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脂肪间充质干细胞来源外泌体对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征影响的研究任致奇1,2，尚爱加1,2，杨博尧1,3，柏钧1,2，贾志博1,3，刘修志1,3，王玉1,31解放军医学院，北京100853；2解放军总医院第一医学中心神经外科，北京100853；3解放军总医院第四医学中心骨科医学研究所，北京100853摘要：背景施万细胞是神经系统的重要构成部分，为促进轴突再生和诱导靶神经再生提供必要的信号和空间线索。脂肪间充质干细胞来源广泛，在再生医学方向效果明确，外泌体作为神经系统细胞间的重要信息媒介，在调节再生方面发挥着重要作用。目的探索脂肪间充质干细胞来源外泌体(adipose-derivedstemcells-derivedexosomes，ADSCs-exos)对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征的影响。方法提取 ADSCs-exos 进行鉴定；利用显微镜和流式细胞学对 ADSCs 鉴定，通过超速离心法提取 ADSCs 来源外泌体并通过透射电镜拍摄图片；将 ADSCs-exos 与大鼠施万细胞进行直接共培养，观察ADSCs-exos 对施万细胞增殖的影响；取雌性 SD 大鼠 8 只，Matrigel 基质胶搭载 ADSCs-exos 注入商用硅胶管构建神经移植物为外泌体组，Matrigel 搭载 PBS 注入商用硅胶管为空导管组(Hollow)，每组 4 只。构建坐骨神经 1cm 缺损模型，将神经移植物缝合于近端和远端神经残端之间，缝合伤口后放回笼中安置。3 周取出神经移植物评价轴突再生情况。结果成功提取 ADSCs，能够表达间充质干细胞表面标记蛋白 CD73、CD90、CD105。成功提取 ADSCs-exos，能在透射电镜下观察到磷脂双分子层结构。在 ADSCs-exos 和施万细胞共培养体系中，比较 24h 和 48h 施万细胞增殖情况，施万细胞增殖与 ADSCs-exos 浓度呈剂量依赖性。动物实验结果表明，外泌体组 3 周时轴突生长优于 Hollow 组(P0.05)。结论ADSCs-exos 可以促进施万细胞增殖，负载 ADSCs-exo 神经移植物的轴突生长长度在 3 周时即具有优势。关键词：外周神经损伤；脂肪来源干细胞；外泌体；修复；施万细胞中图分类号：R651文献标志码：A文章编号：2095-5227(2023)06-0694-06DOI：10.3969/j.issn.2095-5227.2023.06.019引用本文：任致奇，尚爱加，杨博尧，等.脂肪间充质干细胞来源外泌体对施万细胞增殖功能及早期神经再生特征影响的研究J.解放军医学院学报，2023，44（6）：694-699.Effects of adipose-derived mesenchymal stem cell exosomes on Schwann cell proliferation andearly nerve regenerationRENZhiqi1,2,SHANGAijia1,2,YANGBoyao1,3,BOJun1,2,JIAZhibo1,3,LIUXiuzhi1,3,WANGYu1,31ChinesePLAMedicalSchool,Beijing100853,China;2DepartmentofNeurosurgery,theFirstMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,China;3InstituteofOrthopedicMedicine,theFourthMedicalCenter,ChinesePLAGeneralHospital,Beijing100853,ChinaCorrespondingauthor:SHANGAijia.Email:Abstract:BackgroundSchwanncellsareimportantcomponentsofthenervoussystem,providingnecessarysignalsandspatialcuestopromoteaxonalregenerationandinducetargetnerveregeneration.Adiposemesenchymalstemcellsarewidelysourcedandhavecleareffectsinthedirectionofregenerativemedicine,andexosomesplayanimportantroleinregulatingregenerationasanimportantmediatorofinformationbetweencellsofthenervoussystem.ObjectiveToexploretheeffectofadipose-derivedstemcells-derived exosomes(ADSCs-exos)on the function and early neural regeneration characteristics