浮游植物及浮游动物制片过程.doc

藻类的采集、标本制作和保藏  
2007-11-08 13:46:10|  分类： 生物技术 |  标签： |字号大中小 订阅

采集藻类要以各种藻类的生态环境、生活习性为基础。藻类主要分布在水中，如湖、河、海洋，可分为固着、漂浮、浮游三类。在陆地潮湿处也有分布。从气候条件看，一般在温暖季节，藻类的种类和数量较多。有一些种类如蓝藻在气温较高时生长特别繁盛；也有些种类如硅藻、甲藻在气温凉爽时较多。
一、目的
学习藻类的采集、标本制作和保藏方法。
二、用具和药品
镊子，小刀，浮游生物网，玻璃瓶，玻璃管，铁丝篮，培养皿，台秤，骨匙，三角烧瓶，量筒，采水瓶，广口瓶，橡皮塞，温度计，绳子，标本瓶，指管，记录簿， 25和13号绢纱，硬纸标签，铅笔，黑纸，吸管，盖玻片，载玻片，铅块（或不锈钢块），表面皿，标本盘，毛边纸，纱布，道林纸，标本夹，报纸。
碘，碘化钾，福尔马林，95％乙醇，醋酸，酪酸，冰醋酸，甘汕，阿拉伯树胶，水合氯醛，铁矾，海氏苏木色素，明胶，石炭酸，火漆，加拿大胶，二甲苯，pH试纸。
三、操作
1．标本的采集
藻类分布极广，在不同环境条件中，藻类的组成成分是不同的。因此，采集不同生境中的藻类，应根据它们的生长情况，采取不同方法。
（1）着生藻类：对于生长在其他物体上较大型藻类，一般用手或镊子采取。应尽可能采取整个植物，包括它们的基部或着生部分。生长在石上的，最好用小刀刮取；生长在水生高等植物上的，要用镊子取下生长藻类最多的部分叶、茎一同保存（尽可能记下植物名称）；生长在土壤上的，最好用刀铲取，尽可能少带泥土（如专作土壤藻类研究，则应分层采土，进行培养）；生长在树干上的，要用刀削取。
微型藻类中也有不少是附生的，更有一些混生在其他植物（如苔藓等）之间，在有这类藻类生长的部位，常具有各种颜色的斑点、斑块、颗粒、粘质层、皮壳状、薄膜等标志，应选择生长最多部分用刀刮取或削取。岩石上不易刮下的种类，如急流中或海岸岩石上的藻类可敲取或取小石块一同保存。
（2）漂浮藻类：在各种静水水体中，常漂浮一些丝状藻藻丛。采集时应注意取同一藻丛上不同颜色部分或不同颜色的藻丛，特别是变成黄褐色部分常为生殖时期的植物体。如采集较长的、分枝的藻类，不宜折取一段藻体，而应尽可能采整体。
（3）浮游藻类：先准备好采集工具，在水面较宽、较深水体中要用：
（1）浮游生物网 一般用25号（网孔为0.06毫米）筛绢做成。在湖泊内应用的浮游生物网为圆锥形，口径约20厘米，网长约60厘米（见图）。

制作时，可用直径约3～4毫米的铜条或粗铅丝作一环，来支持网口，使它成环形。用金属（如铝、钢精或铜）或玻璃小筒，套结在网底，通常称为网头，用来收集过滤到的藻类。由于滤液内有浮游动物，如时间放得较久，往往藻类有不少被浮游动物吞食，所以若不马上观察，需用固定液固定。若用来分离藻种，可用13号筛绢（网孔0.1毫米）再将滤液过滤一次备用。有些地方购买筛绢较困难，也可不用浮游生物网，而用采水瓶，或一般器皿。但因藻类个体较少，最好多采些水样，待沉积后观察。
（2）采水瓶 采取垂直分层定量藻样和水样需用采水瓶。这种工具式样规格繁多，见图是可以自制的简易采水瓶，比较实用。

制作方法是取一个500mL（或1000mL）的广口瓶，瓶底附一块重1.5kg的铅块（或不锈钢块），用铅丝固定在瓶底。瓶口橡皮塞穿三个孔，一孔插进水的长玻管，一孔插排气和出水的短玻管，一孔插温度计。进水管与出水管的上端都高出塞面3cm左右，进水管下端接近瓶底，出水管下端接近塞底。用一根长约24cm的软橡皮管，一头紧套在排气管上，不使脱落；另一头则较松地套在进水管上，并在此处扎一根细绳（既要扎牢，又不能影响以后排水）。还要在瓶颈上扎一根较粗的绳子，以沉下或拉起水瓶。
