镇江香醋醋酸发酵阶段细菌的垂直分布与富集培养.pdf

崔运来，张徽，李玉龙，等.镇江香醋醋酸发酵阶段细菌的垂直分布与富集培养 J.食品工业科技，2023，44（18）：193199.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110197CUI Yunlai,ZHANG Hui,LI Yulong,et al.Vertical Distribution and Enrichment Culture of Bacteria in the Acetic Acid FermentationStage of Zhenjiang Aromatic VinegarJ.Science and Technology of Food Industry,2023,44(18):193199.(in Chinese with Englishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022110197 生物工程 镇江香醋醋酸发酵阶段细菌的垂直分布与镇江香醋醋酸发酵阶段细菌的垂直分布与富集培养富集培养崔运来，张徽，李玉龙，罗少波，宁雪悦，田佳蓓，韩冬*（江苏科技大学粮食学院，江苏镇江 212100）摘要：酿造食醋的口感和风味与发酵微生物密切相关，为了探究镇江香醋醋酸发酵阶段细菌群落在垂直方向中的分布及其规律，并研究不同培养基对醋醅中可培养细菌的富集作用。本研究通过高通量测序对醋醅和富集培养样品的细菌多样性进行测定。结果表明，表层、中层和底层醋醅样品的 OTU 数量分别为 66、76 和 111 个，表层醋醅的优势细菌为 Acetobacter，中层和底层醋醅的优势细菌为 Lactobacillus，细菌的菌群丰富度和多样性随着发酵缸深度变深而更丰富和多样。同时，富集后的高通量测序表明，寡营养培养基比富营养培养基富集的细菌多样性更高。本研究揭示了镇江香醋醋醅在垂直方向细菌分布存在差异，同时提出一种寡营养细菌分离的培养基，为醋醅中发酵微生物的高效分离提供思路。关键词：镇江香醋，垂直结构，细菌多样性，富集培养本文网刊:中图分类号：TS201.3 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）18019307DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2022110197VerticalDistributionandEnrichmentCultureofBacteriaintheAceticAcidFermentationStageofZhenjiangAromaticVinegarCUIYunlai，ZHANGHui，LIYulong，LUOShaobo，NINGXueyue，TIANJiabei，HANDong*（School of Grain Science and Technology,Jiangsu University of Science and Technology,Zhenjiang 212100,China）Abstract：The taste and flavor of fermented vinegars are closely related to the fermentation microorganisms.In order toinvestigate the vertical distribution of bacterial community in the acetic acid fermentation stage of Zhenjiang aromaticvinegar,and to investigate the enrichment effect of different media on the culturable bacteria from Cupei.In this study,thebacterial diversity of Cupei and enriched culture samples were determined by high-throughput sequencing.The resultsshowed that the number of OTUs in the surface,middle and bottom Cupei samples were 66,76 and 111,respectively.Thedominant bacterium in the surface layer was Acetobacter,while the dominant bacterium in the middle and bottom