中国两栖类物种新纪录——德氏棘蛙.pdf

Chinese Journal of Wildlife 2023，44（3）：708-714Chinese Journal of Wildlifehttp：/中国两栖类物种新纪录德氏棘蛙贺艳红1，艾仁达1，黄镇杨1，张洋2，刘小龙2，袁智勇2*（1.西南林业大学，云南省高校极小种群野生动物保育重点实验室，昆明，650224；2.西南大学生命科学学院，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室，重庆，400715）摘 要2022年7月，在中国云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区采集到4号两栖纲（Amphibia）无尾目（Anura）叉舌蛙科（Dicroglossidae）棘胸蛙属（Quasipaa）标本。标本整体体型较大，成体雄性头体长76.277.3 mm。背部皮肤光滑，呈黑褐色，无明显褶皱。背上部有圆条状黑色斑纹；背下部、体侧至胯部及两股散布有小疣粒；肛部及周围分布有黑色角质刺；体侧部有5或6个较大的白色圆疣；咽喉部有浅棕色斑。指端略膨大，指关节下瘤大，第一指长于第二指；趾端膨大呈圆形吸盘，趾间全蹼，趾关节下瘤明显，四肢背面有黑褐色横纹，与采自越南北干省（Bac Kan Province，Vietnam，模式产地）的Quasipaa delacouri标本形态基本一致。基于线粒体细胞色素b（Cyt b）基因片段的系统发育分析结果显示，研究样本与Q.delacouri样本聚为一支，遗传距离为6.5%。结合形态和系统发育分析结果，确定该标本为Q.delacouri，是中国两栖纲分布新纪录物种，新拟中文名为“德氏棘蛙”。标本保存于西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室。New Distribution Record of Quasipaa delacouri in ChinaHE Yanhong1，AI Renda1，HUANG Zhenyang1，ZHANG Yang2，LIU Xiaolong2，YUAN Zhiyong2*（1.Key Laboratory of Conserving Wildlife with Small Populations in Yunnan，Southwest Forestry University，Kunming，650224，China；2.Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development Ministry of Education，College of Life Science，Southwest University，Chongqing，400715，China）稿件运行过程收稿日期：2023-04-27修回日期：2023-05-29关键词：棘胸蛙属；德氏棘蛙；新纪录；中国；云南省；麻栗坡老山省级自然保护区Key words：Quasipaa；Quasipaa delacouri；New record；China；Yunnan Province；Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve中图分类号：Q958.2文献标识码：A文章编号：2310-1490（2023）-03-0708-07DOI：10.12375/ysdwxb.20230328基金项目：文山州生物多样性综合调查两栖类和爬行类动物专题调查项目（2021533517000982）；云南省基础研究计划（专项）优秀青年项目（202001AW070016）；云南省中青年学术和技术带头人后备人才项目（202005AC160046）第一作者简介：贺艳红，女，25岁，硕士研究生；主要从事生物多样性保护研究。E-mail：*通信作者：袁智勇，E-mail：贺艳红等：中国两栖类物种新纪录德氏棘蛙第3期Abstract：Four specimens（Amphibia，Anura，Dicroglossidae，Quasipaa）were collected in July 2022，at the Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve，Wenshan，Yunnan Province，China.The specimens are relatively large in size，with an adult male head-body length ranging from 76.277.3 mm.The dorsal skin is smooth，dark brown in color，with no obvious folds.There are circular，bar-shaped，black markings on the back.Small warts are scattered on the ventral side，flanks，thighs，and groins.Black keratinous spines are distributed around the anus.Five or six large white circular warts are on the lateral side of the body.Light brown markings are on the throat.The fingertips are slightly enlarged，the lump below