CircMATR3调节miR-129-5p_SOX2轴对鼻咽癌细胞CNE1恶性生物学行为的影响.pdf

cenaIm.4311MODERNONCOI.31,No.232023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期CircMATR3调节miR-129-5p/SOX2轴对鼻咽癌细胞CNE1恶性生物学行为的影响曹华琳，贾彦召？，曲莉，尹昕11南阳市中心医院耳鼻喉头颈外科；放疗科，河南南阳47 30 0 0【摘要】目的：探讨CircMATR3调节miR-129-5p/SOX2轴对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响。方法：以鼻咽癌细胞系CNE1为研究对象,将CNE1细胞分NC组、si-NC组、si-CircMATR3组、miR-NC组、miR-129-5p mimic 组、si-CircMATR3+inhibitor NC 组、si-CircMATR3+miR-129-5p inhibitor 组、si-SOX2组。RT-qPCR检测细胞中CircMATR3、m i R-12 9-5p、SO X2 m R NA 的表达；Westernblot检测蛋白表达；双荧光素酶报告实验验证CircMATR3与miR-129-5p、m i R-12 9-5p 与SOX2之间的靶向关系；克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;Hoechst33342实验观察细胞形态学变化；Transwell小室实验检测细胞侵袭能力；流式细胞术检测细胞周期与细胞调亡。结果：CircMATR3与miR-129-5p、mi R-12 9-5p 与SOX2之间存在靶向关系；沉默CircMATR3或过表达miR-129-5p或沉默SOX2可以抑制鼻咽癌细胞CNE1的克隆形成、侵袭和细胞周期转变，促进细胞亡和调亡小体的形成；抑制miR-129-5p表达一定程度可以逆转沉默CircMATR3对于CNE1细胞的抑制作用。结论：沉默CircMATR3可以上调miR-129-5p表达，抑制SOX2表达，进而抑制鼻咽癌细胞CNE1的克隆形成、侵袭，促进细胞调亡。【关键词】鼻咽癌CircMATR3;miR-129-5p/SOX2轴；恶性生物学行为【中图分类号】R739.6【文献标识码】AD0I:10.3969/j.issn.1672-4992.2023.23.004【文章编号】16 7 2-4992-(2 0 2 3)2 3-4311-0 8pact of CircMATR3 on the malignant biological behavior of nasopharyngeal carcinorlls CNE1 by regulating miR-129-5p/SOX2 axisCAO Hualin,JIA Yanzhao,QU Li,YIN XinDepartment of Otolaryngology,Head and Neck Surgery;Radiotherapy Department,Nanyang Central Hospital,Henan Nanyang 473000,China.Abstract Objective:To investigate the impact of CircMATR3 on the malignant biological behavior of nasopharyn-geal carcinoma cells by regulating miR-129-5p/SOX2 axis.Methods:Nasopharyngeal carcinoma CNE1 cells wereseparated into NC group,si-NC group,si-CircMATR3 group,miR-NC group,miR-129-5p mimic group,si CircMATR3+inhibitor NC group,si-CircMATR3+miR-129-5p inhibitor group,and si-SOX2 group.RT-qPCR was applied to detect the expression of CircMATR3,miR-129-5p and SOX2 mRNA in cells.Western blotwas applied to detect the protein expression.The targeting relationship between CircMATR3 and miR-129-5p,miR-129-5p and SOx2 was verified by double luciferase report experiment.Clonogenic assay was applied to detect the abilityof cell cloning Hoechst33342 assay was used to observe the morphological