layerswas Lactobacillus.The richness and diversity of bacterial flora became more abundant and diverse with the depth offermentation.Meanwhile,high-throughput sequencing after enrichment showed that the oligotrophic medium enrichedhigher bacterial diversity than the nutrient-rich medium.This study revealed that there were differences in bacterialdiversity in different depths of Cupei.And it also proposed an oligotrophic medium for bacterial isolation to make isolationof fermentation microorganisms from Cupei more efficient.Keywords：Zhenjiang aromatic vinegar；vertical structure；bacterial diversity；enrichment culture 镇江香醋作为中国四大名醋之一，具有“酸而不涩，香而微甜、色浓味解”特色1，富含氨基酸、多种有机酸2，含有四甲基吡嗪等功能成分3，受到了大众的喜爱。镇江香醋是以糯米、麸皮和大糠为主要原 收稿日期：20221117 基金项目：国家自然科学基金（32200012）；江苏省高等学校基础科学（自然科学）研究项目（22KJB180016）；江苏科技大学科研启动基金。作者简介：崔运来（2002），男，本科，研究方向：粮食发酵，E-mail：。*通信作者：韩冬（1989），女，博士，讲师，研究方向：食品微生物资源，E-mail：。第 44 卷 第 18 期食品工业科技Vol.44 No.182023 年 9 月Science and Technology of Food IndustrySep.2023 料，经过糖化、酒精发酵、固态分层的醋酸发酵、封醅、加炒米色淋醋等特殊工艺制作，经陶坛密封陈酿而成的食醋4。醋酸发酵阶段以酒精度约为 7%的酒醪、麸皮和大糠为原料5，选用发酵第 7 d 醋醅进行接种6，发酵周期约 21 d。每天翻醅，发酵前 7 d，每日翻醅深度为 710 cm，使接种于表层的种醅逐层扩培，发酵 7 d 后，每天翻醅到缸底，俗称“露底”，此时醋醅中的微生物组成与接种的种醅高度相似7。翻醅工序是将各种微生物充分混匀，以控制发酵醅温和混入氧气8，有利于的好氧微生物生长和乙醇氧化生产乙酸9。当卤水酸度不再升高，代表醋酸发酵阶段结束，用食盐和塑料薄膜将醋醅封实，隔绝空气，防止部分醋酸菌进一步将醋酸过氧化，影响得率，同时封醅有利于食醋风味品质的提高10。镇江香醋的酿造方式是开放型混合多菌种分层发酵，由于复杂多样的微生物群落，在不同微环境的发酵作用，使酿制的香醋风味独特11。近年来高通量测序技术作为良好的微生物群落研究手段，受到广泛应用1213。许多研究者以高通量测序技术对不同食醋发酵过程中的微生物群落的结构以及演变规律进行研究，揭示了不同微生物类群与食醋风味之间的关系。在对镇江香醋的研究中，Wang 等14通过扩增子测序研究了镇江香醋中与风味相关的核心微生物，Wu 等15通过宏基因测序建立了镇江香醋微生物物种相关的风味代谢网络，并通过功能微生物的原位强化用于提高乙偶姻含量，Huang 等16通过扩增子测序探究了发酵剂和环境变量对镇江香醋发酵微生物和香醋风味的影响，并指出细菌是醋醅的优势微生物。我国其他特色酿造食醋的微生物区系也有报道，如山西老陈醋、四川麸醋、凉州熏醋、浙江玫瑰醋等1722。但是以制醋缸中醋醅的垂直结构分类的微生物的分布还未见报道。在固态醋酸发酵中，由于醋醅原料属于非均相状态，不仅随发酵时间微生物存在群落演替，在空间上也存在微生物分布差异，现有研究鲜有从空间分布角度对发酵微生物分布的揭示。本研究以传统手工工艺制作镇江香醋为研究对象，通过高通量测序，揭示醋醅垂直结构细菌群落区系组成，并比较了菌株富集和分离有效培养基。本研究可为固态食醋醋酸发酵中的垂直结构的细菌分布和变化提供理论支撑，从而完善不同空间分布的微生物的发酵机理，进而有利于发酵过程的精准控制，指导翻醅工艺。同时为分离醋醅中特定种属微生物，提供采样来源和培养基的选择参考。1材料与方法 1.1材料与仪器醋醅样品以传统工艺发酵镇江香醋；土壤DNA 提取试剂盒广州美基生物科技有限公司；PCR 扩增引物上海生工生物工程技术服务有限公司；培养基所用试剂国药集团。