正交实验优化重楼皂苷Ⅰ的微波提取工艺.pdf

w w w h x y s w g c c o m ,V o l N o 化学与生物工程C h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g 基金项目:陕西省科技厅项目(J M ),西安医学院博士启动项目(D O C ),国家级大学生创新创业训练计划项目()收稿日期:作者简介:张雪娇(),女,河南扶沟人,副教授,研究方向:中药有效成分的提取分离、含量测定及分析测试,E m a i l:x u e j i a o_z h a n g c o m.D O I:/j i s s n 张雪娇,王月,范涛,等正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺J化学与生物工程,():Z HAN GXJ,WAN GY,F ANT,e t a l O p t i m i z a t i o n i nm i c r o w a v ee x t r a c t i o np r o c e s so fp o l y p h y l l i n b yo r t h o g o n a l e x p e r i m e n tJC h e m i s t r y&B i o e n g i n e e r i n g,():正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺张雪娇,王月,范涛,成昭(西安医学院药学院,陕西 西安 )摘要:在单因素实验的基础上,通过正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺.确定最佳提取工艺为:乙醇体积分数、微波功率 W、微波温度、微波时间 m i n、料液比(g m L),在此条件下,重楼皂苷提取率达到 .该方法操作简单、省时、高效,可用于重楼皂苷的提取.关键词:重楼皂苷;微波提取;正交实验中图分类号:T Q R O p t i m i z a t i o n i nM i c r o w a v eE x t r a c t i o nP r o c e s so fP o l y p h y l l i nb yO r t h o g o n a lE x p e r i m e n tZ H A N GX u e j i a o,WA N GY u e,F A NT a o,C H E N GZ h a o(C o l l e g e o fP h a r m a c y,X i a nM e d i c a lU n i v e r s i t y,X i a n ,C h i n a)A b s t r a c t:W eo p t i m i z e dt h em i c r o w a v ee x t r a c t i o np r o c e s so fp o l y p h y l l i n b yo r t h o g o n a le x p e r i m e n t so nt h eb a s i so f s i n g l e f a c t o r e x p e r i m e n t s T h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s a r ed e t e r m i n e da s f o l l o w s:t h e e t h a n o lv o l u m e f r a c t i o no f,t h em i c r o w a v ep o w e ro f W,t h em i c r o w a v et e m p e r a t u r eo f ,t h em i c r o w a v et i m eo f m i n,a n dt h es o l i d l i q u i dr a t i oo f(gm L)U n d e ra b o v ec o n d i t i o n s,t h ee x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h y l l i nc a nr e a c h T h i sm e t h o d i s s i m p l e,t i m e s a v i n g,a n de f f i c i e n t,w h i c hc a nb eu s e d f o r t h e e x t r a c t i o no fp o l y p h y l l i nK e y w o r d s:p o l y p h y l l i n;m i c r o w a v ee x t r a c t i o n;o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t重楼是一种传统中药材,通常以根茎入药,具有消肿止痛、凉肝定惊等功效,常用于治疗蛇虫咬伤、跌扑伤痛、疔疮痈肿等症.