changes of cells.Transwell chamber test wasapplied to detect the cell invasion ability.Cell cycle and apoptosis was detected by flow cytometry.Results:Therewas a targeting relationship between CircMATR3 and miR-129-5p,between miR-129-5p and SOX2.SilencingCircMATR3 or overexpressing miR-129-5p or silencing SOX2 was able to inhibit the cloning and invasion and cell cy-cle transition of nasopharyngeal carcinoma cell CNE1,and promote cell apoptosis and apoptotic body formation.Inhibitionof miR-129-5p expression could reverse the inhibition of silencing CircMATR3 on CNE1 cells to some extent.Con-clusion:Silencing CircMATR3 can up regulate the expression of miR-129-5p and inhibit the expression of SOX2,thereby inhibiting the cloning and invasion of nasopharyngeal carcinoma cell CNEl and promoting cell apoptosis.Key words nasopharyngeal carcinoma,CircMATR3,miR-129-5p/SOX2 axis,malignant biological behaviorModernO2023210343.11-4318Modern Oncology 2023,31(23):4311-4318【收稿日期】202302-17【修回日期】2 0 2 3-0 7-13【基金项目】河南省医学科技攻关项目（编号：2 0 2 0 17 0 394）【作者简介】曹华琳（198 5），女，河南南阳人，主治医师，主要从事头颈部肿瘤诊治研究工作。E-mail：c a o h u a l 8 516 3.c o m【通信作者】尹昕（196 4一），男，河南南阳人，主任医师，主要从事头颈部肿瘤基础研究工作。E-mail:.4312曹华琳，等CircMATR3调节miR-129-5p/SOX2轴对鼻咽癌细胞CNE1恶性生物学行为的影响鼻咽癌是常见的头颈部恶性肿瘤，东南亚和东亚地区较普遍,其治疗方法主要包括化疗和放疗等，但是肿瘤的转移和复发以及耐药性，容易导致预后不良。因此，寻找有效的治疗方式是极为迫切的2-3。靶向疗法包括单克隆抗体、小分子抑制剂、抗体一药物偶联物和免疫治疗，可以直接或间接攻击癌症中特定生物标志物，毒性低、效果好,是治疗癌症的热门手段4。在临床上应用靶向疗法治疗癌症已较为普遍，如CircSMARCA5通过靶向miR-4295抑制胃癌细胞的增殖和侵袭,可提高PTEN的表达水平，调节糖酵解5环状RNA（c i r c u l a r R NA，c i r c R NA）稳定性高，不易被核酸外切酶降解,半衰期较长,参与多种疾病的病理生理过程,可以通过与mRNA或长非编码RNA（ln c R NA）、海绵miRNA或RNA结合蛋白（RNAbindingprotein，R BP）相互作用来直接调节转录6 ,研究发现circRNA可以调节多种癌细胞的增殖、侵袭、迁移、调亡和抑制耐药性，包括肝细胞肝癌、胃癌、结直肠癌和下咽癌，其中CircMATR3被发现是一种高度保守的人类基因,通过编码核基质蛋白来稳定某些信使RNA,在下咽癌细胞中高表达，可以促进下咽鳞状细胞癌的发展7 。性别决定区Y框蛋白2（sex determining regionYbox protein2,SOX2)对胚胎发育至关重要，在维持胚胎细胞和各种成体干细胞群的干性方面起着至关重要的作用，并且其异常表达与多种癌症相关，可以促进癌细胞增殖、迁移、侵袭和转移8 。研究发现SOX2上调是鼻咽癌预后的危险因素9此外,miR-129-5p对于鼻咽癌的恶性生物学行为具有抑制作用10 。生物信息学软件预测到CircMATR3与miR-129-5p、m i R-12 9-5p 与SOX2之间存在结合位点，因此本研究以鼻咽癌细胞CNE1为研究对象，探讨CircMATR3调节miR-129-5p/SOX2轴对鼻咽癌细胞恶性生物学行为的影响。