珠芽黄魔芋软腐病病原菌分离与鉴定.pdf

陕西农业科学():./.珠芽黄魔芋软腐病病原菌分离与鉴定张龙芝张金军郑清芳张 艳阮 佳王 梦陈敬民白 玉吴 涛何 斐(.安康市汉滨区农业技术推广站陕西 安康.安康市汉滨区流水镇农业综合服务站陕西 安康.安康学院 现代农业与生物科技学院陕西 安康.安康市农技推广中心 陕西 安康)摘 要:为了对引种驯化的珠芽黄魔芋软腐病病害进行有效防控采集陕西省镇巴县有软腐病发病症状的珠芽黄魔芋叶柄进行病原细菌分离纯化、致病性检测、分离菌株的菌落形态特征观察、生理生化特征及 序列比对分析 试验结果表明从软腐病症状的珠芽黄魔芋叶柄中分离获得了不同形态的 株细菌致病性试验发现其中的 菌株可使珠芽黄魔芋、花魔芋、胡萝卜和白菜离体组织表现出软腐症状并导致珠芽黄魔芋和花魔芋植株发病 分离的 菌株单菌落圆形突起乳黄色边沿光滑整齐杆状菌体 序列分析结果表明该菌株与已报道的胡萝卜软腐果胶杆菌()亲缘关系最近相似度为.这是陕南地区首次报道由胡萝卜软腐果胶杆菌引起的珠芽黄魔芋软腐病害该研究结果有助于为引种驯化的珠芽黄魔芋软腐病害防治提供理论依据关键词:珠芽黄魔芋软腐病病原菌分离鉴定中图分类号:.文献标识码:文章编号:()收稿日期:修回日期:基金项目:陕西省重点研发计划项目()安康市科技计划项目()第一作者简介:张龙芝()女陕西安康人主要从事魔芋提质增效栽培技术研究通信作者:何斐 (.):.:魔芋是多年生天南星科草本植物 截止目前全世界已发现并命名的魔芋有 种我国共有 种主要分布在华南、西南地区 魔芋在我国贵州、云南、湖北、陕南等地区有大面积栽培主栽品种主要是花魔芋、白魔芋以及杂交种 伴随着我国各地区魔芋栽培面积的不断增加魔芋各种病虫害日趋严重尤其以细菌性软腐病病害发生最严重、最普遍 引起魔芋软腐病的病原菌主要是胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种(.)和菊果胶杆菌(.)珠芽魔芋(.)及其相关种既可以用实生种子和地下球茎繁殖也可以用叶面着生的珠芽进行繁殖 珠芽魔芋目前主要分布在我国云南、老挝、缅甸及泰国等地区该品种具有抗性强、产量高、繁殖系数大等优势 与花魔芋和白魔芋相比珠芽魔芋在产量、黏度等特性指标方面有明显优势 近年来陕南地区对珠芽魔芋进行了引种驯化、栽培繁殖技术的研究 近年来在魔芋生产中调查发现镇巴县珠芽黄魔芋生产基地出现细菌性软腐病 为了能有效防控珠芽黄魔芋软腐病课题组对实验基地采集的珠芽黄魔芋软腐病叶柄材料进行病原细菌的分离、致病性测定和病原菌菌种鉴定现将研究结果报道如下 材料与方法.材料珠芽黄魔芋软腐病发病的叶柄:取自汉中市镇巴县珠芽黄魔芋种植区.培养基牛肉膏蛋白胨培养基:主要用于细菌的活化与培养.病原菌分离将发病的魔芋叶柄切成小块用 溶液浸泡 无菌水洗 次再用镊子去掉叶柄表面组织在 缓冲液(.)中震荡浸泡 然后取 上清液依次进行梯度稀释取 稀释液均匀涂布在牛肉膏蛋白胨固体培养基上条件下培养 用无菌接种针取单菌落反复划线纯化 次获得的纯菌株接种斜面保藏备用.致病性测定分别取自来水冲洗干净的健康魔芋、胡萝卜和白菜依次用 酒精震荡浸泡 无菌水洗 次后切块备用 在放置 张滤纸的培养皿中各加入无菌水 浸润滤纸然后每皿放置一块消毒处理后的组织切块用无菌接种针分别接种上述已纯化活化的菌株每个切块一个接种点每个分离株的致病性检测重复 皿 培养观察记录细菌分离株在各组织切块上的侵染情况魔芋植株致病性检测:挑选健康且长势相近的珠芽黄魔芋和花魔芋植株用无菌注射器在魔芋叶柄处分别注射 菌液(浓度为/)每个菌分别接种 株同时以注射无菌水的植株作为对照 每隔 观察魔芋发病情况.