表面等离子共振-(SPR)-技术与Biacore原理.ppt

表面等离子共振(SPR)技术与Biacore原理 戴璐戴璐表面等离子共振(SPR)原理 表面等离子共振表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)(Surface Plasmon Resonance,SPR)消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大消逝波：当光从光密介质射入光疏介质，入射角增大到某一角度，使折射角达到到某一角度，使折射角达到9090时，折射光将完全消失，时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做而只剩下反射光，这种现象叫做全反射全反射。当以波动光学的角度当以波动光学的角度 来研究全反射时，人们发现当入来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为长再返回光密介质。则透过光疏介质的波被称为消逝消逝波波。表面等离子共振(SPR)原理 等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背等离子波：把金属表面的价电子看成是均匀正电荷背景下运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎景下运动的电子气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，这实际上也是一种相等，这实际上也是一种等离子体等离子体。当金属受电磁干。当金属受电磁干扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为扰时，金属内部的电子密度分布会变得不均匀。因为库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区库仑力的存在，会将部分电子吸引到正电荷过剩的区域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥域，被吸引的电子由于获得动量，故不会在引力与斥力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间力的平衡位置停下而向前运动一段距离，之后电子间存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区存在的斥力会迫使已经聚集起来的电子再次离开该区域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库域。由此会形成一种整个电子系统的集体震荡，而库仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的仑力的存在使得这种集体震荡反复进行，进而形成的震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为震荡称等离子震荡，并以波的形式表现，称为等离子等离子波波。表面等离子共振(SPR)原理 SPRSPR光光学学原原理理：光光在在棱棱镜镜与与金金属属膜膜表表面面上上发发生生全全反反射射现现象象时时，会会形形成成消消逝逝波波进进入入到到光光疏疏介介质质中中，而而在在介介质质 中中又又存存在在一一定定的的等等离离子子波波。当当两两波波相相遇遇时时可可能能会会发发生生共共振振。当当消消逝逝波波与与表表面面等等离离子子波波发发生生共共振振时时，检检测测到到的的反反射射光光强强会会大大幅幅度度地地减减弱弱。能能量量从从光光子子转转移移到到表表面面等等离离子子，入入射射光光的的大大部部分分能能量量被被表表面面等等离离子子波波吸吸收收，使使反射光的能量急剧减少。反射光的能量急剧减少。可可以以从从反反射射光光强强响响应应曲曲线线看看到到一一个个最最小小的的尖尖峰峰，此此时时对对应应的的入入射射光光波波长长为为共共振振波波长长，使使反反射射光光完完全全消消失失的的入入射射角角就就是是SPRSPR角角。SPRSPR角角随随金金膜膜表表面面折折射射率率变变化化而而变变化化，而而折折射射率率的的变变化化又又与与金金膜膜表表面面结结合合的的分分子子质质量量成成正正比比。因因此此可可以以通通过过对对生生物物反反应应过过程程中中SPRSPR角角的的动动态态变化获取分子之间相互作用的特异信号。变化获取分子之间相互作用的特异信号。SPR生物传感器 SPRSPR生生物物传传感感器器的的光光源源为为偏偏振振光光(polarized(polarized light),light),传传感感芯芯片片(sensor(sensor chip)chip)表表面面镀镀有有一一层层金金膜膜,实实验验时时,先先将将一一种种生生物物分分子子(ligand)(ligand)固固定定在在金金膜膜表表面面,然然后后将将与与之之相相互互作作用用的的分分子子(analyte)(analyte)溶溶于于溶溶液液(或或混混合合液液)流流过过芯芯片片表表面面。SPRSPR检检测测器器能能跟跟踪踪溶溶液液中中的的分分子子与与芯芯片片表表面面的的分分子子结结合合、解解离离整整个个过过程程的的变变化化,不不同同角角度度的的反反射射光光的的光光强强被被记记录录后后得得到到角角度度-光光强强曲曲线线图图,每每条条曲曲线线的的波波谷谷即即为为该该曲曲线线的的共共振振角角,共共振振角角对对应应的的角角度度为为共共振振信信号号(resonance(resonance signal),signal),时时 间间 与与 对对 应应 共共 振振 信信 号号 的的 曲曲 线线 即即 为为 SPRSPR传传 感感 图图(sensorgram)(sensorgram)。SPR生物传感器以免疫学分析为例以免疫学分析为例,在金膜表面固定某种受体在金膜表面固定某种受体(如抗体如抗体),),然后流过含相应配体然后流过含相应配体(如抗原如抗原)的样品的样品,配体与受体的结合将使金膜与溶液界面的折射配体与受体的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升率上升,从而导致共振角发生变化。为了表述的从而导致共振角发生变化。为了表述的方便方便,共振角共振角(或共振信号或共振信号)可以用共振单位可以用共振单位(resonance units,RU)(resonance units,RU)来表示。对大多数生物分来表示。对大多数生物分子而言子而言,1000RU,1000RU大约等于大约等于1mm1mm2 2的面积上有的面积上有1ng1ng的质量变化，相当于溶液中蛋白浓度为的质量变化，相当于溶液中蛋白浓度为6mg/ml6mg/ml。SPRSPR生物传感器通过检测获得共振角的改变生物传感器通过检测获得共振角的改变程度程度,便可以对配体浓度进行定量。便可以对配体浓度进行定量。SPR 生物传感技术的应用领域生物大分子的相互作用：肿瘤研究免疫学和传染病神经科学生物制药蛋白质组学Biacore可研究的生物分子范围蛋白质 DNA/RNA 脂类/脂质体/生物膜 多糖 多肽 小分子 全细胞/病毒/微生物 可分析的对象Biacore核心组件 Biacore提供的生物分子相互作用信息：有无结合有无结合 (Yes or No)(Yes or No)结合的特异性和选择性结合的特异性和选择性 (Specificity)(Specificity)两种分子的结合强度两种分子的结合强度 -亲和力亲和力 (Affinity)(Affinity)结合和解离的快慢和复合体的稳定性结合和解离的快慢和复合体的稳定性 -动力学动力学 (Kinetics)(Kinetics)功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序 (Mechanism)(Mechanism)分子结合的温度与热力学特征分子结合的温度与热力学特征 (Thermodynamics)(Thermodynamics)目标分子活性含量的检测目标分子活性含量的检测 (Concentration)(Concentration)SPR光学组件微流控系统(IFC)集成化、自动化的微流路控制系统 样品消耗量低 为互相作用分析而设计优化 微流控系统(IFC)流动池 IFC上有4个流动池可选择单独、配对、串联使用。流动池为配对使用进行了优化(Fc1-Fc2,Fc3-Fc4)传感芯片传感芯片葡聚糖表面亲水性温和型:和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相似非特异性结合量低高结合容量易于进行共价结合出色的化学稳定性传感芯片的选择 1111种不同的芯片种类种不同的芯片种类 CM5,CM4,CM3CM5,CM4,CM3：芯片：芯片 蛋白、肽段、小分子等蛋白、肽段、小分子等 CM7CM7：小分子化合物研究：小分子化合物研究 SASA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等 Biotin CAPBiotin CAP芯片：可逆性生物素捕获芯片芯片：可逆性生物素捕获芯片 NTANTA芯片：芯片：HisHis重组蛋白重组蛋白 L1 L1 芯片：模拟脂质双分子层环境芯片：模拟脂质双分子层环境 HPAHPA芯片：实现膜系统相关的互作分析芯片：实现膜系统相关的互作分析 C1C1芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子芯片：研究细胞、病毒等大颗粒分子 AuAu裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）裸金芯片：客户定制表面（材料、高分子等）3030余种不同的试剂盒及缓冲液产品余种不同的试剂盒及缓冲液产品 ：氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒；氨基偶联试剂盒、巯基偶联试剂盒；GSTGST捕获试剂盒捕获试剂盒 GSTGST重组蛋重组蛋白分析；白分析；NTANTA捕获试剂盒捕获试剂盒 His His 重组蛋白分析；重组蛋白分析；最常用的传感芯片：CM5传感芯片 Biacore实验的基本流程 分析物和配体的定义 固定配体固定配体(Immobilization)：样品进样(Injection)分析物(Analyte)进样后，以恒定的流速和浓度流过芯片表面 样品中的待分析物与固定在芯片表面上的配体发生结合，芯片表面物质的质量发生改变，仪器记录下对应的响应值(response)的改变 进样结束后，切换缓冲液流过芯片表面，分析物由配体上自发解离，解离的进程由响应值实时监控。芯片再生(Regeneration)将自发解离后仍然结合于配体的分析物彻底洗掉。配体的结合活性必须保留。传感图(The Sensorgram)实验设计选用CM5传感芯片在金膜表面固定表达纯化后的D结构域蛋白流过含抗体的样品抗体与D结构域蛋白的结合将使金膜与溶液界面的折射率上升,从而导致共振角发生变化检测蛋白与抗体的结合情况。Company L