1材料与方法1.1实验细胞人鼻咽癌细胞CNE1购自上海宾穗生物科技有限公司1.2试剂与仪器mU6pro-CircMATR3 siRNA表达质粒(si-CircMATR3,序列AAGAUAAGUAACGAUGACU）、m U 6 p r o s i R NA 阴性对照（siNC，序列UUCUCCGAACGUGUCACGU）由上海生工生物公司合成，mU6pro载体图谱见图1A；R PM I-16 40 培养基、胎牛血清均购自西格玛奥德里奇贸易有限公司；青霉素链霉素双抗购自武汉普诺赛生命科技有限公司；细胞调亡试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；抗体SOX2、MMP-2、M M P-9、Ba x、Bc l-2 购自Abcam中国。仪器：倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯；流式细胞仪购自赛默飞世尔科技中国有限公司。Kpn(5)Sacl(ll)Nhel(21)AHindil(3824)BXmal(26)A5cl(3802)BamHI(10)Smal(28)Rvprimer3primerXhol(32)Apal(3796)Ncol(17)upPA_terminatorBgl36)Pacl(3764)EGFP_N_ptimerEGFP.C.primerTBHindili(53)Pst1(3742)Y66(EGFP)ECORI(744)synth_PA_terminatorNcol(86)Sall(3729)EGFPNoul(4651)Narl(121)Stul(753)fi_originLueNrev,primerXhol(757)BstBI(257)Xbal(765)EBV.revprimerHpal(914)4143Notl(984)4R3.7481-46:Eagl(984)4417402Sacll(990)Bc1l(668)AmpR_promoterKpnl(998)fireflyLuciferaseAmpR_promoterT3promoter4015DitzTHami3452336144818bp4143bp3212(RmAmpicilin27.0213Xbal(1742)Ascl(3325)2811EBV_revprimer2008AmpieillinMi3_reverse_primer24.1MI3.pUC_revprimer411727lac_promoter202Pvull(1216)pBR322_originHpal(1902)BamHI(2004)Sall(2010)图1mU6pro(A)和pCL3-basic(B)载体图谱Fig.1mU6pro(A)and pGL3-basic(B)vector map1.3实验方法1.3.1细胞培养与转染分组将CNE1细胞培养在RPMI-1640培养基（含有10%胎牛血清和1%青霉素链霉素混合液）中，细胞培养箱温度为37，含有5%CO2，培养至对数期。取对数期CNE1细胞进行转染分组，分别转染siRNA质粒载体、miRNA抑制剂、miRNA过表达核酸序列至CNE1细胞,转染后细胞分组为si-NC 组、si-CircMATR3组、miR-NC 组、miR-129-5pmimic 组、si-CircMATR3+inhibitor NC 组、si-CircMATR3+miR-129-5pinhibitor组、si-SOX2组，设置未转染的CNE1细胞为NC组。转染步骤如下：CNE1细胞接种至6 孔板，培养2 4h使其达到50%6 0%融合；然后配置DNA/脂质体复合物（先用1mL无血清RPMI-1640稀释质粒DNA，旋转1s后加入脂质体悬液，再次旋转后室温放置10 min），弃细胞中的旧液，用1mL无血清RPMI-1640清洗细胞后弃去，每孔加入1mLDNA/脂质体复合物，37 培养3 5h；加人20%胎牛血清的RPMI-1640培养基，继续培养14 2 4h；吸出RPMI-1640/DNA/脂质体复合物，加人新鲜含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，每孔2 mL,继续培养2 4 48 h；最后用消化法收集细胞备用1.3.2RT-qPCR检测细胞中 CircMATR3、m iR-12 9-5p、SO X2 m R NA 的表达收集转染48 h的细胞，加人TRIZOL试剂提取总RNA，并根据反转录试剂盒将其逆转录为cDNA，根据PCR试剂盒进行扩增，扩增条件为95预变性5min,6235s、7 2 35s，共40 个循环。引物设计见表1，相对表达量使用2=A CT 法计算,CircMATR3和SOX2以GAPDH为内参,miR-129-5p以U6为内参。