of Schwann cells.MethodsADSCs-exoswereextractedforidentification;ADSCswereidentifiedbymicroscopicobservationandflowcytometry,and ADSCs-derived exosomes were extracted by ultracentrifugation and photographed by transmission electron microscopy;ADSCs-exoswereco-cultureddirectlywithratSchwanncellstoobservetheeffectofADSCs-exosontheproliferationofSchwanncells.EightfemaleSDratsweretaken,andmatrigelmatrixgelwasinjectedintocommercialsiliconetubeswithADSC-exostoconstructnervegraftsfortheexosomegroup;matrigelwasinjectedintocommercialsiliconetubeswithPBSfortheemptycathetergroup(Hollow),with4ratsineachgroup.The1cmsciaticnervedefectmodelwasconstructed,andthenervegraftsweresuturedbetweentheproximalanddistalnervestumpsandplacedbackinthecageaftersuturingthewound.At3weeksafterremovalofthenervegrafts,theaxonalregenerationwasevaluated.ResultsADSCsweresuccessfullyextractedandwereabletoexpresstheMSC收稿日期：2022-12-08基金项目：国家自然科学基金面上项目(32171356)作者简介：任致奇，男，在读硕士。研究方向：周围神经损伤修复。Email:通信作者：尚爱加，男，主任医师，教授。Email:694解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/surfacemarkerproteinsCD73,CD90,andCD105.ADSCs-exosweresuccessfullyextractedandthephospholipidbilayerstructurecould be observed under transmission electron microscopy.In the co-culture system of ADSCs-exos and Schwann cells,theproliferationofSchwanncellsat24hand48hwascompared,andtheproliferationofSchwanncellsshowedasignificantdose-dependentrelationshipwiththeconcentrationofADSC-exos.TheresultsofanimalexperimentsshowedthataxonalgrowthwassignificantlybetterintheexosomegroupthanthatintheHollowgroupatthreeweeks(P0.05).ConclusionADSCs-exoscanpromotetheproliferationofSchwanncells,andtheaxongrowthlengthofADSCs-exo-loadedneuralgraftsissuperiorat3weeks.Keywords：peripheralnerveinjury;adipose-derivedstemcells;exosomes;repair;SchwanncellCited as：RenZHQ,ShangAJ,YangBY,etal.Effectsofadipose-derivedmesenchymalstemcellexosomesonSchwanncellproliferationandearlynerveregenerationJ.AcadJChinPLAMedSch,2023,44（6）:694-699.周围神经损伤(peripheralnerveinjury，PNI)发病率高，约占创伤患者的 2.8%，国内每年新增周围神经损伤病例 30 万50 万1。近年来，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)移植被认为是治疗周围神经损伤的新方法。目前临床上应用研究较多的主要干细胞为自体脂肪间充质干细胞(adiposederivedstemcells，ADSCs)和自体骨髓间充质干细胞(bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)，自体干细胞移植由于不存在免疫排斥和伦理学问题而具有广阔的应用前景，但关于 MSCs的植入和归巢能力下降、存活率低和分化能力受损也一直存在争议，加之成瘤性等问题，限制了其临床应用潜力2。