circDUSP16调节miR-126-5p_SHH轴对结直肠癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响.pdf

基 础研究Experimental Research中国现代2023年9 月第2 6 卷第9 期Sep.2023Vo1.26No.9普通外科进展Chin J Curr Adv Gen Surg688circDUSP16 调节 miR-126-5p/SHH 轴对结直肠癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响高晶晶1孙志涛1姜辉2 引沧州市人民医院完渭肠外科2 肛肠外科3神经外科4病理科（河北沧州0 6 10 0 0）张宝玉3肖肖伟1周国庆1宋东旭1张亚玲1马红艳4【摘要】目的：探究circDUSP16对结直肠癌（CRC）细胞增殖、凋亡和上皮间质转化（EMT）的影响及其作用机制。方法：qRT-PCR检测circDUSP16、m i R-12 6-5p、SH H 表达水平,CCK-8法测定细胞增殖，流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot 检测 SHH、PCNA、Bc l-2、Ba x、E-c a d h e r i n、N-c a d h e r i n 蛋白表达，荧光素酶实验检测 circDUSP16 和miR-126-5p/SHH 的靶向关系。结果：沉默 circDUSP16 组SW480细胞circDUSP16、SH H m RNA 表达、OD450值（2 4h、48 h、7 2 h）Bc l-2 和N-cadherin蛋白表达降低，miR-126-5p、凋亡率、Bax、E-c a d h e r i n 蛋白水平升高（P0.05）；下调miR-126-5p减弱了沉默 circDUSP16 对 SW480 细胞的增殖、EMT 发生的抑制,降低了细胞的凋亡能力;circDUSP16靶向负调控miR-126-5p表达,miR-126-5p靶向负调控SHH表达。结论：沉默 circDUSP16可能通过上调miR-126-5p并下调SHH抑制SW480细胞增殖和EMT发生,促进凋亡。【关键词】结直肠癌circDUSP16miR-126-5pSHH上皮间质转化【中图分类号】R735.3+4【文献标识码】Adoi:10.3969/j.issn.1009-9905.2023.09.004【文章编号】10 0 9-990 5（2 0 2 3)0 9-0 6 8 8-0 5Impacts of circDUSP16 on the proliferation,apoptosis andepithelial-mesenchymal transition of colorectal cancer cellsby regulating the miR-126-5p/SHH axisGAO Jing-jing,SUN Zhi-tao,JIANG Hui,ZHANG Bao-yu,XIAO Wei,ZHOUGuo-qing,SONG Dong-xu,ZHANG Ya-ling,MA Hong-yan4Department of Gastrointestinal Surgery,Department of Anorectal Surgery,Department ofNeurosurgery,Department of Pathology,Cangzhou Peoples Hospital(Cangzhou 061000,China)ABSTRACT Objective:To investigate the impacts of circDUSP16 on proliferation,apoptosis andepithelial-mesenchymal transition(EMT)of colorectal cancer(CRC)cells and its mechanism.Meth-ods:qRT-PCR Was applied to detect the expression levels of circDUSP16,miR-126-5p,and SHH,CCK-8 assay was applied to measure cell proliferation,flow cytometry was applied to detect apop-tosis,Western blot was applied to detect the protein expression of SHH,Bcl-2,Bax,E-cadherin,【基金项目】沧州市科技局重点研发项目（2 0 410 6 0 10）【作者简介】高晶晶（198 9-0 1），女，河北沧州人，硕士，主治医师，研究方向：胃肠恶性肿瘤。E-mail：58 7 0 6 7 99 q q.c o m高晶晶，等.circDUSP16调节miR-126-5p/SHH轴对结直肠癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响N-cadherin),and Luciferase assay was applied to detect the targeting relationship between circ-DUSP16 and miR-126-5p/SHH.Results:The silencing circDUSP16,SHHmRNA expression,OD450value(24 h,48 h,72 h),the protein expression of Bcl-2 and N-cadherin decreased,miR-126-5p,apoptosis rate,and the protein levels of Bax and E-cadherin