药理学研究发现,重楼的主要活性成分甾体皂苷具有抗菌消炎、镇痛止血及抗肿瘤等药理活性,其中重楼皂苷的抗肿瘤活性已成为研究热点.邓碧凡等通过MT T法检测发现,重楼皂苷对低氧条件下的喉癌H e p 细胞增殖具有明显的抑制作用;陈舒怡等研究发现,重楼皂苷可通过线粒体破碎快速诱导肺癌N C I H 细胞的凋亡;庞晓辉等研究发现,结肠癌耐奥沙利铂细胞经重楼皂苷处理后,其B a x和C a s p a s s 蛋白表达水平有所升高,进而介导癌细胞及其耐药细胞的凋亡.重楼皂苷的提取一般采用有机溶剂回流法,以乙醇为提取溶剂,易操作、成本低,但提取率较低 .童立雷等利用纤维素酶对植物细胞壁的破碎作用,以 乙醇为提取溶剂,采用超声辅助酶法提取重楼总皂苷,并通过响应面法优化提取工艺;刘江等采用正交实验优化了南重楼中种重楼皂苷的超声提取工张雪娇,等:正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺/年第期 艺,并对优化工艺进行了方法学考察.近年来,微波法越来越多地应用于中药活性成分的提取 .因此,作者采用微波法提取重楼皂苷,并通过正交实验优化提取工艺,为重楼药材的深入开发利用提供参考.实验 材料、试剂与仪器重楼,采自陕西汉中镇巴山区,经西安医学院药学院生药教研室张彦副教授鉴定为百合科重楼属植物的干燥根茎.重楼皂苷对照品(),优级纯,宝鸡辰光生物科技有限公司;乙醇、无水甲醇,分析纯,天津欧博凯化工有限公司;甲醇、乙腈,优级纯,天津科密欧化学试剂有限公司;实验用水为去离子水.A g i l e n t 型 高效液相色谱仪(C 色谱柱,mm mm),美国A g i l e n t科技有限公司;XH A型电脑微波超声波组合合成萃取仪,北京祥鹄科技发展有限公司;A L C 型电子天平,北京赛多利斯科技仪器有限公司;微孔滤膜(m),天津杉羽科技有限公司;S H Z D()型循环水式真空泵,巩义予华仪器有限责任公司.重楼皂苷的提取重楼自然晾干,烘至恒重,粉碎过筛,得粗粉,置于干燥器储存备用.称取 g重楼粗粉置于 m L洁净干燥的三颈烧瓶中,加入一定量的乙醇,在萃取仪中提取一定时间,冷却至室温,抽滤,滤液用乙醇定容至 m L容量瓶中,即得重楼皂苷提取液.重楼皂苷的微波提取工艺优化采用单因素实验,分别考察乙醇体积分数、微波功率、微波温度、微波时间和料液比对重楼皂苷提取率的影响.在单因素实验的基础上,固定微波功率为 W,选择乙醇体积分数(A)、微波温度(B)、微波时间(C)和料液比(D)为考察因素,以重楼皂苷提取率为评价指标,设计因素水平正交实验,进一步优化重楼皂苷的微波提取工艺.重楼皂苷提取率的测定 色谱条件A g i l e n tC 色谱柱;流动相为乙腈水(,体积比);检测波长 n m;体积流量m Lm i n;柱温.重楼皂苷标准曲线的绘制精密称取重楼皂苷对照品 m g,用甲醇溶解后定容于m L容量瓶中,摇匀,得浓度为 m gm L的重楼皂苷对照溶液.分别准确吸取L、L、L、L、L重楼皂苷对照溶液,按 色谱条件进样分析,记录峰面积,以重楼皂苷含量(x,g)为横坐标、峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线(图),拟合得线性回归方程:y x ,R .表明重楼皂苷含量在 g范围内与峰面积线性关系良好.0.0 2.00 4.00 6.00 8.00?/g40003500300025002000150010005000?yxR=437.88+39.4=0.99652图重楼皂苷的标准曲线F i g S t a n d a r dc u r v eo fp o l y p h y l l i n 重楼皂苷提取率的计算移取适量重楼皂苷提取液,经 m微孔滤膜过滤;准确吸取 L,按 色谱条件进样分析,记录峰面积,根据标准曲线方程计算重楼皂苷含量,按下式计算重楼皂苷提取率():m(V )m粉 式中:m为重楼皂苷的质量,g;V为重楼皂苷提取液体积,m L;m粉为重楼粗粉的质量,g.结果与讨论 H P L C图谱准确吸取 L重楼皂苷对照溶液,按 色谱条件进样分析,H P L C图谱如图所示.单因素实验结果 乙醇体积分数的选择固定微波功率 W、微波温度 、微波时间 m i n、料液比(gm L,下同),考察乙醇体积分数(、)对重楼皂苷提取率的影响,结果如图所示.由图可知,随着乙醇体积分数的增加,重楼皂苷提取率先升高后降低;当乙醇体积分数为 时,提取率达到最高.可能是因为,乙醇体积分数较大时,重楼粗粉中其它成分的溶出量增加,导致提取率降低.张雪娇,等:正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺/年第期 300250200150100500mAU02 4 6 8 10 12 14t/min?图重楼皂苷对照溶液的H P L C图谱F i g H P L Cs p e c t r u mo fp o l y p h y l l i nc o n t r o l s o l u t i o n40 50 60 70 80 90 100?