已有较多研究表明 MSCs 通过旁分泌发挥作用，故使用 MSCs 分泌组的无细胞治疗在再生医学领域可能是一种更好的选择3。外泌体被认为参与了许多生物学过程，并参与细胞间通信。外泌体具有典型的磷脂双层膜结构，携带着各种与细胞间通信相关物质4。已有研究表明间充质干细胞来源外泌体调控 miRNA 细胞间运输和表达促进轴突生长，介导生长因子促进轴突再生，并使施万细胞与炎症细胞相互协调以促进神经再生5-6。目前动物研究大多聚焦于外泌体对周围神经损伤后的长期作用，本实验尝试在体外探索脂肪间充质干细胞来源外泌体(adipose-derivedstemcells-derivedexosomes，ADSCs-exos)对施万细胞增殖的影响；在大鼠坐骨神经缺损模型上使用 ADSCs-exos，探索短期(3 周)内 ADSCs-exos对周围神经损伤修复的影响，通过短期周围神经免疫组化染色评价其对神经轴突生长的影响。材料与方法1实验动物健康雌性 SD 大鼠 8 只，8 周龄，体质量 200250g，用于构建坐骨神经 1cm 缺损模型。健康雌性 SD 大鼠 3 只，3d 龄，用于提取ADSCs。所有动物由解放军总医院动物实验中心提供，获解放军总医院实验动物伦理委员会批准。2主要试剂DMEM 培养基(Gibco)；胎牛血清(fetalbovineserum，FBS；Gibco)；磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsaline，PBS；Gibco)；青链霉素溶液(Gibco)；0.25%胰蛋白酶-EDTA(Gibco)；型 胶 原 酶(Sigma)；CD90 抗 体(BDPMG)；CD105 抗 体(Novus)；CD45 抗 体(BDPMG)；CD90 抗 体(BDPMG)；CD73 抗 体(BIORBYT)；Neurobasal 培养基(Gibco)；10%山羊血清(Solar-bio)；70m 细胞筛网(Millipore)；体视显微镜(NikonDSRi2)；胰酶(Gibco15050065)；阿糖胞苷(Sigma C6645)；PBS(Corning 21-031-CV)；FBS(Gibco10099-141)T25/T75 培养瓶；3%戊巴比妥钠注射液(上海玉研)；75%乙醇(京试剂)；兔来 源 S100 单 克 隆 抗 体(Sigma)；小 鼠 来 源NF200 单 克 隆 抗 体(Sigma N0142)；山 羊 抗 兔IgG/Alexa Fluor594(Abcam)；山 羊 抗 小 鼠IgG/AlexaFluor488(Abcamab150117)；DAPI染色液(四正柏生 FXP139-100)；Matrigel 基质胶(Corning354230)。3脂肪间充质干细胞的提取取 3dSD 雌性大鼠 3 只，颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡消毒5min 后转移入超净台。无菌条件下取出腹股沟脂肪组织，用含 5%双抗的 PBS 漂洗 3 遍后移入青霉素瓶中，用已灭菌的眼科剪将脂肪组织剪成1mm3的碎块。加入 7.5mL 含 0.1%型胶原酶的 DMEM，放入磁珠，把青霉素小瓶放在 37 培养箱中的磁力搅拌器消化 30min。消化好后加入7.5mL 含 FBS 的 DMEM(低糖 10%)终止消化，用滤网滤过。收集消化液 1500r/min 离心 5min，弃上清。用间充质干细胞专用培养基 DMEM 重悬沉淀。接种于小培养瓶中，置于 37、5%CO2细胞培养箱中培养，48h 后首次换液，并继续培养。4脂肪间充质干细胞的鉴定光学显微镜下观察 P3 代脂肪间充质干细胞，消化重悬脂肪间充质干细胞做流式细胞学检测。5脂肪间充质干细胞来源外泌体的提取正常处理的 ADSCs 传至 34 代，待细胞长至 70%80%，更换无外泌体血清培养基后培养 48h，收集解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/695上清。4 下 300g 离心 10min 去除活细胞收集上清，再 2000g 离心去除死细胞后收集上清，至解放军总医院转化中心使用超速离心机 10000g 离心30min 去除细胞碎片，收集上清后 4 下 100000g超速离心 90min，沉淀以 PBS 重悬；再次 100000g离心 90min，沉淀以 400gPBS 重悬，得到外泌体。并使用 BCA 蛋白分析试剂盒进行检测。6脂肪间充质干细胞外泌体的鉴定透射电镜拍摄提取的 ADSCs 来源外泌体。7施万细胞的提取、纯化及培养配制施万细胞基础培养基：DMEM/F-12、10%FBS、2mmol/LGlutaMAX-I、1青-链霉素双抗；施万细胞纯化培养基：施万细胞基础培养基添加 10mol/L 阿糖胞苷。施万细胞完全培养基：施万细胞基础培养基添加 2mol/L 毛喉素、10ng/mLEGF-D。