注意保留生物大分子分子完整性完整性，预防，预防酸、碱、高温酸、碱、高温及及猛烈机械作用猛烈机械作用而而造成所提物质造成所提物质生物活性丧失。生物活性丧失。生物大分子制备普通分为下列四个阶段：生物大分子制备普通分为下列四个阶段：选择选择材料和预处理材料和预处理；细胞细胞破碎及细胞器分离破碎及细胞器分离；提取和纯化提取和纯化；浓缩浓缩干燥和保留干燥和保留。第3页第3页 第一节第一节 选择材料及预处理选择材料及预处理 选材：选材：微生物、植物和动物都可作为制备生物大微生物、植物和动物都可作为制备生物大分子原材料，所选取材料主要依据试验目的来确分子原材料，所选取材料主要依据试验目的来确定。定。（一）微生物（一）微生物 微生物应当注意它微生物应当注意它生长期生长期，在微生物，在微生物对数生对数生长期长期，酶和核酸酶和核酸含量较高，能够取得高产量。含量较高，能够取得高产量。第4页第4页以微生物为材料时有两种情况以微生物为材料时有两种情况 1 1、利用微生物菌体、利用微生物菌体分泌分泌到培养基中代谢产到培养基中代谢产物和胞外酶等；物和胞外酶等；2 2、利用、利用菌体菌体含有生化物质，如蛋白质、核含有生化物质，如蛋白质、核酸和胞内酶等。酸和胞内酶等。第5页第5页（二）植物材料 植物材料必须经过去壳、脱脂并注意植物品种和生长发育情况不同，其中所含生物大分子量改变很大，另外与季节性关系密切。第6页第6页（三）动物组织（三）动物组织 动物组织用有效成份含量丰富动物组织用有效成份含量丰富脏器组织脏器组织为为原料，先进行原料，先进行绞碎、脱脂绞碎、脱脂等处理。另外，对等处理。另外，对于处理好材料，若不马上进行试验，应冷冻于处理好材料，若不马上进行试验，应冷冻保留。对于易分解生物大分子应选取新鲜材保留。对于易分解生物大分子应选取新鲜材料制备。料制备。第7页第7页 第二节第二节 细胞破碎及细胞器分离细胞破碎及细胞器分离一、细胞破碎一、细胞破碎 1 1、高速组织捣碎机捣碎、高速组织捣碎机捣碎 此法适合用于动物内脏组织、植物肉质种子等。此法适合用于动物内脏组织、植物肉质种子等。第8页第8页 2.2.玻璃匀浆器匀浆玻璃匀浆器匀浆 此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为此法对细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，合用量少动物内脏组织。高，合用量少动物内脏组织。第9页第9页3.3.重复冻融法重复冻融法 将细胞在将细胞在2020下列冰冻，室温融解，重下列冰冻，室温融解，重复几次，由于细胞内复几次，由于细胞内冰粒冰粒形成和剩余细胞液形成和剩余细胞液盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。4.4.化学处理法化学处理法 有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十有些动物细胞，如：肿瘤细胞可采用十二烷基硫酸钠（二烷基硫酸钠（SDSSDS）、去氧胆酸钠等使细）、去氧胆酸钠等使细胞膜破坏。假如细胞壁较厚，可采用胞膜破坏。假如细胞壁较厚，可采用溶菌酶溶菌酶处理效果更加好。处理效果更加好。第10页第10页5 5、超声波处理、超声波处理 用一定功率超声波处理细胞悬液，使细胞急用一定功率超声波处理细胞悬液，使细胞急剧振荡破碎。此法多适合用于剧振荡破碎。此法多适合用于微生物材料微生物材料，用，用大大肠杆菌肠杆菌制备各种酶，常选取菌体质量浓度为制备各种酶，常选取菌体质量浓度为5050100mg/ml 100mg/ml，在，在1010100KHz100KHz频率下处理频率下处理101015min 15min。此法缺点是在处理过程中会产生大量热能，应。此法缺点是在处理过程中会产生大量热能，应采用相应降温办法。对超声波敏感酶和核酸应慎采用相应降温办法。对超声波敏感酶和核酸应慎用。用。