the finger joint is large，and the first finger is longer than the second.The toes are enlarged and have circular sucking discs at the fingertips，with full webbing between them，and the lump below the toe joint is obvious，dark brown horizontal stripes on the back limbs.It is similar to those specimen of Quasipaa delacouri specimen collected from Bac Kan Province，Vietnam（type locality）.Phylogenetic analysis based on the mitochondrial cytochrome b（Cyt b）gene fragment showed that this specimen and Q.delacouri specimens clustered together，with a genetic distance of 6.5%.Based on the morphological and phylogenetic analysis results，the specimen is identified as Q.delacouri，a new amphibian species recorded in China，and named“德氏棘蛙”in Chinese.The specimen is currently stored in the Key Laboratory of Freshwater Fish Reproduction and Development Ministry of Education，Southwest University.Quasipaa delacouri（Angel，1928）隶 属 两 栖 纲（Amphibia）无尾目（Anura）叉舌蛙科（Dicroglossidae）棘胸蛙属（Quasipaa）1。该物种于1928年由Angel2首次报道和描述，模式产地为越南北干省（Bac Kan Province，Vietnam）。目前仅分布在越南北部（老街省、北干省、山罗省、永福省、河江省、和平省、义安省、清化省、承天顺化省和岘港市）及邻近的老挝等地区，在中国境内未发现分布1。2022年7月，在对中国云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区的调查中，于保护区内两处地点共采集到4号棘胸蛙属物种标本，标本现保存于西南大学淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室。采集到的棘胸蛙属物种标本经外部形态特征对比及分子系统发育关系分析，鉴定为 Q.delacouri，是中国两栖动物分布新纪录。本研究描述了采集地生境、物种形态特征、分子数据及系统发育分析，为该物种的后续深入研究提供基础资料。1材料与方法1.1标本采集与形态学测量2022年7月3日，在中国云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区内两处地点（225021.41 N，1044036.16 E，海 拔 1 100 m；22 5015.90 N，1044310.91 E，海拔1 405 m）共采集到4号棘胸蛙属物种标本（标本号：SWU 0002320、SWU 0002321、SWU 0002322、SWU 0002323）。取肝脏、大腿肌肉和少许脚趾样品储存于95%乙醇中，-24 保存，用于后续分子实验验证。整体标本固定于75%乙醇溶液中。参考Pham等3的测量方法，用电子数显卡尺测量标本的外部形态（测量精度为0.1 mm）。测量参数主要包括头体长（snout-vent length，SVL）、头长（head length，HL）、头 宽（head width，HW）、吻 长（snout length，SL）、眼间距（interorbital space，IOS）、鼻眼距（nostril-eye length，NEL）、鼻间距（internasal space，INS）、眼径（diameter of eye，ED）、上眼睑宽（width of upper eyelid，UEW）、鼓膜径（diameter of tympanum，TD）、前臂及手长（length of lower arm and hand，LAHL）、胫 长（tibia length，TIB）、足 长（foot length，FT）、后肢全长（hind limb length，HLL）、指长（finger length，FL）及趾长（toe length，TL）。同时基于Angel对 Q.delacouri的形态描述2与本例标本进行形态比较。1.2分子实验与系统发育关系分析采用 Thermo Fisher Scientific 公司提供的 DNA提取试剂盒对新采集的4号标本的肌肉组织进行全基因组DNA提取，DNA样品-24 保存。使用PCR对线粒体细胞色素 b（Cyt b）基因片段扩增，引物 为Cytbyf1（5-TTTCCGTAGACAACGCCACCCT-3）和Cytbyf3（5-CTAGGTTTTGATGAGGC-3）4。PCR 反应程序为94 预热5 min；94 变性45 s，45 退火709野 生 动 物 学 报第44卷45 s，72 延伸 45 s，35个循环；72 终延伸 7 min；4 保存。扩增产物用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，最后由北京擎科生物科技有限公司对扩增产物 双向测序。使用LaserGene 7.0软件包中的SeqMan对 所 得 序 列 质 量 检 测 和 人 工 校 对，生 成 一 致序列5。根据 Yan 等6对棘胸蛙属系统发育的研究结果，选取虎纹蛙Hoplobatrachus chinensis（Osbeck，1765）作为外群，并从 GenBank（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov）数据库中下载该属其他类群物种序列，共27条（表1）。使用MEGA 7.0对每个线粒体Cyt b序列进行比对和编辑7。基于最大似然法（ML）和贝叶斯法（BI）重建系统发育关系。由于线粒体 Cyt b基因为编码基因，在此基础上，使用DAMBE软件筛选密码子8，并使用jModelTest 2中的AIC标准计算序列的最佳进化模型9。第一位密码子和第二位密码子的最佳模型为TPM+G，第三位密码子的最佳模型为 TrN+G。使用 RAxML 8.2.410构建最大似然树，基于默认参数，自展 1 000次估算节点支持率。使用 MrBayes 3.1.211进行贝叶斯系统发育分析。根据计算的最佳模型，在默认热值下使用马尔可夫链蒙特卡洛链（MCMC）执行独立运算4次，每1 000代抽样1次，执行500万代，散频率平均标准偏差小于0.01达到稳定。基于收敛情况，抛弃前25%的树。使用来自MrBayes的分裂频率平均标准差（ASDSF）和潜在尺度缩减因子（PSRF）统计数据评估拓扑收敛性和分支长度收敛性。然后使用Tracer v.1.512检查各运行参数值是否收敛（ESS值200）。最后使用MEGA 7.07中的p-distance双参数模型计算棘胸蛙属物种间的遗传距离。表1样品分子分析信息Tab.1 Sample information used for the molecular analysis物种Species棘腹蛙Quasipaa boulengeri棘腹蛙Q.boulengeri棘腹蛙Q.boulengeri德氏棘蛙Q.delacouri德氏棘蛙Q.delacouri德氏棘蛙Q.delacouri德氏棘蛙Q.delacouri德氏棘蛙Q.delacouri德氏棘蛙Q.delacouri德氏棘蛙Q.delacouri小棘蛙Q.exilispinosa小棘蛙Q.exilispinosa九龙棘蛙Q.jiulongensis九龙棘蛙Q.jiulongensis棘侧蛙Q.shini棘侧蛙Q.shini棘侧蛙Q.shini棘胸蛙Q.spinosa棘胸蛙Q.spinosa棘胸蛙Q.spinosaQ.sp.1Q.sp.2Q.sp.2多疣棘蛙Q.verrucospinosa多疣棘蛙Q.verrucospinosa叶氏隆肛蛙Q.yei虎纹蛙Hoplobatrachus chinensis地点LocalityChina：Aba，SichuanChina：Kangxian，GansuChina：Zhaotong，YunnanChina：Malipo，YunnanChina：Malipo，YunnanChina：Malipo，YunnanChina：Malipo，YunnanVietnam：Bana Resort，DanangVietnam：Phong Dien，Thua Thien HueVietnam：Suoi Luong，DanangChina：Damaoshan，HongkongChina：Xunwu，JiangxiChina：Wuyishan，FujianChina：Wuyishan，FujianChina：Xinhua，HunanChina：Kaili，GuizhouChina：Guilin，GuangxiChina：Xianning，HubeiChina：Daoxian，HunanChina：Lushan，JiangxiVietnam：Kon Ka Kinh，Gia LaiChina：Pingbian，YunnanChina：Pingbian，YunnanVietnam：Quanhoa，ThanhhoaVietnam：Quanhoa，ThanhhoaChina：Shangcheng，Henan标本编号Specimen voucher No.SCUM 051656WDKIZ 08020KIZYPX 10140SWU 0002320SWU 0002321SWU 0002322SWU 0002323KIZ 013695KIZ 010072KIZ 013702KIZ 01575KIZ 07219KIZ 08920KIZ 08918KIZ 04612KIZ 02395KIZ 08465Tissue ID：YPX 8564Tissue ID：YPX 24780KIZJX 0709001Tissue ID：YPX 21705KIZYP 007Tissue ID：YPX 10371KIZ 011605KIZ 011655KIZ 02412Cyt b GenBank序列号Cyt b GenBank No.JX676267JX676263JX676355OR042806OR042807OR042808OR042809MT678119MT678113MT678120MT678126MT678179MT678193MT678192MT678161MT678133MT678185MT678254MT678246MT678237MT678257MT678240MT678239MT678114MT678115MT678134JX181763710贺艳红等：中国两栖类物种新纪录德氏棘蛙第3期2结果2.1生境云南省文山麻栗坡老山省级自然保护区属南亚热带高原季风气候13，本次采集到的标本发现于海拔1 1001 500 m的山涧溪流中，水流急，两侧植被丰富，主要以灌木、草本植物和季风常绿阔叶林为主。在采集地附近还发现了河口湍蛙（Amolops shihaitaoi）、沙巴臭蛙（Odorrana chapaensis）、长吻臭蛙（O.nasica）和大角蟾（Xenophrys major）。2.2形态特征标本各部位数据见表2。共采集到4号棘胸蛙属标本，其中 2 号为雄性成体标本（SWU 0002320，SWU 0002321），2 号为亚成体（SWU 0002322，SWU 0002323），未采集到雌性标本。新采集到的标本体型较大，成体雄性头体长为76.277.3 mm。头宽大于头长；吻端钝圆，突出于下唇；吻长小于眼径；鼓膜小，不明显。指端略膨大，指关节下瘤大，指式为。后肢长，左右跟部重叠。趾端膨大呈圆形吸盘，趾间全蹼，趾关节下瘤大，趾式为。背部皮肤光滑，整体呈黑褐色，无明显褶皱。背上部分布有圆条状黑色斑纹；背下部、肛周围及两股均分布有小疣粒，肛部及周围分布有黑色角质刺。体侧部有5或6个较大的白色圆疣。咽喉部有浅棕色斑（图1）。表2麻栗坡老山省级自然保护区采集的棘胸蛙属标本形态量度Tab.2 Morphological measurement of Quasipaa specimens collected in Malipo Laoshan Provincial Nature Reservemm 鉴别特征Discriminant feature头体长 SVL头长 HL头宽 HW吻长 SL鼻间距 INS眼间距 IOS鼻眼距 NEL上眼睑宽 UEW眼径 ED鼓膜径 TD前臂及手长 LAHL胫长 TIB足长 FT后肢全长 HLL第一指长 FL1第二指长 FL2第三指长 FL3第四指长 FL4第一趾长 TL1第二趾长 TL2第三趾长 TL3第四趾长 TL4第五趾长 TL5SWU 0002320（雄性 Male）76.223.530.39.56.75.04.37.311.12.233.037.335.4123.310.910.013.811.29.514.820.927.820.9SWU 0002321（雄性 Male）77.323.930.49.77.75.65.06.611.22.335.142.238.2128.211.09.713.211.911.114.519.526.819.4SWU 0002322（亚成体 Sub-adult）50.916.420.26.85.83.92.64.57.41.920.028.321.481.87.05.58.27.16.37.910.315.810.6SWU 0002323（亚成体 Sub-adult）59.719.425.88.86.24.83.84.39.12.625.433.230.2104.19.18.611.110.09.713.118.223.018.4711野 生 动 物 学 报第44卷2.3分子数据及系统发育分析研究新获得 4 条长度为 433 bp 的线粒体 Cyt b 序 列（GenBank 序 列 号 为 OR042806，OR042807，OR042808，OR042809）（表1），结合从GenBank下载的23条数据，共发现142个简约信息位点和165个变异位点。基于ML和BI法构建的系统发育结果具有相似的拓扑结构，这里仅展示贝叶斯系统发育树。在文山麻栗坡老山省级自然保护区内采集到的4号棘胸蛙属物种标本与越南承天顺化省（Thua Thien Hue，Vietnam）和越南岘港市（Danang，Vietnam）的 Q.delacouri标本聚为一支（图2）。使用p-distance双参数模型计算遗传距离结果显示，新采集的4号标本与Q.delacouri的遗传距离为6.5%。3讨论本次新采集到的4号棘胸蛙属物种标本形态学鉴定特征与越南北干省（Bac Kan Province，Vietnam，模式产地）的Q.delacouri的鉴定特征基本符合。头宽大于头长；鼓膜小，不明显；指端略膨大，指关节下瘤大；第一指略长于第二指；后肢长，左右跟部重叠；趾端膨大，趾间全蹼，趾关节下瘤较大。背部呈黑棕色，皮肤光滑，无明显褶皱；肛部及周围有黑色角质刺。与模式标本（头体长120 mm）相比，新采集的成体雄性标本整体形态小（头体长76.277.3 mm），吻长（9.59.7 mm）略小于眼径（11.111.2 mm），而模式标本的吻长（17 mm）略长于眼径（12 mm）2。由于描述的模式标本并未记录性别2，无法判断该形态差异是否因雌雄性别差异所致，且本次未采集到雌性标本，不能进一步比较判断这些差异是种群间的还是雌雄间的。同时系统发育分析结果也支持新采集到的标本为 Q.delacouri，4号标本都与 Q.delacouri标本聚为一支（图2）。基于以上结果，认为新采集到的 4号标本为 Q.delacouri，依据其英文别名Tonkin Spiny Frog（Tonkin为越南北干省曾用名）14，将该物种的中文名定为“德氏棘蛙”。Quasipaa delacour最早被发现于越南北部北干省2，之后在老挝和越南义安省、清化省及河江省 等地先后被报道过，但少有该物种的图片记录及 图1德氏棘蛙形态（麻栗坡老山省级自然保护区，SWU 0002321，雄性）Fig.1 Morphology of Quasipaa delacouri（Malipo Laoshan Provincial Nature Reserve，SWU 0002321，male）注：A.背侧面；B.背面；C.腹面；D.前肢腹面；E.后肢腹面Note：A，Dorsolateral view.B，Dorsal view.C，Ventral view.D，Ventral surface of forelimb.E.Ventral surface of hind limb712贺艳红等：中国两栖类物种新纪录德氏棘蛙第3期生境描述，尚不清楚该物种的具体繁殖时间1518。Q.delacour 于 2022 年 7 月在中国云南省文山麻栗 坡老山省级自然保护区内被发现，该保护区与相邻的越南北部地区有着相似的物种组成，对动物地 理学研究有重要意义，但在采样过程中未观察到 O.delacour的抱对现象，加之考察时间较短，尚不清楚其是否进入繁殖期，因此该物种的繁殖生活史需进一步研究。致谢：感谢文山麻栗坡老山自然保护区的工作人员对野外工作给予的帮助。参考文献：1 FROST D R.Amphibian species of the world：an online reference：Version 6.1 DB/OL.2023-04-10.https：/amphibiansoftheworld.amnh.org/index.php.2 ANGEL F.Sur une espce nouvelle de grenouille du Tonkin，appartenant au genre Rana J.Bulletin du Musum National D Histoire Naturelle，1928，34（5）：319-320.3 PHAM C T，VAN HOANG C，PHAN T Q，et al.Hidden in the jungle of Vietnam：a new species of Quasipaa（Amphibia，Anura，Dicroglossidae）from Ngoc Linh MountainJ.ZooKeys，2022，1124：23-42.4 YAN F，ZHOU W W，ZHAO H T，et al.Geological events play a larger role than Pleistocene climatic fluctuations in driving the genetic structure of Quasipaa boulengeri（Anura：Dicroglossidae）J.Molecular Ecology，2013，22（4）：1120-1133.5 BURLAND T G.DNASTAR s lasergene sequence analysis softwareM/MISENER S，KRAWETZ S A.Methods in molecular biology：Vol.132：bioinformatics methods and protocols.Totowa：Humana Press，2000：71-91.6 YAN F，NNEJI L M，JIN J 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Evolutionary Biology，图2基于线粒体Cyt b基因构建的棘胸蛙属贝叶斯树Fig.2 Bayesian inference tree of Quasipaa derived from Cyt b sequences注：图中“/”前后的数字分别表示贝叶斯后验概率和自展值支持率，低于0.95/75%的用符号“-”表示Note：Numbers denote the Bayesian posterior probabilities（BPP）and bootstrap support（BS）respectively，below 0.95/75%is indicated by“-”713野 生 动 物 学 报第44卷2007，7：214.13 王平，丁智强，华红莲，等.云南省老山自然保护区地貌特征及其对土地利用类型分布的影响 J.水土保持通报，2021，41（5）：287-295.WANG P，DING Z Q，HUA H L，et al.Geomorphological characteristics and their impacts on land use patterns in Laoshan Nature Reserve of Yunnan Province J.Bulletin of Soil and Water Conservation，2021，41（5）：287-295.14 POYARKOV N A，VAN NGUYEN T，POPOV E S，et al.Recent progress in taxonomic studies，biogeographic analysis，and revised checklist of amphibians in Indochina J.Russian Journal of Herpetology，2021，28（3A）：1-110.15 PHAM C T，NGUYEN T Q，VAN HOANG C，et al.New records and an updated list of amphibians from Xuan Lien Nature Reserve，Thanh Hoa Province，VietnamJ.Herpetology Notes，2016，9：31-41.16 NGUYEN S 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