H3-18KR 台式高速冷冻离心机湖南可成仪器设备有限公司；DW-HL340 超低温冰箱中科美菱低温科技股份有限公司；BJ-1CD 净化工作台上海博讯医疗生物仪器股份有限公司；sQ810C 立式压力蒸汽灭菌器雅马拓科技贸易有限公司；THZ-98A恒温振荡器上海一恒科学仪器有限公司；T100PCR 仪美国伯乐。1.2实验方法 1.2.1 样品采集在发酵缸（总容积为 350 kg）五点取样法（即四个顶点以及中心位置）自上而下取出距顶部 10 cm，30 cm 以及发酵缸底部 10 cm 的醋醅并分层充分混匀，然后通过四分法舍去多余的醋醅，在3 个平行的发酵缸中分别取发酵第 7 d 醋醅样品，等质量混合，分别记为 BC、ZC 和 DC；种醅（ZP）则为发酵第 7 d 时，醋醅自上而下的混合醋醅。1.2.2 样品中基因组 DNA 提取使用土壤 DNA 提取试剂盒，取 0.5 g 混合均匀的醋醅样本在 2.0 mL厚壁离心管中，加入 0.10.6 mm 的玻璃微珠和裂解液进行匀浆裂解。90 水浴进一步裂解 10 min，裂解后的样本通过高速离心去除固体杂质。最后利用醇沉法以及硅胶柱纯化技术对澄清的裂解液进行过柱、洗涤等操作，最后用无菌水洗脱从而获取高产量高纯度的总 DNA。1.2.3 PCR 扩增及纯化扩增细菌的 16S rDNA 的V3V4 可变区，总扩增体系为 25 L，以提取的醋醅中总 DNA 为模板（1 L），使用 TransStart FastpfuDNA 聚合酶（0.5 L），引物 341F（CCTAYGGGRBGCASCAG）和 806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）（各 1 L），2.5 mmol/L dNTPs 2 L，5X Trans-Start Fastpfu Buffer 5 L。PCR 条件，95 2 min，变性 95 20 s，退火 55 30 s，延伸 72 30 s，最终延伸 72 5 min，保持 30 个循环。PCR 扩增产物使用 1%琼脂糖凝胶电泳检测，合格样品使用磁珠纯化。1.2.4 Illumina HiSeq 平台测序构建测序文库主要用的试剂盒是 Illumina 公司的 TruSeq Nano DNALT Library Prep Kit。在上机测序前用 Agilent HighSensitivity DNA Kit 对文库进行质量检验，使用Illumina NovaSeq 6000 测序仪上进行双端测序，由上海融享生物科技有限公司完成。1.2.5 样品富集培养分别称取 5 g 种醅样品，无菌接种于装有 100 mL 寡营养液体培养基（蛋白胨 0.5 g，酸水解酪蛋白 0.5 g，酵母浸粉 0.5 g，可溶性淀粉 0.5 g，葡萄糖 0.5 g，丙酮酸钠 0.3 g，乙酸钠 0.2 g，磷酸氢二钾 2 g，硫酸镁 0.2 g，硫酸锰 0.05 g，调节 pH至 7.0）和富营养液体培养基（MRS 培养基 pH7.0）的三角瓶中，振荡混匀，置于恒温箱内 30 静置培养48 h。培养混合物经离心（4，10000 r/min，10 min），沉淀物用于基因组提取和高通量测序。种醅样品记为 ZP，经寡营养培养基富集物记为 GY，经富营养培 194 食品工业科技2023 年 9 月养基富集物记为 FY。1.3数据处理二代数据处理流程：首先使用 Trimmomatic（version 0.33）质 量 过 滤 原 始 数 据，用 Cutadapt（version 1.9.1）进行引物序列的识别与去除，其后使用 FLASH（version 1.2.11）对双端 reads 进行拼接并去除嵌合体（UCHIME，version 8.1），最终得到高质量的序列用于后续分析。测序序列利用 HiSeq 平台对 16S 的 V3V4 区域测序并按照中间 overlap 方式进行拼接，使用USEARCH（version 10.0）序列分析软件把序列的以97%的相似性进行 OTU 注释，与参考数据库比对，将测序序列数的 0.005%作为过滤 OTUs 的阈值。使用 QIIME 软件进行 Alpha 指数、Beta 多样性分析23。使用 R 语言和 Graphpad 7 软件做进一步的可视化展示。2结果与分析 2.1镇江香醋不同深度发酵醋醅细菌多样性 2.1.1 OTU 分布通过高通量测序分析手工发酵镇江香醋不同发酵深度细菌多样性，测序共获得185413 条有效读长序列，共计 118 个 OTU，其中样品 BC 的 OTU 数目为 66 个，样品 DC 的 OTU 数目为 111 个，样品 ZC 的 OTU 数目为 76 个。