采样时，将采水瓶沉没到规定水层，向上拉细绳，使橡皮管与进水管脱开，水即可迅速进入采水瓶（为使进水速度快些，玻管内径最好粗些，在10mm以上）。待3～5分钟后，将瓶提出水面，先看水温，再倒出水样。
（3）采样记录 采样结束后，即填写采样记录（项目见附表）。所有样品的标签和记录都必须用铅笔（钢笔或圆珠笔字迹遇水会化掉），并在标本瓶上缚牢编号标签（有一种胶布标签使用较方便）。标本瓶口要塞紧。

（4）各种藻类的采集：
1)衣藻 衣藻分布很广，绝大部分在淡水中。一般生活在有机质丰富的较不流动的水沟、水池或临时水洼中，在流动性的或清洁的水池里较少。南方农民用的粪池或粪缸中（一般在粪不多而上层有较多水的缸），经常有纯粹的衣藻群，致使水呈绿色（有时还有眼虫）。
一般衣藻最多的时期是在春末、秋初，气温在10～20℃，在上海、江、浙一带，一年四季几乎都可采到。形成胶鞘体的常在渐趋干竭的水池岸边。如欲得到较多且纯粹的材料，可用大的广口瓶盛入2/3有衣藻的池水带回。瓶的一面用黑纸遮起，另一面承光，放在窗台上。这样，由于衣藻具有趋光性，大量聚集于光亮面，然后用吸管吸取备用。要得到结合生殖时期的衣藻，当气候骤然变化时就可能采到。如在上海，当冬季寒潮到来的次日采集时，就会发现结合状态的衣藻。
2)水绵 在池塘中，缓慢流动的河水中，有时在岸滩边，可发现水绵，特别是春、秋两季更多。生长初期它们是亮绿色，在衰亡和生殖时发黄。水绵用手触之有滑润的感觉（其他有些丝状藻也会有滑润感）。
采集标本时，应该在一个水域中选择若干不同地点，对不同颜色的都要采集，且不可看材料已变黄绿不洁，成一种破棉絮状漂浮物时就弃之不采，因为这样就常把生殖状态标本遗漏。采集少量标本时，可用小玻璃管（指管）装回；如需要材料较多，则可用广口瓶装回，但放入材料不宜过多，最多占容器的1/3，水也不宜过满，以求空气充足。材料如当场不固定则需敞口带回。
在采集时，如要知道材料是否已经是接合时期，除了观察颜色是一种鉴别方法外，也可把盛有材料的容器正向着太阳光，用放大镜在管外看一下。如果丝状体上有褐色斑点则是形成了接合孢子，这样的材料一定要带回。要得到接合时期的水绵，应在一个固定地点作定期的经常采集观察。水绵的接合有明显的周期性，且每种的接合生殖时期不同，大多在春季接合，但在夏、秋季，甚至在冬季（上海、苏州一带）也可找到。
3)硅藻 在自然界中分布很广，大量存在于水体中，在水底各种物体表面上都可以找到它们，经常出现于潮湿岩石表面（呈黄棕色），在土壤里也常能见到。附生硅藻可用解剖刀从附着表面刮下来，采集土表硅藻可带一层土。
4)蓝藻 大多存在于水体中，尤其当大量发生成“水花”时（一般在高温季节和水体富营养化后易产生）很易捞取观察。另外，在水田、河滩、水沟边土面如呈一片蓝黑色也是蓝藻，在雨后积水潭内也能发现，可连泥一起采集。由于蓝藻体表有粘胶层，常造成手触有粘滑感。与其他藻类不同，蓝藻能耐干旱，甚至在直射阳光下，干燥岩石上也可存在。
5)轮藻 广泛分布于含有硬水、粘泥和水流较慢的湖泊或水池里，通常形成茂密藻丛。在秋季可采到带有生殖器官的轮藻，这些器官用肉眼可以看见。采集时，还需注意轮藻是以假根固定在水底土壤中。
6)大型海藻 包括褐藻、红藻和绿藻。
①采集地点的选定：对海藻生活习性的观察和标本的采集，一般是在潮间带进行的。潮间带的采集简单，不需特殊设备。潮间带有岩礁、石缝、水峡、砂砾和其他各种各样的环境，所以在这里可找到这个地区的绝大部分种类。
潮间带处于海洋与陆地相联接的地带，是指大潮期间潮水涨得最高的水面和退至最低线之间的地区。一般绿藻主要生长在潮间带，褐藻、红藻多数生长在潮间带和潮下带。