第11页第11页细胞器名称胞器名称 主要蛋白和主要蛋白和酶 核核 酸酸细胞核胞核 精蛋白、精蛋白、组蛋白、核酸合成蛋白、核酸合成酶系系 所有所有DNA和和RNA10线粒体粒体 电子子传递、氧化磷酸化、三、氧化磷酸化、三羧酸循酸循环、微量微量DNA，总RNA 脂肪酸氧化、氨基酸氧化等脂肪酸氧化、氨基酸氧化等 510 内内质网网（微粒体）微粒体）蛋白蛋白质合成合成酶系、系、羟化化酶类 总RNA50溶溶酶体体 水解水解酶系（核酸系（核酸酶、磷酸、磷酸酯酶、组织蛋白蛋白酶及糖苷及糖苷酶）高高尔基体基体 糖苷糖苷转移移酶、粘多糖、粘多糖类固醇合成固醇合成酶细胞膜胞膜 载体与受体蛋白、特异抗体、体与受体蛋白、特异抗体、ATP酶、环腺苷腺苷酶、葡萄糖、葡萄糖6磷酸磷酸酶细胞液胞液 嘧啶与与嘌呤代呤代谢、氨基酸合成、氨基酸合成酶系、系、RNA（主要是（主要是t RNA 可溶性蛋白可溶性蛋白类 占占50）二、细胞器分离 各类生物大分子在细胞内分布是不同。普通采取差速离心法。第12页第12页 第三节第三节 提取和纯化提取和纯化 提取是将通过处理或破碎细胞，置于一定条件提取是将通过处理或破碎细胞，置于一定条件和溶液中让被提取生物大分子充足释放出来过程。和溶液中让被提取生物大分子充足释放出来过程。影响提取原因主要是被提取物质在影响提取原因主要是被提取物质在提取溶液中提取溶液中溶解度大小溶解度大小及及由固相扩散到液相难易程度。由固相扩散到液相难易程度。某一物某一物质在溶剂中溶解度大小与该物质分子结构及溶剂理质在溶剂中溶解度大小与该物质分子结构及溶剂理化性质相关，普通遵守相同相溶原则。化性质相关，普通遵守相同相溶原则。第13页第13页 一、蛋白质提取（包括酶）一、蛋白质提取（包括酶）、pHpH 蛋白质和酶是含有等电点两性电解质，提取液蛋白质和酶是含有等电点两性电解质，提取液pHpH应选择在应选择在偏离等电点两侧偏离等电点两侧pHpH范围内范围内。用稀酸或稀。用稀酸或稀碱提取时，应碱提取时，应预防过酸或过碱预防过酸或过碱而引起蛋白质而引起蛋白质可解离可解离基团发生改变。基团发生改变。从而造成蛋白构象不可逆改变。普从而造成蛋白构象不可逆改变。普通来说，通来说，碱性蛋白质用偏酸性提取液提取，而酸性碱性蛋白质用偏酸性提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性提取液提取。蛋白质用偏碱性提取液提取。第14页第14页 盐浓度盐浓度 稀盐溶液可增进蛋白溶解，称为盐溶作稀盐溶液可增进蛋白溶解，称为盐溶作用。用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，含有保护蛋白质不易变性长处，合，含有保护蛋白质不易变性长处，因此在因此在提取液中加入少许提取液中加入少许NaclNacl等中性盐，普通以等中性盐，普通以 0.15mol/L0.15mol/L浓度为宜。缓冲液常采用浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.02-0.05mol/L0.05mol/L磷酸盐或碳酸盐等渗盐溶液。磷酸盐或碳酸盐等渗盐溶液。第15页第15页一、蛋白质分离纯化（一）依据蛋白质溶解度不同分离方法 1.蛋白质盐析 中性盐对蛋白质溶解度有显著影响，普通在低盐浓度下伴随盐浓度升高，蛋白质溶解度增加，称为盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称为盐析。第16页第16页 血浆蛋白质分段盐析硫酸铵饱和度硫酸铵饱和度g.(100ml H2O)1 沉淀蛋白质沉淀蛋白质 20 纤维蛋白纤维蛋白 4833 r 球蛋白球蛋白 4046 a 球蛋白球蛋白 50 清蛋白清蛋白 蛋白质盐析惯用中性盐，主要有蛋白质盐析惯用中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。其中应用最多是硫酸铵，其中应用最多是硫酸铵，它长处是它长处是硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引硫酸铵分段盐析效果也比其它盐好，不易引起蛋白质变性。起蛋白质变性。第17页第17页 蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中盐除去，惯用办法是中盐除去，惯用办法是透析透析。另外也可用另外也可用葡聚糖葡聚糖凝胶凝胶G25G25或或G50G50过柱过柱办法除盐，所用时间比较短。