各 OTU在样品中分布见图 1，BC 与 DC 共有 62 个 OTU，BC 与ZC 共有59 个OTU，ZC 与DC 共有71 个OTU，三者共有OTU 数目为57 个，占总OTU 个数的48.31%。而不同深度的醋醅中各含有特有 OTU，数目分别为，BC 2 个，ZC3 个，DC 含有最多的特有 OTU 数量为35 个。这表明不同深度醋醅中细菌的物种组成部分相似性，但不同深度微环境中含有特有的一些细菌类群，底层醋醅微生物种类最高。BCDCZC2214557335图 1 不同深度发酵醋醅样品细菌的 OTU 分布图Fig.1 OTU distribution of bacteria in Cupei fermented atdifferent depths 将测序序列经物种注释后，各样品的不同分类学水平下物种数量见表 1。从门、纲、目、科、属级分类水平上都是随着醋醅自上而下深度的增加物种数量越多。表 1 不同深度醋醅中各分类水平下物种统计结果Table 1 Distribution of bacteria in Cupei fermented at differentdepths by different taxonomic level样本界门纲目科属BC145162440ZC178223146DC1913314666总计1913324770 镇江香醋醋醅中细菌在门水平上主要由变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteriota）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteriota）、疣微杆菌门（Verruco-microbiota）、浮霉菌门（Planctomycetota）、异常球菌门（Deinococcota）、弯曲杆菌门（Campilobacterota）组成，其中变形菌门（Proteobacteria）在样品 BC 中含量最高，平均相对丰度百分比为 79.80%；样品ZC 和 DC 中厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌门，丰度分别为 64.42%和 50.17%。镇江香醋醋醅中细菌在属水平分布如图 2 所示，醋醅中主要包含乳杆菌属（Lactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、土壤杆菌属（Agrobacterium）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、泛生菌属（Pantoea）、短杆菌属（Curtobacterium）、甲基杆菌属（Methylobacterium）、假单孢菌属（Pseudomonas）、新鞘脂菌属（Novosphin-gobium）的细菌。黄婷7在对镇江香醋（恒顺制醋车间 20182019）发酵阶段细菌的扩增子测序发现平均丰度超过 10%为醋酸乳杆菌属（Acetilactobacillus）、醋酸杆菌属（Acetobacter）、不动杆菌属（Acineto-bacter）、气单胞菌属（Aeromonas）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）和假单胞菌属（Pseudomonas）7；王宗敏24在对镇江香醋（恒顺制醋车间 2014）发酵阶段 BCZCDC相对丰度(%)10080604020AgrobacteriumAcetobacterLactobacillusXanthomonasSphingomonasPantoeaCurtobacteriumMethylobacteriumPseudomonasNovosphingobiumOthers图 2 不同深度醋醅中细菌属水平 TOP10 群落结构分布Fig.2 Distribution of TOP10 bacterial at different depths inCupei at genus level 第 44 卷 第 18 期崔运来，等：镇江香醋醋酸发酵阶段细菌的垂直分布与富集培养 195 细菌的扩增子测序发现 151 个 OTU 参与发酵过程，乳杆菌属（Lactobacillus）和醋酸杆菌属（Acetobacter）占绝对优势，乳球菌属（Lactococcus）、葡糖醋杆菌属（Gluconacetobacter）、肠球菌属（Enterococcus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）和芽孢杆菌属（Bacillus）也存在于发酵过程。本研究中镇江香醋的细菌类群与制醋工厂生产发酵的主要细菌类群相似，也与其他固态发酵的食醋，如赤水晒醋25、山西老陈醋26、岐山醋27等主要细菌类群相似。BC 中醋酸杆菌属（Acetobacter）相对丰度最高（77.22%），乳杆菌属（Lactobacillus）丰度仅次于醋酸杆菌属（Acetobacter）的含量，占 19.24%。ZC 中乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度最高（64.31%），醋酸杆 菌 属（Acetobacter）的 丰 度 仅 次 于 乳 杆 菌 属（Lactobacillus）的含量，占 28.18%。DC 中乳杆菌属（Lactobacillus）的相对丰度较高（49.80%），其次是醋酸杆菌属（Acetobacter）12.95%，土壤杆菌属（Agro-bacterium）7.31%，黄单胞菌属（Xanthomonas）5.79%、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）5.34%。醋醅发酵表层中的优势菌是醋酸杆菌属（Acetobacter），随着醋醅深度加深，醋酸杆菌属（Acetobacter）丰度呈降低的趋势。由于醋酸杆菌属（Acetobacter）是一类好氧微生物28，并且发酵工艺是从表层开始接种，发酵深度越深相对溶氧量越低，醋杆菌丰度也就越低。而乳杆菌属（Lactobacillus）在中层丰度最高其次是底层，表层含量最低。引起乳杆菌分布不同的原因可能是由于乳杆菌属（Lactobacillus）是一类兼性厌氧菌，并且整个醋缸中中层醅温度高于底层醅温，中层醋醅环境最适宜乳杆菌生长，其次是底层环境。乳酸菌发酵产乳酸可以改善醋最终的口感风味，使镇江香醋的酸味柔和，乳酸菌还可以促进糖、蛋白质和脂肪的分解和代谢、合成乙偶姻等29。已有研究对镇江香醋醋酸发酵阶段中微生物变化和风味的相关性分析发现，少数物种是食醋发酵的核心功能微生物（醋酸杆菌属、乳杆菌属、水栖菌属、乳球菌属、葡糖醋杆菌属、芽孢杆菌属和葡萄球菌属）14，特别是醋酸菌和乳酸菌它们的物种组成和比例含量是影响发酵过程的关键15,30。结合本研究醋酸菌和乳酸菌的相互作用不仅体现在随时间的演替，在空间分布上也存在一定的规律。2.1.2 不同深度醋醅中细菌群落的多样性指数各样品 Alpha 多样性指数值统计如下表 2 所示。Chao1、Ace、Shannon、Simpson、PD whole tree 多样性指数均呈现相同的趋势，即 DC 高于 ZC 高于 BC，说明随着醋醅的深度的加深细菌的多样性越高，固态酿造食醋底层细菌种类最丰富。Beta 多样性使用样本相关性热图来呈现样品间细菌群落分布的相似性（图 3），BC 与 DC 之间细菌群落差异较大，BC 与 ZC 之间细菌群落差异较小。DCTreatTreat0.40.30.20.10.0BCZCDCBCZCBCDCZC图 3 不同深度醋醅中细菌分布相关性热图Fig.3 Heat map of bacterial distribution at differentdepths of Cupei 2.1.3 相关性与关联分析根据各个物种在各个实验样品中的丰度以及相互关系，基于 python 在属水平分析物种相关性进而绘制物种相关性网络图（图 4），可体现随空间变化的微生物物种间的相关性。选取属水平相关性最高的前 37 个属，进行斯皮尔曼（Spearman）秩相关分析并筛选相关性大于 0.1且 P 值小于 0.05 的数据构建相关性网络。大多数物种间呈现正相关，其中水球菌属（Aquisphaera），奥雷拉属（Orrella），土圈菌属（Pedo-sphaera）等优势细菌属物种和其他细菌属相连的节点数目在 13 之间；草螺菌属（Herbaspirillum），鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium），马赛菌属（Massilia），金黄杆菌属（Chryseobacterium）等优势细菌属物种和其他细菌属相连的节点数目超过 5 个，节点连通性很高，和其他物种间联系紧密，这些物种在醋醅中有利于多种微生物的共存。乳酸杆菌属（Lacto-bacillus）与驹形氏杆菌属（Komagataeibacter）呈负相关，奥雷拉属（Orrella）与苍白杆菌属（Ochrobac-trum）和鞘氨醇杆菌属（Sphingobacterium）呈负相关，他们之间可能存在竞争或拮抗作用。2.2富营养和寡营养培养基对醋醅中可培养微生物富集率的影响 2.2.1 不同培养基富集后 OTU 变化ZP、FY、GY样品测序共获得 203572 对 Reads，经质控和拼接后共产生 201738 条 Clean Reads，单个样品不少于 47429条 Clean Reads。