4313：MODERNONCOL.31,No.23现代肿瘤医学2023年12 月第31卷第2 3期表1引物设计Tab.1Primer designPrimer namePrimer sequenceCircMATR3Upper reaches5_TCACCTGAATGACATCTACCTCC-3Downstream5-GTCACCTGCCACTATTTCCTCC-3miR-129-5pUpper reaches5-GGGGGTTTTTGCGGTCTGG-3Downstream5-AGTGCGTGTCGTGGAGTC-3U6Upper reaches5-GTGCTCGCTTCGGCAGCACA-3Downstream5-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3SOX2Upper reaches5-GACCTGCAGTACAACTCCAT-3Downstream5-GACTTGACCACCGAACCCAT-3GAPDHUpper reaches5-CAGCGACACCCACTCCTC-3Downstream5-TGAGGTCCACCACCCTGT-31.3.3Westernblot法检测蛋白表达水平收集转染48 h的细胞，加人蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，取适量蛋白进行电泳，转膜至聚偏氟乙烯膜上，加人5%脱脂牛奶封闭1h。洗膜后加人按照1:1000比例稀释的一抗SOX2、M M P-2、M M P-9、Ba x、Bcl-2,以GAPDH(1:1000）为内参,4过夜，洗膜,加二抗，室温孵育2 h,加人ECL显影。1.3.4克隆形成实验将CNE1细胞按照1.3.1节中的方法转染后，按照4103个细胞/孔的密度接人6 孔板，置于细胞培养箱中继续培养2 周，培养过程中及时更换新鲜培养基，培养结束后，使用PBS洗涤细胞，甲醇固定后，使用结晶紫染色，于显微镜下观察并拍照1.3.5形态学变化检测细胞以2 10 5个细胞/孔的密度涂于6 孔板中过夜，然后按1.3.1节中的分组进行处理,48 h后，用甲醇固定细胞，然后用10 g/mLHoechst33342染色15min，PBS洗涤。荧光显微镜观察细胞凋亡形态学变化。1.3.6细胞周期检测将转染的细胞用预冷的7 0%乙醇在-2 0 下固定过夜。细胞经碘化丙啶（propidiumiodide,PI）溶液染色15min后，用CytoFLEX流式细胞仪测定。使用ModFitLT3.0软件进行数据分析。1.3.7细胞侵袭能力检测Transwell实验：在Transwell小室上室平铺使用无血清的RPMI-1640培养基稀释过的基质胶（Matrigel溶液），将Transwell小室置于37 细胞培养箱内3h固定基质胶。将CNE1细胞按照1.3.1节中的方法转染后，按照110 5个细胞/孔的密度接入上室，添加无血清的RPMI-1640培养基，下室为6 0 0 L含血清的RPMI-1640培养基，于37 细胞培养箱内继续培养2 4h，加人固定液固定细胞，使用结晶紫染色，在显微镜下观察并拍照1.3.8流式细胞术检测细胞凋亡将CNE1细胞按照1.3.1节中的方法转染培养48 h后，收集细胞，制备单细胞悬液，加人AnnexinV-FITC和PI各10 L,避光孵育15min后,使用流式细胞仪检测1.3.9双荧光素酶报告基因实验根据生物信息学软件预测CircMATR3与miR-129-5p、mi R-12 9-5p 与SOX2的结合位点，分别将CircMATR3与SOX2的野生型（WT）和突变型（MUT）序列构建至pGL3-basic载体,其载体图谱见图1B,分别将miR-NC与CircMATR3-WT/MUTmiR-129-5p mimic 与CircMATR3-WT/MUT、m i R -NC 与 SOX2-WT/MUT、m i R -12 9-5pmimic与SOX2W T/M U T 共转染至CNE1细胞，转染48 h后，根据试剂盒检测细胞荧光素酶活性。1.4统计学方法采用SPSS26.0进行数据分析，计量资料用平均值标准差（xs）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两间比较采用SNK-g检验，以P0.05为差异有统计学意义。2结果2.1沉默CircMATR3对CNE1细胞中miR-129-5p、SOX2表达的影响如图2 和表2 所示，与NC组、si-NC组比较,si-CircMATR3组CNE1细胞中miR-129-5p表达显著上调，SOX2表达显著下调（P0.05）。NCSi-NCsi-CircMATR3SOX235kDaGAPDH36kDa图2Westernblot检测SOX2蛋白表达Fig.2Western blot detection of SOX2 protein expression表2 沉默CircMATR3对CNE1细胞中miR-129-5p、SO X2 表达的影响(xs,n=6)Tab.2The influence of silencing CircMATR3 on the expression of miR-129-5p and SOX2 in CNE1 cells(xs,n=6)GroupCircMATR3miR-129-5pSOX2mRNASOX2 proteinNC group2.80 0.450.36 0.052.01 0.250.90 0.10si-NC group2.83 0.500.34 0.042.05 0.280.95 0.11si-CircMATR3 group1.60 0.28*#0.75 0.05*#1.23 0.20*#0.58 0.06*#注：与NC组比较，*P0.05；与si-NC组比较，#P0.05。