②采集时间：海藻一年四季均有生长，但因季节不同，各种藻类的生长和分布亦各有不同。一般说，南方在每年三、四月，而北方在五、六、七月为采集海藻最适宜时期（四、五月是海藻生长最盛、种类最多的时候，六、七月则能采到有繁殖器官的藻体）。在这个期间，潮水涨落差度也大，便于观察和采集。
海水每日两次涨潮和退潮（有的地区例外），标本采集工作，最好在退潮时，跟随潮水退落时进行。农历每月初一至初三及十五到十八是大潮期间，潮水退得最低，这时在岩岸及岩池中进行采集标本工作，能采到生活于潮间带的各种海藻。
③采集工具：
采集桶和箱——采集桶最好用帆布做成，直径21厘米，高27厘米，外边围一只和桶等高的围兜，兜上再做二或三行大小不同的小兜，准备装个体大小不同的海藻。也可用塑料桶代替。普通用于高等植物采集标本的采集箱也可使用，但采集箱最好分为大小两格，以便把重要及稀少的标本与一般及大型的标本隔离开来。
凿子和铁锤——这类工具不宜太大，用于凿取牢固附着在岩石上的种类。
采集耙及捞网——适用于低潮线下或海浪冲击的地方，趁海水下退时，迅速地把海藻耙上来。耙柄由2～4节，一般长1～1.5米中空的铝质管子所组成，节处有按扣，可连接或拆开，以便携带。耙柄也可用钓鱼竿代用，把采耙拆下，换装上小网，即可组成简便的捞网，用以捞取漂浮的海藻。
其他工具可参考淡水藻采集。
2．标本的固定
最常用的固定剂是福尔马林（即40％甲醛溶液）或路哥氏碘液。如果标本只作一般形态、分类观察用，在用浮游生物网采到的水样中，加入福尔马林，使其含有4％浓度即可，同时可作长期保存。若是直接取水样沉淀浓缩，则用路哥氏碘液再加福尔马林最为适宜。在1L水样中加路哥氏碘液15mL，沉淀浓缩后，再加福尔马林使含有3％浓度即可。此外如FAA（常称为标准固定液）和铬酸醋酸固定液等也是常用的固定剂，对进一步进行藻体结构观察有良好效果。
几种常用固定液配方：
（1）路哥氏碘液：碘化钾6g溶于20mL水中）加碘4g，待溶解后再加入水80mL。
（2）FAA标准固定液：福尔马林5mL、醋酸5mL、50％或70％乙醇90mL。
（3）铬酸-醋酸固定液（在藻类上使用的为弱铬酸-醋酸液）；10％铬酸水溶液2.5mL、10％冰醋酸水溶液5mL，蒸馏水92.5mL。
3．标本制作
（1）玻片标本：对微小藻类，除不需作切片外，其他操作与高等植物相似。其基本步骤：一是杀生、固定，二是冲洗及脱水，三是染色，四是透明及封藏。以下介绍几种方法：
1）甘油封片制作法可分不染色与染色两种：
不染色方法——①标本用4％福尔马林固定，时间约12～24小时。②载玻片上滴一小滴10％甘油液，吸取沉淀于福尔马林液中标本，滴在甘油液中，用针轻轻搅动，使标本均匀散布。③将载玻片放在干燥器或其他容器内，注意防尘，使甘油中水分逐渐蒸发，时间随干燥情况而定。待甘油浓缩至原来一半时，即可加一滴20％甘油，再静置使水蒸发，然后再加40％甘油。待甘油浓缩至原来容量一半时，即可加盖玻片，仍使继续蒸发。④2～3天后，甘油近于无水状态，此时即可进行密封。⑤密封：需用洪氏两液，其配方为阿拉伯树胶20g、蒸馏水20mL、水合氯醛17g、甘油3mL、冰醋酸2mL。用毛笔沾上此液，涂在盖玻片四周边缘部分（约0.5～1mm），过1～2天，用刀轻轻刮去盖玻片四周不平整处，再用瓷漆在四周加固密封。