取 12hSD 乳鼠 4 只，经颈椎脱臼法处死后置入 75%乙醇浸泡消毒 10min，取 710mm 坐骨神经后，冲洗血迹并以 119 的比例混合液胰酶、型胶原酶、DF-12 的混合液消化 30min。消化后离心并弃掉上清，加入 4mL 施万细胞基础培养基，吹打1020 次，至无明显组织块，转移至35mm2培养瓶中，于37、5%CO2环境下培养。24h 后更换施万细胞纯化培养基，抑制并杀死成纤维细胞达到纯化干细胞的目的。培养 72h 后更换施万细胞完全培养基，增殖施万细胞。8脂肪间充质干细胞外泌体与施万细胞共培养BCA 试剂盒测量 ADSCs-exos 浓度，分别设为5g/mL、10g/mL、20g/mL 三组。消化状态良好的 P3 代干细胞制成均匀细胞悬液，96 孔细胞培养板中，每孔 100L。待干细胞完全贴壁后加入配制好的不同浓度 ADSCs-exos。分别在培养24h、48h 后加入 10LCCK-8 试剂，继续在37 温箱培养 4h。分别测定 450nm 波长处吸光值，反映活细胞数量，探究 ADSCs-exos 在 24h、48h 对施万细胞增殖的影响。9动物实验造模及分组8 只体质量220250g的雌性 SD 大鼠用于构建大鼠坐骨神经1.0cm缺损动物模型(成年大鼠坐骨神经主干长度约2cm，截取中间段 1cm)。使用3%戊巴比妥钠(用量：30mg/kg)对大鼠进行腹腔麻醉，暴露坐骨神经后截断 1cm 坐骨神经，根据干预措施不同，将其随机分为硅胶管+Matrigel 胶组(Hollow)、硅胶管+Matrigel 胶+外泌体组，每组 4 只。Matrigel 作为外泌体载体，制备方式为 Matrigel 和 PBS 重悬的1000g/mLADSCs 来源外泌体 11 等体积混合，重悬液约 250g 注射入硅胶管后 37 温箱下孵育 0.5h。将 12mm 不同处理的硅胶管，包绕近端/远端神经残端 1mm 以保证紧密连接。10组织病理学分析于动物手术 3 周后，将两组共 8 只大鼠注射致死量戊巴比妥；于上次手术切口处拆线并暴露坐骨神经，观察各组神经损伤修复后的形态，取下硅胶管，放入 4%多聚甲醛固定液中固定，2d 后转入 30%蔗糖溶液脱水处理。脱水处理的组织埋入 OCT 胶，置于温度为-22 的冷冻腔内，待 OCT 胶完全凝固后使用冰冻切片机切片，最后所得切片厚度为 8m。切片免疫组织化学染色：将切片复水 5min 后，加入 5%TritonX-100(PBS 配制)+山羊血清室温作用 2h 以达到组织的破膜和封闭；PBS 洗涤 3 次后加入单克隆抗体 S100，NF200，4 孵育过夜；于第 2 天将孵育过夜片子 PBS 洗涤 3 次，避光操作下加入山羊抗兔 IgG和山羊抗小鼠 IgG，37 孵育1h，PBS 洗 3 次；加入 DAPI 染液，避光孵育10min。PBS 洗涤 3 次后用水性封片剂封片，最后于全景显微镜观察并获得图片。11统计学方法采用 GraphPadPrism7.0 进行统计学分析以及绘图，两两比较采用 t 检验，P0.05 为差异有统计学意义。结果1ADSCs 的鉴定流式细胞术结果表明，在P3 代的 ADSCs 中，间充质干细胞表面标记性抗原CD73(78.17%)、CD90(99.96%)、CD105(88.75%)阳性率极高，而造血干细胞表面标记性抗原 CD34(0.07%)、CD45(1.01%)阳性率极低(图 1)。且所提取的脂肪间充质干细胞镜下呈梭形，贴壁生长(图 2)，说明我们成功在大鼠脂肪组织中提取出间充质干细胞，可用于后续外泌体的提取。2ADSCs 来源外泌体的鉴定透射电镜下可观察到明显的磷脂双层膜结构(图 3)，符合外泌体外观，提示提取外泌体成功。3ADSCs 来源外泌体对施万细胞增殖的影响CCK-8 增殖实验表明(图 4)，施万细胞在 24h 和48h 的增殖情况随着 ADSCs-exos 浓度的增高呈明显的剂量依赖性(P0.05)，提示 ADSCs-exos 可促施万细胞增殖。4周围神经缺损早期修复评价移植术后 3 周，取下神经移植物进行组织学评价。免疫组化结果显示，轴突呈绿色荧光，施万细胞呈红色荧光，细胞核呈蓝色荧光(图5)。对比Hollow 组(4266.7m)，696解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/实验组(6638.8m)神经轴突再生长度显著增加(P0.05)，提示 3 周时 ADSCs 来源外泌体对周围神经损伤已产生积极作用(图 6)。图 1 ADSCs 流式细胞学检测Fig.1 ADSCs were detected by flow cytometry图 2 光学显微镜下 P3 代 ADSCs 形态Fig.2 Morphology of P3 ADSCs under optical microscope图 3 透射电镜下 ADSCs-exos 形态Fig.3 Morphology of ADSCs-exos under transmission electronmicroscope图 4 24 h/48 h 施万细胞增殖实验Fig.4 Schwann cell proliferation experiment at 24 h/48 h解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/697 讨论周围神经损伤会导致支配区域出现运动感觉障碍，神经组织修复过程缓慢，严重影响了患者的生活质量，是目前临床面临的一大医学难题。