Note:Compared with NC group,*P0.05.Compared with si-NC group,#P0.05.:4314：5p/SOX2轴对鼻咽癌细胞CNE1恶性生物学行为的影响CircMATR3调节miR-129曹华琳，等2.2沉默CircMATR3对CNE1细胞克隆形成、细胞形态、细胞周期、侵袭、凋亡的影响如图3和表3所示，与NC组、si-NC组比较，si-CircMATR3组CNE1细胞出现典型的形态学变化，如染色质凝聚和调亡小体的形成，克隆形成率、细胞侵袭数目显著下降,G。-G 期细胞比例升高,S期细胞比例下降,凋亡细胞比例、细胞调亡率显著上升，侵袭相关蛋白MMP-2、M M P-9、抗调亡蛋白Bcl-2表达显著下降，促凋亡蛋白Bax蛋白表达显著上升（P0.05)。ANCsi-NCsi-CircMATR3ENCsi-NCsi-CircMATR3MMP-274kDaBNCsi-NCsi-CircMATR3MMP-992kDaBax21kDaCNCsi-NCsi-CircMATR3Bc1-226kDaGAPDH36kDaDNCsi-NCsi-CircMATR3101010*1010101051010101010101010101010210310410101021031041001010210104FITCFITCFITC图3沉默CircMATR3对CNE1细胞克隆形成、细胞形态、侵袭及凋亡的影响A：克隆形成实验（结晶紫染色）;B:Hoechst33342实验观察细胞形态学变化（40 0）;C:Transwell实验（结晶紫染色2 0 0）;D：流式细胞仪检测细胞凋亡：右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）细胞群为目的细胞群；E：侵袭、凋亡相关蛋白条带。Fig.3Effects of silencing CircMATR3 on clone formation,cell morphology,invasion and apoptosis of CNE1 cellsA:Cloning experiment(crystal violet staining).B:Hoechst33342 experiment observed the morphological changes of cells(400).C:Transwell experi-ment(crystal violet staining 200).D:Flow cytometry detection of apoptosis.The cell groups in the upper right quadrant(late apoptosis)and the lowerright quadrant(early apoptosis)are the target cell groups.E:Invasion and apoptosis related protein bands.2.3CircMATR3与miR-129-5p的靶向关系验证通过数据库网站（https:/ 期细胞比例升高，S期细胞比例下降，调亡细胞比例、细胞调亡率显著上升（P 0.0 5）,侵袭相关蛋白MMP-2、M M P-9、抗凋亡蛋白Bcl-2表达、SOX2表达显著下降，促调亡蛋白Bax蛋白表达显著上升（P0.052.5miR-129-5p22的靶向关系验证通过数据库网站（https:/ 所示，经过双荧光素酶报告基因实验验证发现，相较miR-NC与SOX2-WT共转染组而言,miR-129-5pmimic与SOX2-WT共转染组的细胞荧光素酶活性显著下降(P0.05)。Note:ComparedwithmiR-NCgroup,*P0.05.注：与miR-NC组比较，*P0.050.510.051.010.08miR-129-5pmimic0.980.101.010.10NCmiRCircMATR3-MUTCircMATR3-WTGroupLueiferaseactivityxs,n=6)Tab.4DoubleluciferaseoandCircMATR3ofmiR-xs,n=6)表4miR-129-5p与CircMATR3的双荧光素酶报告实验结果?4315MODERNONCOLO1No.232023年12 月现代肿瘤医学第31卷第2 3期表3沉默CircMATR3对CNE1细胞克隆形成、细胞周期、侵袭及凋亡的影响(xs,n=6)Tab.3Effect of silencing CircMATR3 on the formation,cell cycle,inva-sion and apoptosis of CNEl cells(x$,n=6)ItemNC groupsi-NCgroupsi-CircMATR3 groupCloning rate(%)95.78 7.4898.12 6.4051.34 8.01*#Apoptotic cells(%)4.69 0.124.73 0.1520.35 1.21*#Percentage