办法除盐，所用时间比较短。第18页第18页第19页第19页2.2.等电点沉淀法等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间静电斥力最蛋白质在静电状态时颗粒之间静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质等电点小，因而溶解度也最小，各种蛋白质等电点有差别，可利用调整溶液有差别，可利用调整溶液pHpH，达到某一蛋白，达到某一蛋白质等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，质等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合使用。可与盐析法结合使用。第20页第20页3.3.有机溶剂提取法有机溶剂提取法 （破坏水化膜和中和电荷）（破坏水化膜和中和电荷）一些和脂质结合比较蛋白质和酶，它们不溶于一些和脂质结合比较蛋白质和酶，它们不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中。这种情况可用乙醇、乙醇、丙酮或丁醇等有机溶剂丙酮或丁醇等有机溶剂，它们含有较强亲脂性，但，它们含有较强亲脂性，但必须在必须在低温低温下操作。下操作。丁醇提取法：丁醇提取法：一是由于丁醇亲脂性强，溶解磷一是由于丁醇亲脂性强，溶解磷脂能力强；二是丁醇含有亲水性，在溶解度范围内脂能力强；二是丁醇含有亲水性，在溶解度范围内不会引起酶变性和失活。不会引起酶变性和失活。另外丁醇提取法另外丁醇提取法pHpH及温度及温度选择范围较广，也适合用于动植物及微生物材料。选择范围较广，也适合用于动植物及微生物材料。第21页第21页（二）依据蛋白质分子大小差别分离办法（二）依据蛋白质分子大小差别分离办法 1.1.透析及超滤法透析及超滤法 （利用蛋白质大分子性质不能透过（利用蛋白质大分子性质不能透过半透膜）半透膜）第22页第22页目目录录2.凝胶过滤法凝胶过滤法第23页第23页SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(三)依据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同pH环境中带电性质和电荷数量不同,可将其分开。1.电泳法 第24页第24页目目录录带有带有NHNH3 3+2.2.离子互换层析离子互换层析第25页第25页二、核酸提取二、核酸提取（一）（一）DNADNA提取提取1.1.组织细胞破碎后，加入组织细胞破碎后，加入0.5mol/LNacl0.5mol/LNacl溶液，离心溶液，离心去上清去上清;2.2.于沉淀中加于沉淀中加1.0molNacl/L1.0molNacl/L溶解溶解;3.3.然后用酚氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相然后用酚氯仿混合液振摇抽提。离心留取水相;4.4.加入加入2 2倍体积乙醇沉淀倍体积乙醇沉淀DNA;DNA;5.DNA5.DNA制品中少许制品中少许RNARNA可用纯可用纯RNaseRNase水解除去。水解除去。第26页第26页（二）（二）RNARNA提取提取 在提取在提取RNARNA时最要紧问题是预防时最要紧问题是预防RNaseRNase降解。降解。惯用克制办法有：惯用克制办法有：低温低温44操作；操作；所用器所用器皿高压消毒，试剂中加入皿高压消毒，试剂中加入RNaseRNase克制剂；克制剂；操作中戴操作中戴手套。手套。现在普遍通用从动物组织和培养细胞中提取完现在普遍通用从动物组织和培养细胞中提取完整总整总RNARNA办法是办法是异硫氰酸胍法异硫氰酸胍法，它有很强克制，它有很强克制RNaseRNase活性作用，使蛋白质变性效果也较好。活性作用，使蛋白质变性效果也较好。第27页第27页三、核酸纯化三、核酸纯化 核酸纯化最关键环节是清除蛋白质。核酸纯化最关键环节是清除蛋白质。通常只要用酚氯仿抽提核酸水溶液即可。通常只要用酚氯仿抽提核酸水溶液即可。四、核酸浓缩四、核酸浓缩 核酸浓缩应用最为广泛是乙醇沉淀法。核酸浓缩应用最为广泛是乙醇沉淀法。第28页第28页五、五、DNADNA、RNARNA定量定量 准确办法是紫外分光光度法。用紫外分光准确办法是紫外分光光度法。用紫外分光光度计测定光度计测定260nm 260nm 和和280mn280mn两个波长处吸光度，两个波长处吸光度，然后，然后，1A260=50ug1A260=50ugmlml双链双链DNADNA1A260=40ug1A260=40ugmlml单链单链DNADNA或或RNARNA 260nm 260nm和和280nm280nm两处读数比值（两处读数比值（A260A260A280A280），），可反应核酸纯度。可反应核酸纯度。DNADNA和和RNARNA纯品吸光度比值分纯品吸光度比值分别是别是1.81.8和和2.0 2.0。假如样品中有蛋白质或酚污。假如样品中有蛋白质或酚污染，则两者比值将明显减少。染，则两者比值将明显减少。第29页第29页 第四节第四节 浓缩、干燥及保留浓缩、干燥及保留 一、样品浓缩一、样品浓缩 为了保留和鉴定目的，往往需要进行浓缩。为了保留和鉴定目的，往往需要进行浓缩。1.1.减压加温蒸发浓缩减压加温蒸发浓缩 该办法通过减少液面压力使液体沸点减该办法通过减少液面压力使液体沸点减少，加压真空度愈高，液体沸点降愈低，蒸少，加压真空度愈高，液体沸点降愈低，蒸发愈快。此法适合用于一些不耐热生物大分发愈快。此法适合用于一些不耐热生物大分子浓缩。子浓缩。第30页第30页2.2.空气流动蒸发浓缩空气流动蒸发浓缩 空气流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层溶液，表空气流动可使液体加速蒸发，将铺成薄层溶液，表面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液面不断通过空气流。此法浓缩速度慢，不适于大量溶液浓缩。浓缩。3.3.冰冻法冰冻法 溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进入冰溶剂在低温下结成冰，盐类及生物大分子不进入冰内而留在液相中。内而留在液相中。4.4.超滤法超滤法5.5.吸取法吸取法 所用吸取剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分所用吸取剂必须与溶液不起化学反应，对生物大分子不吸附，易与溶液分开。惯用吸取剂有聚乙二醇、蔗子不吸附，易与溶液分开。惯用吸取剂有聚乙二醇、蔗糖等。糖等。第31页第31页二、干二、干 燥燥 干燥干燥(drying)(drying)是将潮湿固体、膏状物、浓缩液及液是将潮湿固体、膏状物、浓缩液及液体中水或溶剂除尽过程。体中水或溶剂除尽过程。1.1.真空干燥适合用于不耐高温，易于氧化物质干燥。真空干燥适合用于不耐高温，易于氧化物质干燥。整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干整个装置包括干燥器、冷凝器及真空泵三部分。干燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化燥器内常放一些干燥剂，如五氧化二磷、无水氯化钙等。钙等。2.2.气流干燥气流干燥 第32页第32页三、保三、保 存存 只要将干燥样品置于干燥器内（内装有干只要将干燥样品置于干燥器内（内装有干燥剂）密封，保留在燥剂）密封，保留在0 044冰箱冰箱内即可；液内即可；液态储存也有其长处，首先免去繁杂干燥过程，态储存也有其长处，首先免去繁杂干燥过程，生物大分子活性和结构破坏较少，但液态储生物大分子活性和结构破坏较少，但液态储存时应注意下列几点：存时应注意下列几点：第33页第33页1.样品不能太稀，必须浓缩到一定浓度才干封装储存，样品太稀易使生物大分子变性。2.普通需加入防腐剂和稳定剂，惯用防腐剂有甲苯、苯甲酸、氯仿、百里酚等。另外，钙、锌、硼酸等溶液对一些酶也有一定保护作用。核酸大分子普通保留在氯化钠或柠檬酸钠标准缓冲液中。3.储存温度要低，大多数在0左右冰箱保留，有则要求更低，应视不同物质而定。