染色方法（材料以丝状绿藻为例）——①标本用弱铬酸-醋酸液固定24～48小时。②将材料倾入广口瓶中，瓶口用纱布包扎，然后在自来水龙头下冲洗（水量可小一些），以除去标本中固定液，时间至少24小时。③移入2％铁矾液中， 2小时。④再用自来水冲洗30～60分钟。⑤用0.5％海氏苏木色素染色3～24小时后，用水冲洗30分钟（苏木色素溶于蒸馏水中需10天，在这段时间中，需经常摇晃玻瓶，以加速溶解。此液配好后，需等二个月，待其自然氧化成氧化苏木色素后才能使用）。⑥用2％铁矾溶液分色，直到满意为止（如染色较浅，4～5分钟已足够）。再在水中冲洗约30～60分钟（冲洗必须彻底，否则封藏后仍继续分色，最后完全失去颜色而失败）。⑦将标本放于2％甘油中，以后根据不染色法使甘油水分蒸发，逐级加浓，加盖玻片，以洪氏两液密封和瓷漆加固。
2）甘油明胶法把含有藻类的一个水滴放在载玻片上，然后加上一滴3％甘油，用表面皿把标本盖上，再把标本拿到干燥地方放一昼夜，使水分蒸发。结果，藻类就停留在一薄层甘油中，然后把材料放入甘油明胶中。
甘油明胶用下列方法制备：先把4g明胶放在24mL蒸馏水中浸2～3小时，然后加入28g甘油和一小块石炭酸晶体。把这些东西倒入烧瓶中，再放在水浴器内煮热，直到明胶完全溶解为止。不要煮得太久，否则就不易凝固。如果甘油明胶在过滤后仍然混浊，那末要在溶解的甘油明胶中加入蛋白，使发生沉淀，再重新过滤。配成的甘油胶在冷却后应为透明的半固体，其粘度可使制成片子侧立在切片盒中时材料不往下沉落。如没有达到这样粘度，可能因为所用明胶质量不好或其他成分不纯。
把材料放入甘油明胶的方法如下：将经过甘油脱水的材料从甘油中取出，或不需脱水材料（质地较硬，不会发生变形的）从固定剂中取出，在吸水纸上放片刻。然后取适当份量放在洗净载玻片上。材料所占面积的直径不可超过1厘米（用大盖玻片的不在此限），愈小愈好，立刻加上一块甘油胶，甘油胶多少，因材料大小而不同，通常比火柴头稍大即可。在有深罩的100支光电灯下，用载玻片上的甘油胶融化，也可用酒精灯代替电灯，但不可使玻片上的温度升得太高。另外也可将整瓶甘油胶在温水中融化，用玻棒把一小滴甘油明胶加到玻片上，但此法有一个缺点，就是甘油胶一再融化容易变质。
用镊子去掉已融化甘油胶表面气泡，静置几分钟待其再度凝固，加上一片洗净盖片。用18或22mm方盖片，其大小视展开的甘油胶面积而决定。在盖片上轻压，使甘油胶展开成一薄层。在天气寒冷时，将手指在盖片上轻按片刻，使甘油胶能稍融化而展开，展开后的甘油胶应为圆形，位于玻片中央。盖上盖片，使载片保持水平状态，直到完全凝固为止，过1～2周后，用火漆或指甲漆封住盖片边缘。
甘油明胶装片法是简便的低等植物玻片标本制作法。除简便外，还有另一个优点，就是不需要乙醇和二甲苯。至少有四点好处：①经济；②省时间；③较易保存材料原色，尤其是蓝藻和绿藻的颜色；④材料不会发生明显收缩或变形。其中最后一点最重要，因为这一类材料在乙醇及二甲苯中特别容易变形。但这种方法有一个重要缺点，就是制成片子不能持久。即使在盖片边缘用加拿大胶或漆封得很好，在应用中仍不能象用加拿大胶作装片剂所制片子那样经久耐用。并且在制作时还需十分小心，不能让丝毫甘油胶溢出盖片外，否则封边时就封不密，因为甘油胶不易擦干净。
3）甘油胶-加拿大胶改良封片法此法是针对上述缺点加以改进。方法是在做好甘油胶装片后，且慢封片，而在盖玻片一边加一滴稀加拿大胶，任其自行渗入盖片下空处而围在甘油胶四周。需要注意加拿大胶只能在一处加入，并注意浓度要适当。如在盖片边缘上两处同时各加一滴胶，盖片下就容易保留空气而形成气泡。
在封得好的片子中，甘油胶与加拿大胶的交界处应该是一条整齐的交界线；封得稍差的交界线内外有油滴或水滴；更差的交界线屈曲如齿状，甚至杂有气泡。这些缺点的原因可能是：①载片或盖片未洗净，致使甘油胶在展开时边缘不齐（在制作这一类不染色玻片标本时，未用过的新盖片及载片经肥皂水洗过或煮过，再用清水多次冲洗就可，不必用清洗液洗）。②加入加拿大胶后，盖片下有气泡，用针将气泡压出不尽时，可产生上述缺点。