/%6543210?/%图乙醇体积分数对重楼皂苷提取率的影响F i g E f f e c t o f e t h a n o l v o l u m e f r a c t i o no ne x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h y l l i n因此,选择、作为正交实验乙醇体积分数的个水平.微波功率的选择固定乙醇体积分数、微波温度、微波时间 m i n、料液比,考察微波功率(W、W、W、W、W)对重楼皂苷提取率的影响,结果如图所示.6543210?/%100150 200 250 300 350 400?/W图微波功率对重楼皂苷提取率的影响F i g E f f e c t o fm i c r o w a v ep o w e ro ne x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h y l l i n由图可知,随着微波功率的增大,重楼皂苷提取率先升高后降低;当微波功率为 W时,提取率达到最高.可能是因为,增大微波功率加速了对细胞壁的破碎作用,提高了活性成分的溶出率,提取率相应升高;但微波功率过大时,会引起植物组织内部的微小导管因凝固而闭塞,使活性成分的溶出受到抑制,导致提取率降低.当微波功率从 W增至 W时,提取率变化不明显,但微波功率较大时更有利于活性成分的溶出.因此,选择最佳微波功率为 W.微波温度的选择固定乙醇体积分数、微波功率 W、微波时间 m i n、料液比,考察微波温度(、)对重楼皂苷提取率的影响,结果如图所示.6543210?/%30 40 50 60 70 80 90?/图微波温度对重楼皂苷提取率的影响F i g E f f e c t o fm i c r o w a v e t e m p e r a t u r eo ne x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h y l l i n由图可知,随着微波温度的升高,重楼皂苷提取率先升高后降低;当微波温度为 时,提取率达到最高.这是因为,升高温度有利于提取溶剂对活性成分的溶解和扩散;但温度过高时,不但会影响活性成分的稳定性,而且会使重楼粗粉中其它成分的溶出量增加.因此,选择、作为正交实验微波温度的个水平.微波时间的选择固定乙醇体积分数、微波功率 W、微波温度 、料液比,考察微波时间(m i n、m i n、m i n、m i n、m i n)对重楼皂苷提取率的影响,结果如图所示.由图可知,随着微波时间的延长,重楼皂苷提取率先升高后略微降低;当微波时间为 m i n时,提取率达到最高.这是因为,延长微波时间有利于植物细胞的破碎,进而有利于活性成分的溶出;但微波时间过长时,其它成分的溶出量也增多.因此,选择 m i n、m i n、m i n作为正交实验微波时间的个水平.料液比的选择固定乙醇体积分数、微波功率 W、微波张雪娇,等:正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺/年第期 87654321?/%10 15 20 25 30 35 40?/min图微波时间对重楼皂苷提取率的影响F i g E f f e c t o fm i c r o w a v e t i m eo ne x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h y l l i n温度、微波时间 m i n,考察料液比(、)对重楼皂苷提取率的影响,结果如图所示.6543210?/%?：/(g mL)1 5：1 10：1 15：1 20：1 25：1 30：图料液比对重楼皂苷提取率的影响F i g E f f e c t o f s o l i d l i q u i dr a t i oo ne x t r a c t i o nr a t eo fp o l y p h y l l i n 由图可知,随着料液比的减小,即溶剂用量的增加,重楼皂苷提取率先升高后降低;当料液比为 时,提取率达到最高.这是因为,当溶剂用量增加时,活性成分扩散到溶剂中的机会增多,提取率相应升高.因此,选择、作为正交实验料液比的个水平.正交实验结果正交实验结果与分析见表,方差分析见表.由表、表可知,各因素对重楼皂苷提取率影响的大小顺序为:微波温度(B)乙醇体积分数(A)料液比(D)微波时间(C).微波温度和乙醇体积分数对重楼皂苷提取率的影响显著,而料液比和微波时间的影响不显著.最佳提取工艺组合为ABCD,即乙醇体积分数、微波温度 、微波时间 m i n、料液比.