ofcells(%)Go-Gl32.45 3.4833.12 3.5359.05 4.04*#S56.12 5.0356.78 5.2131.06 2.45*#G2-M11.43 1.1910.10 1.159.89 1.09Number of invasions322.14 20.15328.36 23.47172.35 18.70*#Cell apoptosis rate(%)3.41 0.203.25 0.2318.36 1.05*#MMP-2/GAPDH2.80 0.452.830.501.60 0.28*#MMP-9/GAPDH0.75 0.080.78 0.060.35 0.05*#Bax/GAPDH1.23 0.201.25 0.231.89 0.30*#Bcl-2/GAPDH2.01 0.252.05 0.281.23 0.20*#注：与NC组比较，*P0.05；与si-NC组比较，#P0.05。Note:Compared with NC group,*P 0.05.Compared with si-NCgroup,#P0.05.CircMATR3:5-UUUUCAGUGAAAUGCAAAAAU-3:miR-129-5p:3-CGUUCGGGUCUGGCGUUUUUC-5图4miR-129-5p与CircMATR3的3 UTR结合位点Fig.43UTR binding sites of miR-129-5p and CircMATR3NCmiR-NCmiR-129-5pmimicAEmiR-129-5p mimicNCmiR-NCmiR-129-5pmimicMMP-274kDaBMMP-992kDaBax21kDaCNCmiR-NCmiR-129-5pmimicBc1-226kDaSOX235kDaGAPDH36kDaDNCmiR-NCmiR-129-5pmimic101010410101010E10101010101010%1010101031010410101021031041010102103104FITCFITCFITC图5过表达miR-129-5p对CNE1细胞克隆形成、细胞形态、侵袭、凋亡及SOX2表达的影响A：克隆形成实验（结晶紫染色）;B：H o e c h s t 33342 实验观察细胞形态学变化（40 0）;C：T r a n s w e l l 实验（结晶紫染色2 0 0）;D：流式细胞仪检测凋亡：右上象限（晚期凋亡）和右下象限（早期凋亡）细胞群为目的细胞群;E：侵袭、凋亡相关蛋白及SOX2蛋白条带。Fig.5Effects of overexpression of miR-129-5p on the clone formation,cell morphology,invasion,apoptosis and SOx2 expression of CNE1 cellsA:Cloning experiment(crystal violet staining).B:Hoechst33342 experiment observed the morphological changes of cells(400).C:Transwell experi-ment(crystal violet staining 200).D:Flow cytometry detection of apoptosis.The cell groups in the upper right quadrant(late apoptosis)and the lowerright quadrant(early apoptosis)are the target cell groups.E:Invasion,apoptosis related protein and SOx2 protein bands.group,#P0.05.NCNote:ComparedwithNCgroup，*P 0.0 5.C o m p a r e d w ith s i注：与NC组比较，*P0.05；与si-NC组比较，#P0.050.34 0.04*#0.94 0.120.95 0.12SOX2/GAPDH1.15 0.14*#1.920.231.95 0.22Bcl-2/GAPDH1.75 0.23*#1.230.201.200.20Bax/GAPDH0.50 0.04*#0.820.070.78 0.08MMP-9/GAPDH1.45 0.33*#2.74 0.402.70 0.45MMP-2/GAPDH1.95 0.201.23 0.21*#2.00 0.22SOX2mRNA20.17 1.35*#3.760.204.010.21Cell apoptosis rate(%)135.51 23.85*#324.36 22.45325.14 20.20Numberof invasions10.78 1.1211.43 1.1611.51 1.26-M28.79 2.61*#S54.98 5.0654.43 4.9860.43 3.87*#33.59 3.6934.063.59Percentage of cells(%)21.69 0.29*#4.830.214.81 0.18Apoptotic cells(%)50.32 7.22*#97.42 6.5898.01 7.20Cloning rate(%)ltemsi-SOX2 groupsi-NCgroupNCgroupsis and SOX2expression of CNElcells(xs,n=6)Effectof silencing SOx2oncloning,cellevcie.invasionapoptoTab.7(xs,n=6)SOX2表达的影响表7沉默SOX2对CNE1细胞克隆形成、细胞周期、侵袭、凋亡及:4316曹华琳，等CircMATR3调节miR-129-5p/SOX2轴对鼻咽癌细胞CNE1恶性生物学行为的影响表5过表达miR-129-5p对CNE1细胞克隆形成、细胞周期、侵袭、凋亡及SOX2表达的影响(xs,n=6)Tab.5Effect of overexpression of miR-129-5p on cloning,cell cycle,invasion,apoptosis and SOX2 expression of CNE1 cellss(xs,n=6)NCmiR-NCmiR-129 5pItemgroupgroupmimic groupmiR-129-5p0.380.030.41 0.050.89 0.07*#Cloning rate(%)96.23 7.5097.00 6.4844.20 7.22*#Apoptotic cells(%)4.72 0.134.75 0.1621.46 1.38*#Percentage of cells(%)Go-G133.12 3.4532.89 3.5161.23 3.96*#S55.52 5.1356.70 5.0928.81 2.23*#C211.36 1.1510.41 1.099.96 1.05Number of invasions320.14 20.15324.36 23.47142.35 19.21*#Cell apoptosis rate(%)3.41 0.203.58 0.2322.35 1.55*#SOX2mRNA2.01 0.222.040.211.05 0.20*#MMP-2/GAPDH2.75 0.412.80 0.441.43 0.25*#MMP-9/GAPDH0.75 0.080.70 0.070.41 0.05*#Bax/GAPDH1.20 0.201.25 0.212.01 0.25*#Bcl-2/GAPDH1.95 0.202.00 0.250.98 0.14*#SOX2/GAPDH0.92 0.130.94 0.120.47 0.05*#注：与NC组比较，*P0.05；与miR-NC组比较，#P0.05。Note:Compared with NC group,*P0.05.Compared with miR-NCgroup,#P0.05.SOX2:5-UCCCAUCCACACUCACGCAAAAAC-3:miR-129-5p:3-CGUUCGGGUCUG-GCGUUUUUC-5图6miR-129-5p与SOX2的3 UTR结合位点Fig.63UTR binding sites of miR-129-5p and SOX2表6miR-129-5p与SOX2的双荧光素酶报告实验结果(xS,n=6)Tab.6Double luciferase report of miR-129-5p and SOX2(xS,n=6)Luciferase activityGroupSOX2-WTSOX2-MUTmiR-NC0.99 0.101.01 0.10miR-129-5p mimic0.58 0.06*0.98 0.11注：与miR-NC组比较，*P0.05。Note:Compared with miR-NC group,*P0.05.2.6沉默SOX2对CNE1细胞克隆形成、细胞周期、侵袭及凋亡的影响如图7 和表7 所示，与NC组、si-NC组比较，si-SOX2组CNE1细胞出现典型的形态学变化，如染色质凝聚和调亡小体的形成,克隆形成率、细胞侵袭数目显著下降，G。-G期细胞比例升高，S期细胞比例下降，调亡细胞比例、细胞调亡率显著上升（P0.05），侵袭相关蛋白MMP-2、M M P-9、抗调亡蛋白Bcl-2表达、SOX2表达显著下降，促凋亡蛋白Bax表达显著上升（P0.05）2.7抑制miR-129-5p可以逆转沉默CircMATR3对CNE1丝细胞的抑制作用如图8 和表8 所示，与si-CircMATR3+inhibitorNC组比较,si-CircMATR3+miR-129-5pinhibitor组CNE1细胞染色质凝聚和调亡小体的形成变少，miR-129-5p表达显著下降,克隆形成率、细胞侵袭数目显著上升,G。-G,期细胞比例下降，S期细胞比例升高，调亡细胞比例、细胞凋亡率显著下降（P0.05），侵袭相关蛋白MMP-2、M M P-9、抗凋亡蛋白Bcl-2、Ci r c M A T R3、SO X2 表达显著上升，促调亡蛋白Bax表达显著下降（P0.05）。ON-ISMMP-274kDaMMP-992kDa