第34页第34页 实实 验验 碱性磷酸酶分离与纯化碱性磷酸酶分离与纯化 磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法第35页第35页酶分离和纯化酶分离和纯化基本原则：提取过程中避免酶变性而失去基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性活性目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比目的：一是把酶制剂从很大体积浓缩到比较小体积；二是把酶制剂中大量杂质蛋白较小体积；二是把酶制剂中大量杂质蛋白和其它大分子物质分离出去。和其它大分子物质分离出去。衡量指标：衡量指标：总活力回收；二是比活力提升总活力回收；二是比活力提升倍数。倍数。表示提纯过程中酶表示提纯过程中酶损失情况损失情况表示提纯办法表示提纯办法有效程度有效程度第36页第36页一、一、目的目的 1 1掌握碱性磷酸酶分离纯化试验办法。掌握碱性磷酸酶分离纯化试验办法。2 2掌握酶活性测定普通试验办法。掌握酶活性测定普通试验办法。二二.原理原理：碱性磷酸酶（碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,AKP alkaline phosphatase,AKP 或或 ALP ALP）是一个底物特异性较低，在碱性环境中能水）是一个底物特异性较低，在碱性环境中能水解各种磷酸单酯化合物酶，需要镁和锰离子为激活解各种磷酸单酯化合物酶，需要镁和锰离子为激活剂。剂。第37页第37页 本试验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分本试验采用有机溶剂沉淀法从肝匀浆液中提取分离碱性磷酸酶离碱性磷酸酶(AKP)(AKP)，依据用，依据用3030乙醇、乙醇、3333丙酮提丙酮提取时，取时，ALPALP溶于溶于3030乙醇乙醇、3333丙酮丙酮，离心后弃沉淀离心后弃沉淀以除去杂质和杂蛋白，以除去杂质和杂蛋白，再将再将ALPALP用用6060乙醇、乙醇、5050丙丙酮提取时，酮提取时，ALPALP不溶不溶于于6060乙醇、乙醇、5050丙酮，丙酮，离心后离心后弃上清除去杂质和杂蛋白，取得较纯碱性磷酸酶。弃上清除去杂质和杂蛋白，取得较纯碱性磷酸酶。第38页第38页 ALPALP活性测定采用活性测定采用磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法 第39页第39页 碱性磷酸酶酶蛋白含量碱性磷酸酶酶蛋白含量测定采用测定采用 Marion M Marion M bradford bradford 法法，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，利用考马斯亮蓝与蛋白着色，(考马考马斯亮蓝斯亮蓝G-250G-250在游离状态下呈红色，最大光吸取在在游离状态下呈红色，最大光吸取在488nm488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色色素结合物在素结合物在595nm595nm波长下有最大光吸取。其光吸取值波长下有最大光吸取。其光吸取值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质定量测定与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质定量测定。)在一定程度范围内蛋白质含量与颜色深浅成正比，在一定程度范围内蛋白质含量与颜色深浅成正比，最后依据测得酶蛋白毫克数及酶活性单位数计算出最后依据测得酶蛋白毫克数及酶活性单位数计算出比活性，鉴定酶纯化程度。比活性，鉴定酶纯化程度。第40页第40页 三、操三、操 作作 （一）分离纯化（一）分离纯化1.1.匀浆匀浆 称取新鲜兔肝称取新鲜兔肝2g2g，剪碎后置于玻璃匀浆器中，剪碎后置于玻璃匀浆器中加入加入0.01mol/L0.01mol/L醋酸钠醋酸钠(低渗破膜作用低渗破膜作用)及及醋酸镁醋酸镁(有保有保护和稳定护和稳定AKPAKP作用作用)混合液混合液6ml6ml，在电动匀浆器中匀浆，在电动匀浆器中匀浆3 34min 4min，匀浆液倒入刻度离心管中，统计体积，匀浆液倒入刻度离心管中，统计体积A A液液。取取0.1ml0.1ml与另一试管中，加与另一试管中，加4.9ml pH 8.8 Tris4.9ml pH 8.8 Tris醋酸镁醋酸镁缓冲液稀释缓冲液稀释,作为作为A A液待测比活性。液待测比活性。2.2.提取提取 加加2ml2ml正丁醇正丁醇(可使部分杂蛋白变性，释出可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以清除杂蛋白膜中酶，过滤后，以清除杂蛋白)于于A A液中液中,用玻棒充用玻棒充足搅拌足搅拌2min,2min,室温放置室温放置30min,30min,单层纱布过滤单层纱布过滤,滤液置滤液置于刻度离心管中。于刻度离心管中。第41页第41页 3.3.丙酮沉淀丙酮沉淀 滤液中加入等体积冷丙酮滤液中加入等体积冷丙酮,立刻混匀后离心立刻混匀后离心3,000r/5min3,000r/5min。离心后将上清液倒弃离心后将上清液倒弃,在在沉淀沉淀中加入中加入0.5mol/L0.5mol/L醋酸镁醋酸镁4ml,4ml,用玻棒充足搅拌使其溶解用玻棒充足搅拌使其溶解,同同时统计悬液体积时统计悬液体积(B B液液)。取取0.1ml0.1ml于另一试管中于另一试管中,加加入入4.9ml pH 8.8 Tris4.9ml pH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液混匀醋酸镁缓冲液混匀,作为作为B B液液待测比活性待测比活性。第42页第42页4.4.分步分离分步分离 于混悬悬液中加入冷于混悬悬液中加入冷95%95%乙醇乙醇,使乙醇最使乙醇最后体积分数达后体积分数达3030,混匀后马上离心混匀后马上离心 r/min r/min,5min,5min,离心后将上清液倒入另一离心管中离心后将上清液倒入另一离心管中,弃弃沉淀沉淀 ；第43页第43页 在上清液中加入冷在上清液中加入冷95%95%乙醇乙醇,使乙醇最后体积分数使乙醇最后体积分数达到达到60%60%,混匀后离心混匀后离心3000r/min,5min,3000r/min,5min,将上清液倒将上清液倒弃弃,于于沉淀沉淀中加入中加入0.01mol/L 0.01mol/L 醋酸镁及醋酸钠混合液醋酸镁及醋酸钠混合液4ml,4ml,充足搅拌充足搅拌,使其完全混悬使其完全混悬。第44页第44页5.5.重复上述操作重复上述操作 在悬液中加入冷在悬液中加入冷95%95%乙醇乙醇,使乙醇最后体积分数使乙醇最后体积分数达达3030,混匀后马上离心混匀后马上离心 r/min,5min,r/min,5min,离心后将离心后将上清液倒入另一离心管中上清液倒入另一离心管中,弃沉淀弃沉淀 ；在上清液中加；在上清液中加入冷入冷95%95%乙醇乙醇,使乙醇最后体积分数达到使乙醇最后体积分数达到60%,60%,混匀混匀后离心后离心3000r/min,5min,3000r/min,5min,将上清液倒弃将上清液倒弃,于于沉淀沉淀中中加入加入0.5mol/L 0.5mol/L 醋酸镁醋酸镁3ml3ml充足混悬充足混悬,并统计体积并统计体积(C C液液),),取取0.1ml0.1ml加入另一试管中加入另一试管中,加加pH 8.8 TrispH 8.8 Tris醋酸镁缓醋酸镁缓冲液冲液0.9ml0.9ml混匀混匀,作为作为C C液液待测比活性待测比活性。第45页第45页6.6.其余悬液中加入丙酮其余悬液中加入丙酮,使丙酮终体积分数为使丙酮终体积分数为33%,33%,混混于后离心于后离心 r/min,5min,r/min,5min,弃沉淀弃沉淀,于于上清上清液中加入冷液中加入冷丙酮丙酮,使丙酮终体积分数达到使丙酮终体积分数达到50%50%。混匀后离心混匀后离心3000r/min,15min,3000r/min,15min,离心后弃上清液离心后弃上清液,于于沉淀沉淀中加入中加入pH 8.8 TrispH 8.8 Tris醋酸镁缓冲液醋酸镁缓冲液5ml,5ml,混匀后离心混匀后离心3000r/min,5min,3000r/min,5min,上清液即为纯化酶液上清液即为纯化酶液,作为作为D D液液用于比活性用于比活性.第46页第46页(二二)碱性磷酸酶活性测定碱性磷酸酶活性测定(磷酸苯二钠法磷酸苯二钠法)1.取试管取试管6只编号只编号,按下表操作按下表操作管号管号 A B C D 原则原则 空白空白各阶段稀释酶液各阶段稀释酶液/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 酶原则液酶原则液(0.1mg/ml)/ml 0.1pH 8.8 Tris醋酸镁醋酸镁 缓冲液缓冲液/ml 0.1预热至预热至37复合底物复合底物液液/ml 3.0 3.0 3.0 3,0 3.0 3.0 马上混匀马上混匀 37 37水浴中保温水浴中保温15min,15min,保温结束后保温结束后,各管加入各管加入0.5%0.5%铁氰化钾铁氰化钾2ml2ml终止反应终止反应。静置静置1515分钟分钟,显色后显色后510nm510nm波长比色波长比色。第47页第47页2.2.酶活性单位计算酶活性单位计算:37 37保温保温15min,15min,产生产生1mg1mg酚酚,为为1 1个酶活性单位个酶活性单位.故故每毫升酶液中酶活性单位为每毫升酶液中酶活性单位为:（三）碱性磷酸酶酶蛋白含量测定三）碱性磷酸酶酶蛋白含量测定1.取试管取试管6只编号只编号,按下表操作按下表操作:第48页第48页 碱性磷酸酶酶蛋白含量测定碱性磷酸酶酶蛋白含量测定 试试 剂剂 A液液 B液液 C液液 D液液 对照对照 原则原则 阶段酶液阶段酶液/ml 0.1 0.1 0.1 0.1 pH8.8Tris醋醋 酸镁缓冲液酸镁缓冲液 0.1 蛋白质原则液蛋白质原则液1mg/ml 0.1 显色液显色液/ml 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 各管充足混匀各管充足混匀,2min以后在波长以后在波长595nm处比色处比色.2.蛋白含量计算蛋白含量计算:公式公式:A测测 1 X 原则管蛋白含量原则管蛋白含量 X X 稀释倍数蛋白含量稀释倍数蛋白含量 A标标 0.1 第49页第49页(三三)比活性计算比活性计算酶比活力酶比活力 代表酶纯度，比活力代表酶纯度，比活力用每用每mgmg蛋白质所含酶活力单位蛋白质所含酶活力单位数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶纯度愈数表示，对同一酶来说，比活力愈大，表示酶纯度愈高。用高。用U/mgU/mg蛋白、蛋白、Kat/mg Kat/mg蛋白表示。蛋白表示。比活力比活力=每毫升样品酶活性单位每毫升样品酶活性单位/每毫升样品蛋白毫克数每毫升样品蛋白毫克数 总活力总活力U U=酶活性单位酶活性单位总体积总体积 第50页第50页酶纯化倍数：酶纯化倍数：每次比活力每次比活力第一次比活力第一次比活力酶回收率：酶回收率：100%(四）将试验结果填入表格，计算出各阶段四）将试验结果填入表格，计算出各阶段ALP 纯化倍数及得率纯化倍数及得率第51页第51页分离阶段分离阶段 蛋白质（蛋白质（mg/ml）酶活性（酶活性（Uml）比活性（比活性（Uml）纯化倍数纯化倍数 得率得率 A 1 100%B C D 第52页第52页 注注 意意1 1各步加入有机溶剂量要准确。各步加入有机溶剂量要准确。2 2有机溶剂沉淀是个放热过程，因此要在有机溶剂沉淀是个放热过程，因此要在低温低温下进行。溶剂应预冷到下进行。溶剂应预冷到l0l01515左右。加入左右。加入时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白时要边搅拌边滴加，以避免局部浓度过高使酶蛋白变性。变性。3 3加入有机溶剂时要慢慢滴加，充足搅拌，加入有机溶剂时要慢慢滴加，充足搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。避免局部浓度过高而引起升温和变性。4 4加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应马上离心。马上离心。5 5采用短时间离心以析出沉淀，并且最好采用短时间离心以析出沉淀，并且最好马上将沉淀溶于适量缓冲液中，以避免酶活力丧失。马上将沉淀溶于适量缓冲液中，以避免酶活力丧失。第53页第53页