工艺验证在上述最佳工艺条件下进行次验证实验,重楼皂苷提取率分别为 、,平均提表正交实验结果与分析T a b R e s u l t sa n da n a l y s i so fo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s序号A乙醇体积分数B微波温度C微波时间m i nD料液比g m L提取率 k k k R 表方差分析T a b A n a l y s i so f v a r i a n c e方差来源偏差平方和自由度均方F比显著性A P B P C D 误差 注:F (,),F (,).取率为 ,相对标准偏差(R S D)为 ,说明实验结果可靠.结论通过H P L C法测定重楼皂苷含量,以重楼皂苷提取率为评价指标,采用单因素实验结合正交实验优化了重楼中活性成分重楼皂苷的微波提取工艺.确定最佳提取工艺为:乙醇体积分数、微波功率 W、微波温度、微波时间 m i n、料液比(gm L),在此条件下,重楼皂苷提取率达到 .该方法操作简单、省时、高效,可用于重楼皂苷的提取.参考文献:张秋萍,毕慧欣,谢琳重楼的药理作用及其临床应用研究进展J医学综述,():Z HAN GQP,B IHX,X I EL R e s e a r c ha d v a n c e s i np h a r m a c o l o g i 张雪娇,等:正交实验优化重楼皂苷的微波提取工艺/年第期 c a l a c t i o na n dc l i n i c a l a p p l i c a t i o n so fP a r i sp o l y p h y l l aJ M e d i c a lR e c a p i t u l a t e,():邓碧凡,廖敏,邱荣敏,等重楼皂苷对低氧喉癌H e p 细胞增殖和H I F 、V E G F表达的影响J安徽医科大学学报,():D E N GBF,L I A O M,Q I UR M,e t a l E f f e c to fp o l y p h y l l i n o np r o l i f e r a t i o na n de x p r e s s i o n so fH I F ,V E G Fi n l a r y n g e a l c a r c i n o m ac e l l l i n eH e p u n d e r h y p o x i aJ A c t aU n i v e r s i t a t i sM e d i c i n a l i sA n h u i,():陈舒怡,沈自尹,黄建华,等重楼皂苷通过线粒体碎裂诱导人肺癌N C I H 细胞 凋亡 J中 华 中 医 药 杂 志,():C HE NSY,S HE NZY,HUAN GJH,e t a l P o l y p h y l l i ni n d u c i n ga p o p t o s i so f h u m a n l u n gc a n c e rN C I H c e l l sb ym i t o c h o n d r i a l f r a g m e n t a t i o nJ C h i n a J o u r n a l o fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n ea n dP h a r m a c y,():庞晓辉,王朝杰,崔勇霞,等重楼皂苷对结肠癌耐奥沙利铂细胞株的毒 性 研 究 J胃 肠 病 学 和 肝 病 学 杂 志,():P AN GX H,WANG CJ,C U IY X,e ta l S t u d yo nt o x i c i t yo fp o l y p h y l l i n o nc o l o nc a n c e rc e l l l i n e sr e s i s t a n tt oO x a l i p l a t i nJ C h i n e s eJ o u r n a lo fG a s t r o e n t e r o l o g ya n dH e p a t o l o g y,():郭莉萍,陈雨,邹卉瑜,等基于均匀设计优化重楼皂苷提取工艺J常熟理工学院学报(自然科学),():,GUOLP,C HE NY,Z OU H Y,e t a l T h eo p t i m i z a t i o no f t h ee x t r a c t i n gp r o c e s sf o rs t e r o i d a ls a p o n i nf r o mP a r i sp o l y p h y l l ab a s e do nu n i f o r m d e s i g nJ J o u r n a lo fC h a n g s h uI n s t i t u t eo fT e c h n o l o g y,():,王仕宝,苏莹,李会宁,等响应面法优化重楼药材中甾体皂苷的回流提取工艺研究J陕西农业科学,():童立雷,蔡荟梅酶法提取重楼中总皂苷工艺研究J农产品加工学刊,():T ON GLL,C A IH M E n z y m a t i ce x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo ft o t a ls a p o n i n s i nP a r i sJ A c a d e m i cP e r i o d i c a lo fF a r mP r o d u c t sP r o c e s s i n g,():刘江,段志刚,段宝忠,等南重楼中种重楼皂苷超声提取工艺J安徽农业科学,():L I UJ,D UANZG,D UANBZ,e ta l U l t r a s o n i ce x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo f f o u r k i n d s o f p o l y p h y l l i n i nP a r i s v i e t n a m e n s i sJ J o u r n a l o fA n h u iA g r i c u l t u r a lS c i e n c e 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i z o m ao nb o n em e t a b o l i s ma n db i o m e c h a n i c s i no s t e o p o r o s i s r a t sJ H e b e i J o u r n a l o fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e,():杨森,潘亚磊,李引刚,等飞天蜈蚣七提取物对大鼠成骨细胞的保护作用及对W n t/c a t e n i n信号通路的调节作用J中南药学,():YAN GS,P ANYL,L IYG,e ta l P r o t e c t i v ee f f e c to fe x t r a c to fA r a l i a c h i n e n s i sL o no s t e o b l a s t s i nr a t sa n dr e g u l a t i o no fWn t/c a t e n i ns i g n a l i n gp a t h w a yJ C e n t r a l S o u t hP h a r m a c y,():杨军,张小莉,刘仕杰,等齐墩果酸对去卵巢骨质疏松症雌鼠的疗效及机理研究J时珍国医国药,():S HU B,Z HA O YJ,WAN G YJ,e ta l O l e a n o l i ca c i de n h a n c e sm e s e n c h y m a ls t r o m a lc e l lo s t e o g e n i cp o t e n t i a lb yi n h i b i t i o no fn o t c hs i g n a l i n gJ S c i e n t i f i cR e p o r t s,:D I N GYJ,Z HA OQ,WAN GLF,e t a l P r o a p o p t o t i c a n da n t i i n f l a mm a t o r ye f f e c t so f a r a l o s i d eAo nh u m a nr h e u m a t o i da r t h r i t i sf i b r o b l a s t l i k es y n o v i o c y t e sJ C h e m i c o B i o l o g i c a lI n t e r a c t i o n s,:崔大江,杨渭临,李秀丽太白楤木总皂苷体外对乙肝病毒H B s A g、H B e A g的影响J同济大学学报(医学版),():C U IDJ,YAN G W L,L IXL I n h i b i t o r ye f f e c t so f t o t a l s a p o n i ne x t r a c t e d f r o mA r a l i a c h i n e s i sL o nh e p a t i t i s v i r u sBi n v i t r oJJ o u r n a lo fT o n g j iU n i v e r s i t y(M e d i c a lS c i e n c e),():XUY,L I UJY,Z E N GYL,e t a l T r a d i t i o n a l u s e s,p h y t o c h e m i s t r y,p h a r m a c o l o g y,t o x i c i t ya n dq u a l i t yc o n t r o l o fm e d i c i n a lg e n u sA r a l i a:a r e v i e wJ J o u r n a lo f E t h n o p h a r m a c o l o g y,: