NY∕T 2288-2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法(农业).pdf

ICS 65.020 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准NY /T 2288-202 代替Nyrr22日8-2012黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法Detection and Identification method of Cucumber green mottle mosaic virus 2021-05 -07发布2021-11-01实施 ，.(V)生-矿l中华人民共和国农业农村部发布NY /T 2288- 2021 起草.本立;何代替NY/T 2288-2012(黄瓜绿斑驳.E11十病毒检疫检测与鉴定方法)，与NY/T 2288-2012 相比，1徐结构调整和编i:Wl改jJ外，主要技术变化如下:a) 逆转录聚合附链式反应检测法反应体系运用的引物修改为更为灵敏的CGMMV-654F/ CGM MV-654R引物序列(上游寻|物PrimcrF: 5CGTGGTAAGCGGCATTCTAAACCTC-3 ;下游引物PrimerR, 5 -CCGCAAACCAATGAGCAAACCG-3); b) 修订了结果判定逻辑顺序，调整为典型症状初步判断，快速检测高度疑似，网版免疫吸附测定法和l逆转录聚合同电储式反应检测法最终判定;c)曾111了科i案保存1;1节及要求，CI) 修订了样品取样盐的规定，区分了躲实和IIt片的取样盐。jjf注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件m农业农村都种植业管理司提出。本文件111全同植物检疫标准化技术委员会(SAC/TC271 )归口。本文伺起草单位。全同农业技术推广服务中心、沈阳农业大学、辽宁省绿色农业发展中心、四川省农业农村厅柏物检疫站、四川农业大学。本文ftI主要起草人王桶样、王晓亮、吴元华、豆子蒙、毕躲月、蔡圳、扫冬、郭迪金、李小松、何珊、尚静。本文件及其所代替文ftlf10JJj次版本发布啊i况为2012年首次发布为lY/T 2288- 2012 ; 一一本次为第一次修订。NY / T 2288- 2021 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫检测与鉴定方法1 范围本文件规定丁黄瓜绿斑驳花叶病毒的取样方法、检疫检测、结呆判定和l报告、样日，处础和档案保存.本文件适用于农业植物检疫中黄瓜绿斑驳花叶病毒的检疫检测与鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的内仅i主日期对应的版本文件。GB 15569 GB/ T 28071 4 原理5 CNaN3) , 市售商陪标抗体、所有试剂均6 仪器及用具7 取样7. 1 种子取样数量与方法按GB15569的规定进行，取样要充足，具有代表性。7.2 叶片及果实d。其中，注日期的引用文件，所有的修改11)适用于本钥I(KH，PO，)、H)、11氮化制、市售抗体、nl免洗板机、微量1m样|殖机选取发病或疑似发病叶片或果实，以J嫩11十片和l果实为主。每份月2实样品不少于200 g，Uj-j牛不少于10g，装入自封袋中密封4C保存，并注明植物名称、采集时间、地点、采tt人等信息。B 检测8 1 症状检查检查Iq片、果梗、果实，与黄瓜绿斑驳花Iq一病毒病的典型症状进行比较(见附录B)。NY! T 2288-2021 8 2 快速诊断快速珍lJfr试纸条或断J剂盒检测法见附录c如l采用市售的试纸条或试卉。盒，按说明操作。8. 3 酶联免疫吸附测定黄瓜绿斑驳花III病毒附联免疫l吸附测定法见附录00如采用市岱的试)盒，按说明操作。8 4 逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR)14二瓜绿斑驳花11十病都逆转录聚合酶链式反应检测法(R下PCRl见附录E。如采用市您的试剂盒，按说191操作。9 结果判定和报告9. 1 结果判定9.11 典型症状*实发病且符合典型症状，可初步步1)定。9.12 快速诊断结果快速诊断试纸条或i牵邸r试剂盒检测结果为阳性的，可判定为高J3r疑似。9.13 酶联免疫吸附测定法在阴性对!阳光密皮他OO血;0.1 .且附rt对!00值大于阴性对照00值21行的前提下，样品孔00值大于)j性x.J.!00 值2倍时，判定为阳性反应，eJl样品带黄瓜绿斑驳花叶病毒。9.1.4 逆转录聚合酶链式反应检测(RT-PCR)观察电泳结巢，在|咽性对!l在654bp处有条带出现，且空白、阴性对!ft无条带出现的前挺下，待测样ITt在654bp处有条销出现，判定为阴性反应，即样品带黄瓜绿斑驳花Iq-病毒.9 15 结果报告将鉴定结*:11人附录F的植物有害生物样本鉴定报告中。10 样品处理检测过程中使用的有关材料和l用具，在使用完毕后须进行消毒和iI徐害处型。经检疫鉴定后的种子样品应保存在C冰箱内，11)片和l柴实样品应保存在一20C以下6个月备企，保存期满后，进行灭活处斑。11 档案保存采样信息、鉴定报告等原始资料妥普保存子植物检疫机构，保存期至少一年。2 A 1 包被缓;中液附录A(资料性)试jfIJ配制方法NY /T 2288- 2021 -Ia2CO, 1. 59 g,Na HCO, 2. 93 g,NaN, O . 2 g，去离子水定谷至1000mL.调整pH至9.6，4C储存。A.2 洗涤缓冲液-Ia2-PO, 1. 15 g,(H2PO, 0. 2 g,NaCI 8. 0 g,(CI O. 2 g,IUjlii,-20 O. 5 g去离子水定容至1000 mL, 调整pH至7.4，室11，1i/l存。A.3 提取缓冲液鸡蛋消粉2.0g，聚乙烯II ltll各烧阁(PVP. (30)(分子量4400054 000) 20. 0 g,Na2SO 1. 3 g,NaN, 0. 2 g，IH棉2020. 0 g i剔。早于1000mL lXPBST中，调整1-1至7.4.4C储存。A.4 酶标抗体缓;中液牛.riJl活蛋白2.0 g，聚乙烯IIltll各院酬(PVP，(30) 10.0 g,NaN O. 2 g，浴解于1000 mL 1 X PBST中，调整pl-l至7.4，4C储存。A. 5 底物缓冲液二乙醇j除97.0mL,MgCI, O. 1 g,NaNJ 0.2 g，去离子7(定谷至800mL，调整p-1至9.8，4C1，吉存。3 NY / T 2288-2021 附录B(资料性)黄瓜绿斑驳花时病毒基本信息8.1 寄主范围西瓜、胡芦、黄瓜、南瓜、组瓜等瓜类作物。8.2 生物学特性8. 2 1 致死温度90 oC-IOO oC 8. 2. 2 稀释限点10-7 mL/ L-1O mL/L。8. 2. 3 体外存活期i主达119 d以上。在ooC可保持数年。病iZ在乎l子内可存l-1i240 d-540 d.病残体在土填内深埋420 d.病手在仍有侵染活性。8. 2 4 病毒粒体形态也镜观察病毒粒体为栋状.长约300nm,Ji:!: 15 nmo 8.3 典型症状8. 3. 1 西瓜染病症状l叶片出现不规则的褪绿色，呈斑驳花11十状，绿色部分隆起，l1j-缘向1-翻卷，叶片略变窄卸10!f梗有时出现例色j不死条纹。果除l内:+现条丝状黄色纤维，种子周围的果IJ变ug-红色7)(渍状，严重11-1架内全变成峭红色，内有大量;空洞，软化，腐烂变l沫，不能食月J(见阁B.l和I阁I呈.2)。图8.1西瓜果实发病典型症状图8.2商瓜叶片发病典型症状8. 3. 2 甜瓜染病症状感病后茎梢新叶出现货斑，但随新I1j-老化症状减轻。成株侧校11十出现不整形或是状黄花I1l，生育后J钢顶部叶片有时再现大型黄色轮斑。果实有两类症状，一利:在果实表面出现绿色斑;另一种在绿色部的中心会出现灰白色。. 3. 3 黄瓜染病症状感病初期新11十出现黄色小斑点，以后黄色部分书展成花I叶，并发生深绿糊状突起，rq-脉呈绿带状，严重时榄树J顶部儿?如叶片边缘上卷成杯严重时植株顶部几张叶片边缘上卷成杯状。发病轻时来实只出现淡黄包性ilJ小斑点，Jt瓦重时出现深绿色姻状突起变成l畸形。B. 3. 4 到瓜染病症状l叶片出现花叶，有绿色突起，脉间黄化n1-脉呈绿带状。B. 3 5 葫芦染病症状幼11十:.H现淡黄色花叶，其后出现浓绿l且1!21斑，随111片老化症状减轻。B.4 传播途径B. 4. 1 传播方法NY /T 2288-2021 种子传楠，接触传染(植物间接触、农事操作、汁液)，介体传莓(苑丝子、黄瓜I叶甲等).花粉传莓，病残体传播，以及栽培营养液、灌溉水、被污染的包装容都以及动物粪便传播等。其中，带毒利:子是远距离传擂主要途径，接触传染是近距离传播主要途径。B. 4. 2 侵染循环在和l 子、病株残体、士攘1均可越冬，成为绊，二年的初J侵染来源。;IW南非l 子是主要初佼染源。在|刃|呵，能4日谷纷地通过病株的汁液接触传楠，人工嫁援和授粉等方式劫再传染。冈此，田间农事操作如整枝、上架、捎心、投粉、嫁接均可导致t虫病态的再次传捕。B. 4. 3 流行与环境发病受ilfA皮影响，在16C时侵染至发病/l:2周-3周，显病较轻，在28C-35 C下接种l周口11百I发病，疲状豆。适生性和l抗逆性极强，所有株系都是极端稳定的，常泪下病毒侵染力可保持数月，在oC可保持数年。mlJ一旦发病，如未进行特殊的杀灭处理，病株残体中的病毒可存活多年，即使将病根埋在土内一年以J.病毒仍有侵染能力。发病受7冕战:影响较大，在田间如逍遥阴雨，劫造成流行。p d NY / T 2288-2021 C1 检测样品处理植物样品在检测前市处础。百r每样品11-1-片(样rJr=t1n.l片(半片至一片C2 样品检测6 附录C(资料性)黄瓜绿斑驳花叶病毒快速诊断试纸条或检测盒测定配套制样管或制样袋进行样品屈尊效果，静宜待检。或将NY/T 2288-2021 D.1 样品制备D. 1. 1 种子附录D(资料性)黄瓜绿斑驳花叶病毒双抗体夹心酶联免疲吸附测定取种子若干粒，去皮，)111人样品提取缓111液(WV = 1 8)研磨匀浆，5000r/min,4 C离心5min，保存待用。D 1. 2 日十片取l叶片加入挺取缓1Ir班(WV = l 8)研赂，匀浆。5000r/min,4 C离心5min，保存待用。D2 包被将CGMMV的包被打L体按照试剂盒指定稀释比例m包被抗体缓11111部释，混匀，1m入自串联板中，每孔内)m人1001.，放入保湿贪内，放1:，37 C中孵育4h。D.3先i辈孵育结束后，将反应孔中的试开IJ倒巾，用PST洗涤11MI洗3次4次，每次15s，然后将微孔板例如在吸水纸t以控干孔中残阳液体。D.4 加入抗原(待泪IJ样品)在酶i段根中1Jll人抗原ii则样品)，同时加1人阳性对!在、阴性对!骂和l空白对!*(样品提取缓111掖)100L，待测样品重复3次，但1日t箱中或室jt下(25.c)孵育2h，剩余样品于20 C冰箱保存备查。D.5先i辈按D.3执行。D.6 加入酶标抗体将CGMMVIW标抗体按照试剂盒指定稀释比伊JHJii每标抗体缓冲液稀释，i昆匀，1m人酶联板中，混合均匀，于每个反应孔11m人100J.lL，fjiJ人知显企内，室iffi，(20C25 c)孵育2h, D 7 洗涤按0.3执行。D8 加入底物试剂孵育结束前的15min illl备PNPP底物浴液rI人PNP显色剂.混合均匀，1111人酶联板，每孔100L。放入保湿盒内，室泪(20C-25 C)避光30min- 60 min, D.9 终止反应于每孔中加l人50L终止液，终止反应。D.10 测定月j号标仪在405nm il!i K下测量结果，读取各孔浴液的光密度值00(的，也录结果。7 NY /1 2288-2021 附录E(资料性)黄瓜绿斑驳花叶病毒逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)测定E1 器皿前处理为防止RNANI降fl1RNA，部llIl在试验前都要川DEPC7 0. 5 IOX RT lluffe, 2 RNa四r，回忆IdH，O13. 5 dNTP Mix!urc(备10mmol!U RNasc lnhihitor (40 U/JlU 0. 5 M-MLV Rcvcr:ic Transcrptase O . 5 RNA 2 E 3. 2 2 PCR扩增在冰附上依次将下列组分)m人PCR反应管1:1:1，反应采用25L体系。反应条件为，94C预变性3 min、94C变性30日，53C退火305，72C延伸15s，35个循环;72 C延伸10min。反应体系见表E.2。8 反应自lJj(5XP巳Rbuffcl ddH,O TaKaRa EXT(/qHS 表E.2 PCR反应体系反应t川成Primcr F( 10 flmol/ U Primcr R( 1坦旦旦1.)IlT产物(cDNJJE. 4 RT-PCR扩增产物凝胶电泳检测NY/T 2288-2021 表E.2 (续)取5L扩增产物州6Xloading buffer i1fffJlf，点样。电泳后用澳化乙链(EB)阳在进行染色30minQ 紫外成像后观察结果并记录结果(见阵IE.I)。M + 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 654 bp 柯、Jllj:.rJi兑91M DNA Markcr DL 2 000; + 阳怕对!(!;一空白和l阳Itl.x.t阳1-0一-阳性样品.图E.1 RT-PCR扩增产物电泳结果9 NY / T 2288-2021 附录F(资料性)植物有害生物样本鉴定报告植物有在生物样本鉴定报告见表F.l 。书i物名刷、州物，t.ffJUJ样til飞来源送检1y1位检测鉴定方法:lli核人(签轩)0 NON-BNNHhFZ ，+，罔农业:1，Jl!t平l(北京市j:J阳I)麦干庸街山H政编lic，100125网址)北京科印技术将flj服务有限公司印刷l新华书m北京发行Ifr发行各地新华书店经!j我拎* 印张1字数20干平2021110月北京第1(大印刷l每开本880mm XI 230mrn 1/16 2021年10月第l版1号161日9.872 1 定价34.元 版权专有侵权必究举报电话[phone] NY/T