高通量测序共获得 146个 OTU，其 表 2 不同深度醋醅中细菌群落 Alpha 多样性指数Table 2 Alpha diversity index of bacteria at differentdepths of Cupei样品Chao1AceShannonSimpsonPD whole treeBC68.569.00641.07840.36734.9568ZC78.678.99681.57430.51515.6866DC114.0111.88463.05980.73398.4188 196 食品工业科技2023 年 9 月中种醅（ZP）中含有 135 个 OTU，富营养培养基（FY）有 26 个 OTU，寡营养培养基（GY）有 37 个 OTU。3 个样品中 OTU 分布 Venn 见图 5，可见本研究所用的富集培养基只能培养出醋醅中部分细菌，富营养培养基可培养出 23 种，寡营养培养基可培养出32 种。有少数富集培养后的 OTU 未在种醅中检测出，可能是由于微生物在样品中分布不均匀导致。寡营养培养方式可富集到 17 种富营养培养方式下富集不到的微生物菌群。GYFY361781039ZP图 5 富集培养后 OTU 分布 Venn 图Fig.5 Venn diagram of OTU distribution after enrichmentculture 本研究所测序的种醅样品，即发酵第 7 d 的醋醅（上一批次），在本批次醋酸发酵中作为发酵剂。高通量测序显示（图 6），种醅（ZP）中优势属为未有效注释到已报道的物种的未知分类类群（Unassigned）平均相对丰度为 85.49%，醋酸杆菌属（Acetobacter）平均相对丰度为 0.91%；乳酸杆菌属（Lactobacillus）平均相对丰度为 0.72%；农杆菌属（Agrobacterium）平均相对丰度为 2.10%，鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）平均相对丰度为 2.00%，泛海属（Pantoea）平均相对丰度为 1.80%，黄单胞菌属（Xanthomonas）平均相对丰度为 1.20%，甲基杆菌属（Methylobacterium）平均相对丰度为 1.00%，短小杆菌属（Curtobacterium）平均相对丰度为 0.77%，新鞘层属（Novosphingobium）平均相对丰度为 0.68%、铜绿假单胞菌（Pseudo-monas）平均相对丰度为 0.62%，其他属（Others）平均相对丰度为 2.72%。相对丰度(%)OthersNovosphingobiumPseudomonasCurtobacteriumMethylobacteriumXanthomonasPantoeaSphingomonasAgrobacteriumLactobacillusUnassignedAcetobacterZPFYGY10080604020图 6 富集培养后属水平 TOP10 物种分布图Fig.6 Distribution of TOP10 genera after enrichment culture 富营养培养基富集后扩增子测序显示相对丰度1%的细菌菌群仅归属到 2 个属，其中包括醋酸菌属（Acetobacter）和乳酸菌属（Lactobacillus）。其中，醋酸菌属（Acetobacter）是此种富集培养条件下得到的相对丰度最高的类群，平均相对丰度为 56.45%，乳酸菌属（Lactobacillus）平均相对丰度为 43.02%。寡营养培养基对镇江香醋醋醅中的菌群进行富集，高通量测序显示相对丰度1%的细菌菌群同样归属到2 个属，醋酸菌属（Acetobacter 83.96%）和乳酸菌属（Lactobacillus 15.21%）。因此降低碳源和氮源的寡 1:Acinetobacter2:Polaromonas3:Fusibacter4:Simplicispira5:Herbaspirillum6:Weissella7:Quadrisphaera8:Orrella9:Candidatus odyssella10:Sphingobacterium11:Larkinella12:Clostridium13:Komagatacibacter14:Leuconostoc15:Methyloversatilis16:Massilia17:Ochrobactrum18:Luteolibacter19:Chryseobacterium20:Mucilaginibacter21:Candidatus_Trichorickettsia22:Brevundimonas23:Pigmentiphaga24:Rhodoferax25:Rhizobium26:Sphingobium27:Lactobacillus28:Beijerinckia29:Mycobacterium30:Burkholderia31:Luteitalea32:Serratia33:Pedosphaera34:Aquisphaera35:Pseudoglutamicibacter36:Salana37:Flavobacterium12345678910111213141516171819202122232425262728293031323334353637图 4 属水平物种相关性网络图Fig.4 Species correlation network at genus level注：节点大小代表相对丰度；橙色线代表正相关，绿色线代表负相关。