棕榈酸对人卵巢颗粒细胞脂质代谢和自噬的影响.pdf

棕榈酸对人卵巢颗粒细胞脂质代谢和自噬的影响宁薇聂方钦张哲(.湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院生殖医学中心长沙.中南大学湘雅三医院检验科长沙.中南大学湘雅三医院药学部长沙)摘 要 目的 探讨棕榈酸对人卵巢颗粒细胞 细胞株自噬和脂质代谢的影响及其机制 方法以不同浓度棕榈酸单独或联合 甲基腺嘌呤()预处理刺激 细胞油红 染色实验检测细胞脂质沉积细胞增殖试剂盒()法测定 细胞的活性 荧光探针标记法检测细胞活性氧()含量蛋白免疫印迹()法检测固醇调节元件结合蛋白()表达水平、微管相关蛋白 轻链 (和)、泛素结合蛋白、诱导的假定激酶()、表达水平 结果在 范围内随着棕榈酸浓度上升细胞内脂滴数量增多 表达量增加细胞活性显著下降(.)与对照组比较 棕榈酸处理组细胞内 含量、/比值增高(.)、蛋白相对表达量上调(.)使用自噬抑制剂 预处理后棕榈酸处理组较 棕榈酸处理组细胞活性升高(.)含量、/比值降低(.)、蛋白相对表达量降低(.)结论棕榈酸对卵巢颗粒细胞具有脂毒性可能通过/途经激活卵巢颗粒细胞自噬并可被 逆转关键词 棕榈酸人卵巢颗粒细胞自噬多囊卵巢综合征中图分类号 文献标识码 文章编号()./.开放科学(资源服务)标识码()(./.)()().().().().()()().(.)./(.)(.).(.)/(.)(.)./.颗粒细胞是包绕在卵母细胞外层的多边形的细胞通过缝隙连接和桥粒与卵母细胞连接与卵泡发育密 切 相 关 多 囊 卵 巢 综 合 征()是一种育龄期女性最常见的排卵障碍性不孕症 研究发现自噬可能是 患者卵泡发育异常的重要原因 自噬是细胞降解废弃蛋白质及细胞器的过程维持着细胞内环境的稳定但过度的自噬会导致细胞结构的破坏引起细胞死亡自噬体的积聚可诱导颗粒细胞死亡从而影响卵母细胞的发育潜能 然而目前对卵巢颗粒细胞的自噬研究还较少脂质是参与代谢和内分泌调节以及生殖功能的细胞的重要组成部分 与脂质代谢异常有关其中脂肪酸的急剧增加是 患者的脂质代谢发生紊医药导报 年 月第 卷第 期乱的重要原因之一 棕榈酸()是一种长链脂肪酸是机体内最常见的饱和脂肪酸 研究发现在 患者卵泡液中 的水平增加 但是 对颗粒细胞影响的机制尚不清楚 本研究以人卵巢颗粒细胞 细胞系为研究对象观察 对 细胞自噬平衡及脂质代谢的影响并探讨该过程潜在的调控机制 材料与方法.材料与试剂 人卵巢颗粒细胞系 购自武汉普诺赛生命科技有限公司(美国 公司货号:含 量 )、甲 基 腺 嘌 呤()(美国 公司货号:含量)油红 染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司货号:)、活性氧()检测红色荧光试剂(北京普利莱基因技术公司货号:)、细胞增殖试剂盒(美 国 公 司 货 号:)鼠抗人多克隆抗体(英国 公司货号:)(货号:)、(货号:)、诱导的假定激酶 ()(货号:)、(货号:)、兔抗人多克隆抗体(货号:)购自武汉三鹰生物技术公司.仪器与设备全自动显微镜(日本)多功能酶标仪(美国 )凝胶成像分析仪(美国 ).细胞培养和干预 细胞系采用含有 胎牛血清()的达尔伯克必需基本培养液/培养基于 、二氧化碳()的培养箱中培养当细胞融合至 时进行传代 根据前期细胞活性测定预实验结果确定 及 刺激的浓度和时间将处于生长对数期的 细胞分为正常对照组(无处理)、含有不同浓度 处理组(、)、()处理组、()()处理组 各组加收稿日期 修回日期 基金 项 目 湖 南 省 自 然 科 学 基 金 资 助 项 目()作者简介 宁薇()女湖南长沙人硕士研究方向:细胞自噬与脂代谢:电话:.通信作者 张哲()女湖南衡阳人副主任医师博士研究方向:生殖内分泌与脂代谢:电话:.药处理 后收集细胞进行后续测定.油红 染色试验取对数生长期 细胞以每孔 个细胞的密度接种于放爬片的 孔板上细胞培养至密度 时进行 干预正常对照组加不含 的完全培基 放入孵箱培养 后取出培养板磷酸盐缓冲液洗 次用 多聚甲醛固定 磷酸盐缓冲液洗 次油红 染液室温染色 纯化水洗 至背景透明再用苏木精复染室温染色 纯化水洗 用水性封片剂封片显微镜下观察细胞内的脂滴.检测、表达水平使用 细胞裂解液处理各组 细胞制备十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳()凝胶将蛋白样品上样到 凝胶加样孔内进行电泳电泳结束后用湿式转移法将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜 室温下经含 脱脂奶粉的 封闭 后 条件下孵育一抗过夜后 温箱中分别与相应的连接有辣根过氧化物酶的二抗孵育 用 洗去未发生结合的二抗 利用化学发光试剂盒显影蛋白条带 胶片经扫描后利用 定量对应条带的强度.检测细胞活性将处于对数生长期的 细胞制成细胞悬液以每孔 个细胞的密度接种于 孔板中待细胞贴壁后进行分组处理各处理组于 后每孔加入 溶液 培养箱中继续培养 用酶标仪测定其在波长 处的吸光度(值)细胞活性()处理组 值/正常对照组 值重复 次.细胞内 水平分析将处于对数生长期的 接种于放有爬片的 孔板常规培养贴壁后更换不同加药处理组的培养基继续培养 吸去细胞培养液用磷酸盐缓冲液洗涤 次加入用无血清培养基稀释的 荧光探针和细胞一起在 温箱孵育 再用磷酸盐缓冲液洗涤细胞 次将爬片置于荧光显微镜下进行观察 用 图像分析系统分析各实验组红色荧光强度.统计学方法 采用 .版统计软件进行数据分析 计量资料采用均值标准差()表示多组间均数采用单因素方差分析组间两两均数比较采用 法 以.为差异有统计学意义 结果.不同浓度 对 细胞脂滴油红 染色结果 见图 结果显示正常 细胞内未见明显橘 红色脂滴 随 刺激浓度增加与正常对照组比较细胞体积增大细胞内脂滴形成增多细胞质可见大量大泡样橘红色脂滴 且随着 浓度的增加胞内脂滴数量增加更为明显.不同浓度 对 细胞 蛋白表达结果 与正常对照组比较随 刺激浓度增加 细胞固醇调节元件结合蛋白 蛋白表达水平呈上调趋势其中 为 时对 表达上调最为明显(.)见图.抑制卵巢颗粒细胞活性正常对照组、(、)处理组的 细胞活性分别为(.)、(.)、(.)、(.)(、)处理组与正常对照组比较差异均具有统计学意义(.、.、.)随着 浓度增加 的活性呈下降趋势其中 浓度为 时对细胞活性的影响最为明显表现出明显的抑制作用故后续实验以 进行处理.自噬抑制剂 对 细胞活性的影响正常对照组、处理组、组、和 联合处理组的 细胞活性分别为(.)、(.)、(.)、(.)的 处理后细胞的增殖受到明显抑制(.)加入 预处理后可逆转 对细胞活性的抑制作用(.).对 诱导的 细胞 含量的影响 荧光检测结果见图 与正常对照组的 细胞比较 处理 后的 细胞红色荧光信号强度增加表明 水平升高(.)而使用 预处理后 生成减少(.)图 不同浓度 对 细胞脂滴油红 染色的影响().()与正常对照组比较.图 不同浓度 对 细胞 蛋白表达影响().()医药导报 年 月第 卷第 期 .正常对照组.组.组.组 与正常对照组比较.与 组比较.图 荧光探针标记法检测 组细胞活性氧含量().)而 处理组与对照组比较 相对表达水平与/比值均差异有统计学意义(.、.)加入 预处理后与 组比较 表达下调(.)/比值减小(.).对 诱导的、表达的影响 检测结果见图 与正常对照组比较 处理组 细胞 和 蛋白表达水平升高(.、.)使用 预处理细胞后 与 处理组比较 细胞 和 蛋白表达水平降低(.、.)讨论本研究表明 对卵巢颗粒细胞具有脂毒性导致颗粒细胞内脂质蓄积和细胞活性降低 含量增加 细胞表型改变与 诱导颗粒细胞氧化应激激.正常对照组.组.组.组与正常对照组比较.与 组比较.与 组比较.图 组细胞、/表达比较()./().正常对照组.组.组.组与正常对照组比较.与 组比较.图 组细胞、表达比较().()活线粒体自噬有关体内游离脂肪酸()会引起心脏及外周器官细胞脂质含量增加并转化为三酰甘油过量的 对颗粒细胞和卵母细胞发育是有害的在以往的研究中证明了饱和游离脂肪酸尤其是 可以引发胰岛素抵抗对卵泡发育产生负性影响 本研究显示随着 浓度增加引起了颗粒细胞内脂滴数量的显著增加脂肪酸合成途径的主调控因子 蛋白表达水平增加伴随颗粒细胞活性下降提示 促进颗粒细胞内脂质蓄积影响颗粒细胞脂质代谢从而引起细胞损伤卵母细胞是人体内最大的细胞其发育需要充足能量供应 除自身线粒体产生的能量外还需要其周围的颗粒细胞线粒体氧化呼吸提供能量 颗粒细胞中含有丰富的线粒体通过糖酵解途径将胞质中的葡萄糖代谢为丙酮酸并转运到卵母细胞中用以产生三磷酸腺苷维持卵母细胞的发育 本研究发现 引起颗粒细胞 含量增加说明在 刺激下颗粒细胞氧化应激加重细胞损伤的效应细胞器主要在线粒体 为经典自噬抑制剂可抑制自噬标记蛋白向 转化从而抑制自噬活性 为了进一步佐证 引起的颗粒细胞线粒体损伤与自噬活性增加有关笔者以 为工具药观察颗粒细胞在 刺激下自噬的变化 结果显示 可逆转 引起的氧化应激现象证明了 引起颗粒细胞线粒体损伤与自噬活性相关正常情况下在一个生殖周期内自噬是卵泡发育、生长和分化、闭锁所必需的 据报道 患者卵巢组织中自噬活性增高且在 大鼠模型也发现自噬标记蛋白 表达上调 研究显示等自噬相关蛋白会在 女性卵巢的膜细胞层中积累本研究结果显示对照组也有 和、的表达说明体外培养的卵巢颗粒细胞内存在基础水平的自噬加入 处理后会明显引起卵巢颗粒细胞/比值和 的表达增加且可被 逆转 为自噬接头蛋白和 是自噬体膜的结构蛋白 有研究认为当自噬被激活时自噬囊泡中 等蛋白被溶酶体酶降解 水平降低而/比值增高但本研究显示 与/变化趋同 变化存在偏差其原因可能是在正常细胞中自噬不断发生 蛋白不断降解以促使泛素化蛋白的清除 但在应激条件下特别是在本研究中 诱导的氧化应激的环境下可以引发自噬功能缺陷进而导致 蛋白聚集当细胞受到氧化应激时极易对线粒体造成损伤导致其功能障碍 此时线粒体稳态平衡需要通过线粒体自噬实现 是线粒体自噬的主要调节因子能够迅速有效地将 泛素连接酶 募集到受损的线粒体 促进线粒体膜上蛋白质泛素化从而启动线粒体自噬以清除受损线粒体 和 蛋白的过表达表明线粒体自噬增加与线粒体损伤有关 研究发现在 患者的卵巢颗粒细胞中/被过度激活 本研究也证实 处理的卵巢颗粒细胞能够增加 含量和、蛋白的表达 且可被自噬抑制剂 逆转这医药导报 年 月第 卷第 期说明 可能过度激活/介导的线粒体自噬导致线粒体损伤这可能是 参与 的发病机制本研究从卵巢脂质代谢切入探讨 的发病机制及 对卵巢颗粒细胞自噬平衡的影响结果表明 可以通过引起卵巢颗粒细胞脂质蓄积增加 含量激活/介导的线粒体自噬导致线粒体损伤损害生殖功能这些发现将有助于从新的视角为 的机制研究和治疗提供理论支持 本研究还存在不足之处即仅在体外进行实验探究了 对卵巢颗粒细胞自噬平衡的影响自噬平衡破坏引发的 的潜在机制尚未完全阐明 关于 对卵巢颗粒细胞自噬的调控及其相关作用机制还需要进一步研究证实参考文献 .().():.:.():.:.():.():.():.():.:.():.():.():.():.施陈楠崔毓桂.颗粒细胞和卵母细胞的自噬及其研究进展.国际生殖健康/计划生育杂志():.():./.():.():.():.:.():./.():.