（2）大型藻类的浸制标本：
1）固定液的配制
①4～5％福尔马林固定液：福尔马林5mL，甘油5mL，水（海水，或用淡水1000mL加30g食盐代替海水）90～95mL。此液适于一般藻类，特别是适于褐藻的固定用。
②福尔马林-酒精固定液：福尔马林4mL，酒精36mL，水（或海水）60mL。此液适于绿藻、石灰质藻类和粘质藻类，特别是有些红藻的固定。
在上述固定液配好后，应加入少许苏打，以中和由福尔马林分离出来的蚁酸。少数重要标本，还可加入 1％甘油，以防止固定液蒸发，而引起组织破坏。
2）标本的固定液浸保存的标本也要洗净，挑选藻体完整、有生殖器官（在繁殖季节）的标本来泡制，选适合大小的标本瓶或管为容器，最好以活的藻体来固定。标本的容量一般不要超过固定液容量的1/2～2/3。这些固定液同时也是良好的保存液。
所采到的标本，如一时不能制作，对于质地硬的大型种类放在通风处，使其自行干燥，不宜放在阳光下晒干，以免褪色。风干后收存起来，以待日后用开水泡开，再行制作。
标本制作好，应贴上标签，注明标本号码、学名、采集地点、日期、生活习性和采集者，以供日后参考。
（3）蜡叶标本的制作：有的固着生藻类含有胶质，尤其一些中大型的，制成蜡叶标本是一个很好的方法。
1）制作用具
标本盘——一般用28号镀锌白铁做成48×34×4.5立方厘米卷边盘。若无特制的标本盘，也可用适当大小的白瓷盘及玻璃板代用。
吸水纸——通常以4～6张毛边纸，用线合钉好以备用。大小可酌情而定，一般以42×31平方厘米较为适合。
纱布——用质量较好的纱布，大小应与吸水纸一样。
标本纸——一般以100～130磅的道林纸为最适宜。因采到的藻类标本大小不同，所用的标本纸也相应有大小的差别。普通常用的有六种大小不同的规格：1号标本纸39×27cm2；2号为1号的一半，即27×19.5cm2，以此类推。
台纸——用重磅道林纸裁成 42×30平方厘米大小，以备贴整理好的腊叶标本用。
镊子——因用尖头镊子在做标本时很容易划破标本纸，故以10cm钝头的镊子为宜。
标本夹——每副二个，一般用46×34cm2，为两条方木条（每根43×3.5×2.5cm3）和5～7根扁木条（46×4×1cm3）组成，在两根方木条的两端各留约4cm，并刻一凹槽，便于用绳捆扎。
报纸——较大型而不带粘性的标本，如马尾藻、圈扇藻等，为了节约标本纸，可用报纸夹，这样制作起来也很方便。
2）制作过程
标本的清洗与挑选——将采来的标本，先用水（海藻用海水）洗净，然后按种类分别放在盛有水的水盆内，挑选藻体完整及有生殖器官的（在繁殖季节）、好的标本放在盆边上，准备用来做蜡叶标本或液浸标本。
制作标本用水——制作海藻标本时，标本盘内所放的水，一般用一半海水加一半淡水，但对某些耐淡水强的海藻如浒苔、紫菜等可全部用淡水。而对有些接触淡水容易死亡的种类如软骨藻、红翎菜等，则全部应用海水，以免由于死亡而色素游离出来、以影响标本的质量。
蜡叶标本制作法——标本采回后，应先将藻体柔软、脆弱、容易腐败或罕见的种类做成标本。选出3～5株藻体完整的标本放在盛有水的容器内，用毛笔轻轻刷去附在藻体上的泥沙和杂物。而后移入盛有水的白瓷盘内，将编好号码适合藻体大小的标本纸，一般用重磅道林纸放入水中，套在标本下面，用镊子或毛笔把标本按其自然状态展开在标本纸上。然后慢慢地将标本纸从水中托起，贴于斜立的木板或玻璃板上，流去多余水分后，再放在吸水纸上，在标本上盖上一层纱布和三、四张吸水纸。待标本做完，叠好后，用标本夹夹紧，并放上重物以加适当的压力，便于加快干燥。每天至少换干吸水纸1～2次，大约6～7天标本就可完全干燥。