increased(P0.05);down-regulation ofmiR-126-5p attenuated the inhibition of the proliferation and EMT occurrence of SW480 cells by si-lencing circDUSP16,and decreased the apoptosis ability of cells;circDUSP16 targeted and negativelyregulated miR-126-5p expression,and miR-126-5p targeted and negatively regulated SHH expres-sion.Conclusion:Silencing circDUSP16 may inhibit the proliferation and EMT,and promote apopto-sis of SW480 cells by up-regulating miR-126-5p and down-regulating SHH.KEY WORDS Colorectal cancercircDUSP16miR-126-5p.SHH.Epithelial-mesenchymal transition689结直肠癌(colorectal cancer,CRC)易出现转移和术后复发,需进一步研究CRC的发病机制和肿瘤转移的分子机制。环状RNA（c i r c u l a r RNA,c i r c R-NA)是一种稳定的具有闭环结构的非编码RNA，参与多种癌症包括肺癌、胃癌、胰腺癌和CRC 的病理过程 2 。其中circRNA DUSP16 是一种新发现的circRNA,在胃癌 3、食管鳞状细胞癌 4 中发挥作用，已有研究发现沉默circDUSP16能抑制CRC肿瘤的生长 5。微小RNA(micro RNA,miRNA)是一类22-25nt非编码RNA,在各种病理和生理过程中发挥着重要作用 6 。miRNA参与某些癌症的进展，有研究发现在 CRC中调节miR-126-5p能促进CRC增殖和EMT发生 7 。SHH是Hedgehog家族的分泌蛋白,参与细胞增殖、侵袭和迁移 8 。SHH信号通路与淋巴瘤、胃癌、乳腺癌、CRC等多种肿瘤相关,其中抑制SHH能阻止CRC发展 9。circRNA能与相应的miRNA结合以调节靶基因,参与一系列反应,而circDUSP16能否通过靶向miR-126-5p/SHH影响CRC细胞增殖、调亡和EMT尚不清楚。因此,本研究主要探究circDUSP16对CRC细胞增殖、迁移和EMT的影响以及其作用的分子机制。1材料和方法1.1实验材料人正常结肠黏膜上皮细胞系NCM460和人CRC细胞株HT29、SW 6 2 0、SW 48 0,购自美国ATCC细胞库。1.2主要试剂与仪器si-circDUSP16、s i-NC、s i-circDUSP16+miR-126-5p mimics si-circDUSP16+miR-NC（上海生工生物公司）;FBS、D EM E培养基、胰蛋白酶（北京索莱宝公司）;CCK-8检测试剂盒、AnnexinVFITC/PI检测试剂盒、双荧光素酶检测试剂盒（上海碧云天公司）qRT-PCR试剂盒、TRIzol试剂盒、反转录试剂盒（日本Takara公司）；一抗SHH、PCNA、Bc l-2、Ba x、E-c a d h e r i n、N-c a d h e r i n、G A PD H和山羊抗兔IgG（美国Abcam公司）。1.3实实验方法1.3.1细胞培养、分组与转染将NCM460、H T 2 9、SW620、SW 48 0 细胞置于含10%PBS的DMEM的培养基培养至对数生长期。SW480转染：si-NC、si-circDUSP16、s i -c i r c D U SP16 +m i R-NC、s i -c i r c-DUSP16+miR-126-5p mimics，即为 si-NC 组、si-circDUSP16 组、si-circDUSP16+miR-NC 组和 si-cir-cDUSP16+miR-126-5p mimics 组，正常培养的SW480细胞为NC组，所有细胞经培养2 4h后用于后续实验。1.3.2RT-qPCR检测各组细胞培养48 h后使用TRIzol试剂盒提取各组细胞中的总RNA，并用逆转录试剂盒得到cDNA，随后进行qRT-PCR,采用2-A c 法计算 circDUSP16、mi R-12 6-5p 和 SHHmRNA相对表达水平。引物序列：circDUSP16:正向：5-CCCAAGATGTTGCCTCTCTC-3，反向:5-AGCCAGCGCATTACATCATT-3;miR-126-5p:正向:5-GGTATAATCCGCCGCTTAGCTG-CC-3,反向:5-GTGCAGGGTTGCAAGGT-3;SHH:正向：5-CAAGCAGTTTATC-CCCAATGTG-3，反向:5-TCACCCGCAGTTTCACTC-3;GAPDH：正向:5-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3，反向:5-GAGT-GATTTTCCCGTCC-3。1.3.3CCK-8法检测细胞增殖将各组对数生长期细胞培养2 4h、48 h、7 2 h 后加入10%CCK-8溶液（10 L）,按照试剂盒操作，酶标仪于450 nm处测量吸光度(absorbance,A45o)。1.3.4流式细胞术检测细胞调亡将各组对数生长期细胞，按照AnnexinV-FITC/PI细胞调亡试剂盒说明书进行染色，用流式细胞仪检测细胞调亡。1.3.5Westernblot检测蛋白水平提取各组细胞总蛋白,BCA试剂盒定量浓度，将蛋白经电泳、转膜、封闭后加人一抗SHH、PCNA、Bc l-2、Ba x、E-中国现代普通外科进展2 0 2 3年9月第2 6 卷第9期cadherin、N-c a d h e r in 和GAPDH过夜孵育，再加人低,SHHmRNA表达升高(P0.05)。见图1。二抗山羊抗兔IgG。ECL发光显影，观察拍照，Image2.2各组细胞增殖情况比较与NC组、si-NC组J软件分析各条带灰度值。相比,si-circDUSP16组SW480细胞A45o值(2 4h、481.3.6双荧光素酶报告实验构建含circDUSP16690和SHH的野生型(WT)和突变型序列(MUT)的重组质粒，即pmirGLO-WT-circDUSP16、p mi r G LO-MUT-circDUSP16、p mi r G LO-W T-SH H 和 pmirGLO-MUT-SHH,分别与miR-126-5p mimics 或miR-NC共转染至SW480细胞中，转染48 h后，检测荧光素酶活性。1.4统计学处理采用SPSS22.0软件。多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，P0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1各组细胞circDUSP16、mi R-12 6-5p、SH H mR-NA表达比较与NC组、si-NC组相比,si-circ-DUSP16 组 SW480 细胞 circDUSP16、SH H mRNA 表达降低,miR-126-5p表达升高(P0.05);与si-circ-DUSP16组、si-circDUSP16+miR-NC 组相比,si-circDUSP16+miR-126-5pmimics 组miR-126-5p表达降1.571.0-0.50.0.1010%E101010010010102103 104Annexin V-FITC407ab3010-02.4各组细胞SHH、调亡和EMT蛋白表达水平比h、7 2 h)降低(P0.05);与 si-circDUSP16组、si-circ-DUSP16+miR-NC 组相比,si-circDUSP16+miR-126-5pmimics 组SW480细胞A450 值(2 4h、48 h、7 2h)升高(P0.05),见表1。表1各组细胞增殖情况比较（xs,n=6)A450值组别24 hNC组0.780.121.350.121.970.16si-NC组0.750.091.390.161.920.14si-circDUSP16组0.510.07b0.860.09b1.040.10bsi-circDUSP16+miR-NC 组0.520.060.820.111.090.12si-circDUSP16+miR-126-5p mimics 组 0.6 90.10-d 1.210.13d 1.780.09ma：与NC组相比，P0.05;b：与si-NC相比，P0.05;c：与si-circ-DUSP16相比,P0.05;d:与 si-circDUSP16+miR-NC组相比,P0.052.3各组细胞凋亡情况比较与NC组、si-NC组相比，si-circDUSP16组SW480细胞调亡率升高（P0.05);与 si-circDUSP16 组、si-circDUSP16+miR-NC组相比,si-circDUSP16+miR-126-5p mimics 组SW480细胞凋亡率降低(P0.05），见图2、3。1.5737abcd2-ab0图1各组细胞circDUSP16、m i R-12 6-5p、SH H m RNA 表达比较NC组si-NC组10101010100100 10102103 104Annexin V-FITC图2流式细胞术检测各组细胞凋亡情况NC组较与NC组、si-NC 组相比,si-circDUSP16组si-NC组si-circDUSP16组cdsi-circDUSP16+miR-NC 组工si-circDUSP16+miR-126-5p mimics 组P0.05,与NC组比较bP0.05,与si-NC 组比较cP0.05,与si-circDUSP16组比较dP0.05,与 si-circDUSP16+miR-NC 组比较图3各组细胞凋亡率比较48hINC组si-NC组cdsi-circDUSP16组1.0si-circDUSP16组+miR-NC组si-circDUSP16+miR-126-5p mimicscdab工0.5-0.0si-circDUSP16组10T10-101010010010102103104AnnexinV-FITCSHH、Bc l-2、N-c a d h e r i n 蛋白表达下降,Bax、E-c a d-herin表达上升（P0.05)；与si-circDUSP16组、si-circDUSP16+miR-NC 组相比,si-circDUSP16+miR-126-5p mimics 组 SHH、Bc l-2、N-c a d h e r i n 蛋白表达上升,Bax、E-c a d h e r i n 表达下降(P0.05),见图4、5。2.5circDUSP16、SH H 靶向miR-126-5p结合位点circDUSP16 与miR-126-5p、m i R-12 6-5p 与72 haP0.05,与NC组比较bP0.05,与 si-NC 组比较P0.05,与 si-circDUSP16组比较dP0.05,与 si-circDUSP16+miR-NC 组比较si-circDUSP16+miR-NC 组126-5p mimics 组10T10T10310E10E10101010100100 10102103 10+10 10 10103 104Annexin V-FITCAnnexinV-FITCsi-circDUSP16+miR-SHH存在潜在结合位点，见图6 和图7。与miR-NC高晶晶，等.circDUSP16调节miR-126-5p/SHH轴对结直肠癌细胞增殖、凋亡和上皮间质转化的影响SHHBcl-2BaxE-cadherinN-cadherinGAPDH图4各组细胞 SHH、PCNA、Bc l-2、N-c a d h e r i n 蛋白表达变化A:NC组;B:si-NC组;C:si-circDUSP16组;D:si-circDUSP16+miR-NC 组;E:si-circDUSP16+miR-126-5p mimics 组1.571.5组相比,miR-126-5p mimics 组 pmirGLO-WT-circ-DUSP16、p m i r G LO-W T-SH H 的荧光素酶活性均显著降低(P0.05),见表2、3。3讨论circRNA已成为癌症的生物标志物 10 。研究表明circRNA是调节 CRC 的重要因子,其中circPACRGL能够调节 CRC 细胞增殖、迁移和侵袭,而 circRNA-0000392也对CRC细胞中AKT-mTOR通路的激活有影响 u-12。c i r c D U SP16 作为新发现的circRNA,参与胃癌 3、食道管鳞状细胞癌 4、CRC6的发展。circRNA能与特定的miRNA相互作用，在癌症的AB691CDE各个方面发挥作用 13。miR-126-5p是一类与癌症进展相关的miRNA,能调节细胞内皮增殖、粘附和迁移 14。miR-126-5p的表达与CRC的发展密切相关,研究发现miR-126-5p在调节CRC增殖、迁移、1.57abcdcd1.0工ab0.51.00.5cdabT工1.00.50.00.00.01.51.00.50.0CircDUSP16miR-126-5p图6circDUSP16与miR-126-5p的结合位点SHH5UGCUCUAUUGUUUGAAUAAUU3miR-126-5p3GCGCAUGGUUUUCAUUAUUAC5图7 miR-126-5p与SHH的结合位点1.5cd0.50.0图5各组细胞蛋白表达情况比较5CAGUUGGUAAAAUGUAAUAAUA33GCGCAUGGUUUU-CAUUAUUAC5NC组si-NC组si-circDUSP16组cdsi-circDUSP16组+miR-NC组si-circDUSP16+miR-126-5p mimics 组abT组别miR-NC组miR-126-5pmimics 组a:与miR-NC组比较，P0.05侵袭、调亡、EMT和血管生成都能发挥重要作用(7.51。SHH信号通路与多种肿瘤的发生机制相关，癌aP0.05,与NC组比较bP0.05,与 si-NC组比较cP0.05,与 si-circDUSP16组比较dP0.05,与 si-circDUSP16+miR-NC 组比较表2 荧光素酶活性比较（xs,n=6)pmirGLO-WT-circDUSP161.090.150.430.06pmirGLO-MUT-circDUSP160.940.101.040.12中国现代普通外科进展2 0 2 3年9月第2 6 卷第9期表3荧光素酶活性比较(xs,n=6)ment in esophageal squamous cell carcinoma by regulating miR-组别pmirGLO-WT-SHHpmirGLO-MUT-SHHmiR-NC组1.070.08miR-126-5p mimics 组0.350.05aa:与miR-NC组比较，P0.05692细胞通过促进SHH蛋白分泌激活HH通路促进肿瘤增殖 16 。SHH在CRC的发生发展中起着重要作用，研究发现抑制SHH通路能抑制CRC发生、转移、侵袭并诱导细胞凋亡 917 。在本研究中，沉默circDUSP16可降低A450值(48h、7 2 h）、划痕愈合率、侵袭数目、PCNA、Bc l-2和N-cadherin蛋白表达，升高凋亡率及Bax、E-c a d-herin蛋白水平，表明沉默circDUSP16可抑制SW480细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT发生，促进细胞调亡。进一步本研究发现沉默circDUSP16可负向调控miR-126-5p和SHH的表达，且下调miR-126-5p可降低沉默circDUSP16对SHH表达、SW480细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT发生的抑制作用,减少细胞调亡。表明沉默circDUSP16可能通过上调miR-126-5p并下调SHH抑制SW480细胞增殖、迁移、侵袭和EMT发生，促进凋亡。综上所述，沉默circDUSP16可能通过上调miR-126-5p并下调SHH抑制SW480细胞增殖、迁移、侵袭和EMT发生，促进调亡。circDUSP16/miR-126-5p/SHH轴可能成为治疗CRC 的新靶点。本研究只是在细胞水平上验证了circDUSP16/miR-126-5p/SHH轴对CRC细胞增殖、调亡和EMT的影响，后续将在体内水平进行探索。参考文献1 Biller LH,Schrag D.Diagnosis and treatment of metastatic colorec-tal cancer:A reviewJ.JAMA,2021,325(7):669-685.2 Chen L,Shan G.CircRNA in cancer:Fundamental mechanism andclinical potentialJJ.Cancer Lett,2021,505:49-57.3 Zhang Z,Wang C,Zhang Y,et al.CircDUSP16 promotes the tu-morigenesis and invasion of gastric cancer by sponging miR-145-5pJ.Gastric 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