第 44 卷 第 18 期崔运来，等：镇江香醋醋酸发酵阶段细菌的垂直分布与富集培养 197 营养条件有利于镇江香醋醋醅中醋杆菌属的富集，富营养培养基有益于醋醅中乳酸菌的富集。2.2.2 不同培养基对醋醅中细菌培养效果以每个OTU 单元为横坐标，以序列相对含量的对数值为纵坐标绘制散点图（图 7），以比对寡营养培养基和富营养培养基对醋醅中细菌的培养效果。相对含量的对数值大于 0，表示培养基对该类群有富集效果，相对含量的对数值小于 0，表示培养基有一定培养作用但不能富集。富营养培养基对醋醅中细菌的富集作用主要体现在对厚壁菌门细菌的富集，他还可以富集变形菌门中的醋杆菌和一个未知类群细菌。寡营养培养基可以富集 1 种拟杆菌门细菌，6 种厚壁菌门细菌，5 种变形菌门细菌和 4 种未分类的类群，对厚壁菌门部分细菌富集作用最强。寡营养的培养基能够富集的 OTU 高于富营养培养基，且具有新类群微生物的培养潜力。210123lg(R)AOTU21012lg(R)BOTUPhylumAcidobacteriotaArmatiomonadotaBacteroidetesFirmicutesOtherProteobacteriaPlanctomycetota图 7 不同培养基对醋醅中细菌丰度的影响Fig.7 Effect of different media on the abundance of bacteria in Cupei注：A：富营养培养；B：寡营养培养；点的颜色代表不同菌门，点的大小反应相对丰度。3结论本研究采用高通量测序技术，揭示了发酵第 7 d镇江香醋醋醅不同发酵深度的细菌群落的多样性。共获得了 192680 条有效序列，样品中鉴定出 118个 OTU。随着发酵深度的增加，细菌物种数量和多样性升高。表层醋醅细菌的优势类群为醋酸杆菌（Acetobacter），且随着醋醅深度增加的醋酸杆菌（Acetobacter）相对含量依次减少，中层和底层醋醅细菌的优势类群为乳杆菌属（Lactobacillus），醋酸杆菌（Acetobacter）和乳杆菌属（Lactobacillus）作为食醋发酵核心微生物，它们主要在醋醅中不同的垂直环境发挥作用。为探究不同营养成分对醋醅中细菌的富集作用，本研究使用富营养和寡营养培养基对种醅微生物进行富集，并通过高通量测序了解细菌群落组成。3 个样品共获得 203572 条有效序列，归属于 146 个OTU。两种培养基都可以对醋杆菌和乳杆菌有效富集，但寡营养培养基对比富营养培养基可培养的菌群更多样，特别是对潜在的未分类新类群的培养。本研究可进一步加深对镇江香醋醋酸发酵阶段微生物空间分布的了解，同时可为醋醅中特定微生物的分离，特别是从培养基营养成分选择和采样位置选择提供参考，但是如何结合时间和空间多维度对发酵机理的解析还需要深入的研究。参考文献 1 刘青雯.镇江香醋:坚持守正创新 打造高价值醋经济J.中国食品工业，2022（7）：7879.LIU Q W.Zhenjiang aromaticvinegar:Adhere to the righteous innovation to create a high-valuevinegar economyJ.China Food Industry，2022（7）：7879.2 纪凤娣,魏巍,陶汇源,等.传统食醋中有机酸与人体健康J.中国酿造，2021，40（3）：1116.JI F D,WEI W,TAO H Y,et al.Organic acids in traditional vinegar and human healthJ.Chi-na Brewing，2021，40（3）：1116.3 冯国杨,杨波,邢俊德,等.发酵食品中四甲基吡嗪的检测、来源及其微生物合成途径研究进展J.中国酿造，2022，41（4）：16.FENG G Y,YANG B,XING J D,et al.Research progress on de-tection,source and microbial synthesis pathway of 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