MSCs 能够在同种异体移植环境中使用，成为治疗周围神经损伤的新选择7。MSCs 具有抗凋亡、抗炎、促血管生成、神经保护、抗肿瘤、抗纤维化、组织修复、抗菌和吸引化学物质等作用8。有研究表明，MSCs 在周围神经损伤后轴突再生中起重要作用，通过修复施万细胞可加速碎片清除，增殖和迁移形成 Bngner 条带，分泌生长因子和神经营养因子，使轴突再生9。外泌体是干细胞旁分泌作用中极具代表性的一类物质。近年来，很多研究证明了外泌体等细胞外囊泡在周围神经再生中起到重要作用10。外泌体的再生修复能力于其亲本细胞的功能密切相关，即干细胞来源外泌体具有与干细胞类似的组织修复再生和保护能力11。最重要的是，相比移植的 MSCs 归巢能力下降、存活率低和分化能力受损、成瘤性等缺点，MSCs-exos 拥有高免疫源性的巨大优势。故使用 MSCs-exos 实现无细胞治疗在再生医学领域可能是一种更好的选择12。研究证实了 MSCs-exos 对周围神经再生中起积极作用，外泌体生产过程中的一系列膜凹陷使其富含 miRNA 和各类蛋白，外泌体促进 RNA 和蛋白质在细胞间转运，实现了对周围神经修复再生的积极作用13。miRNA 的信息交换是外泌体参与细胞间交换的重要手段，如 miRNA-222 和miRNA-21，可通过作用于转录因子和相关信号通路对血管再生起到至关重要的作用，提供了轴突再生的微环境14-16。外泌体所含的肌动蛋白和-微管蛋白是轴突生长所需的重要蛋白，热休克蛋白 70 则是重要的神经元保护蛋白，外泌体中包含的 Galectin-3 参与髓鞘吞噬，这些外泌体包含的蛋白质在神经再生中起到了重要作用；其携带的神经营养因子、表皮生长因子等可传递至轴突，达到营养神经元、促进轴突再生的功效17。研究表明，间充质干细胞外泌体可介导内皮细胞迁移及血管重建，或可为周围神经损伤后修复提供所需的重要微环境18。ADSCs 是成体干细胞的一种，广泛分布于不同部位的脂肪组织中，相比其他类型的间充质干细胞，ADSCs 在拥有间充质干细胞的普遍修复特性同时，还具备取材简单安全、来源丰富的特点。已有许多研究证明了 ADSCs 的强大修复特性，将其应用于皮肤创面和周围神经的修复19，目前其应用相对成熟，因此我们选择了 ADSCs，研究其外泌体作为早期周围神经修复手段的可能性。目前外泌体的提取方式有超速离心法和试剂盒提取法等20。市场上的试剂盒种类繁多，有提取简单、亲本细胞需求量小等优点，但其最后所提取的外泌体杂质较多，相近分子量和直径的细胞膜碎片常混入其中。故此本研究中我们选取了差速离心法，尽管步骤相对较多，但提取外泌体更纯，避免了实验干扰，经透射电镜拍摄和粒径分析也证实了这一点。图 5 坐骨神经免疫组化染色后轴突生长长度对比(S100：红色；NF200：绿色；DAPI：蓝色)Fig.5 Comparison of axon growth length after immunohistochem-ical staining of sciatic nerve(S100:red;NF200:green;DAPI:blue)图 6 坐骨神经轴突生长长度Fig.6 Sciatic nerve axon growth length698解放军医学院学报Acad J Chin PLA Med Sch Jun 2023，44（6）https:/施万细胞是神经系统的重要构成部分，可转运自身核糖体参与神经元蛋白合成，并提供神经营养因子起到保护神经元、促进神经元再生的作用21。有研究证明 ADSCs-exos 可以降低神经损伤后施万细胞凋亡率22。从而加速周围神经损伤后修复，在本研究中，我们证明施万细胞的增殖与ADSCs-exos 呈明显的浓度依赖，在后续动物实验中，我们通过建立经典的大鼠坐骨神经截断模型探究 ADSCs-exos 在活体内对神经再生的修复作用。通过 3 周取材后对比加入与未加入 ADSCs-exos 神经移植物的轴突生长情况，我们发现负载ADSCs-exo 的神经移植物轴突生长长度在 3 周时即具有优势。于是我们得出 ADSCs-exos 可参与促进轴突生长的结论，虽然具体作用机制在本研究中并未探索，但为今后的外泌体研究提供新的参考，也为未来临床的无细胞治疗提供了研究证据。作者贡献作者贡献任致奇：文章总体构思及撰写初稿；尚爱加：监督指导；杨博尧、柏均：审读和修订；王玉：资金获取；贾志博、刘修志：文献搜集及处理。利益冲突利益冲突所有作者声明无利益冲突。数据共享声明数据共享声明本篇论文相关数据可依据合理理由从作者处获取，Email：。参考文献Nocera G，Jacob C.Mechanisms of Schwann cell plasticityinvolvedinperipheralnerverepairafterinjuryJ.CellMolLifeSci，2020，77（20）：3977-3989.1IsaacsJ，CochranAR.Nervetransfersforperipheralnerveinjuryin the upper limb：a 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