生理生化特性检测明胶液化、吲哚试验、甲基红试验及革兰氏染色反应等参考文献 进行.病原菌的分子鉴定按照 柱式细菌基因组 抽提试剂盒操作说明书的方法步骤提取病原细菌的总 采用 通用引物进行 扩增扩增产物寄送上海生工生物工程有限公司进行测序 测序拼接的序列与 数据库中相关序列进行 比对 用 .软件按照 方法构建系统发育树 结果与分析.软腐病菌分离及致病性检测采用平板分离法从发病珠芽黄魔芋叶柄中共分离获得 种不同形态的单菌落 将分离纯化的菌株分别进行植物离体组织回接接种培养 后其中 株细菌 菌株可使珠芽黄魔芋、花魔芋、胡萝卜和白菜组织腐烂、恶臭表现出明显的软腐症状(图)张龙芝等:珠芽黄魔芋软腐病病原菌分离与鉴定图 菌株 对魔芋、胡萝卜和白菜组织块的侵染现象.珠芽黄魔芋.花魔芋.胡萝卜.白菜图 菌株 对魔芋植株的侵染现象及其菌落形态.珠芽黄魔芋.花魔芋.菌落形态 将该菌株进一步接种珠芽黄魔芋(图)和花魔芋(图)植株进行回接试验 结果显示该菌株 即可使魔芋植株表现出典型的软腐病症状其发病症状与前期田间采集的样品发病症状基本一致 再次采集回接发病的魔芋组织样品从中分离又获得了病原菌其菌落形态和原始分离菌株一致因此确认 菌株即为珠芽黄魔芋软腐病的病原菌.病原细菌菌种鉴定.菌落形态 病原菌 菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上培养形态一致(图)菌落圆形突起乳黄色边沿光滑整齐.生理生化特性 生理生化指标测定结果显示 分离株为革兰氏阴性杆菌明胶液化吲哚和甲基红试验结果均为阴性 该菌株可以利用木糖、乳糖、纤维二糖、蔗糖和葡萄糖产酸但无法利用肌醇和 阿拉伯糖醇.序列分析提取菌株 的基因组 进行 扩增 扩增产物经检测大小约为 (图)扩增产物测序结果表明该菌株的 序列全长为 经序列比对 菌株与 (.)相似度最高为.(图)结合测序结果和生理生化特征 菌株被鉴定为胡萝卜软腐果胶杆菌()图 病原菌菌株 的 电泳图陕西农业科学 年第 卷第 期图 病原菌菌株 的系统发育树 讨论与结论白菜、胡萝卜、魔芋等植物细菌性软腐病害主要由果胶杆菌属(.)和狄克氏菌属(.)的细菌引起 但研究者们从我国不同魔芋产地分离获得的软腐病病原菌存在一定的差异 魏环宇等研究表明从云南西双版纳州和德宏珠芽魔芋软腐病发病茎秆中分离的病原菌为软腐果胶杆菌(.)吴旭等研究表明胡萝卜软腐欧文氏杆菌胡萝卜软腐亚种(.)对德宏珠芽红魔芋、临沧珠芽红魔芋和缅甸珠芽红魔芋有一定的致病性 本课题组从陕西省镇巴县珠芽黄魔芋种植区分离获得的 菌株再回接于健康的珠芽黄魔芋其发病症状与前期采样时植株自然发病的症状吻合再次从回接发病的珠芽黄魔芋病株中重新分离又可获得此病原菌 经病菌菌落形态特征观察、致病性检测、生理生化特征和 序列分析结果表明镇巴县珠芽黄魔芋软腐病是由胡萝卜软腐果胶杆菌(.)引起 这是我国关于胡萝卜软腐果胶杆菌(.)引起珠芽黄魔芋软腐病的首次报道本研究调查发现每年 月是陕南地区珠芽黄魔芋软腐病发病高峰期表明胡萝卜软腐果胶杆菌的生长繁殖受气候影响较大高温高湿的环境加剧了软腐病菌的侵染和大面积传播 因此在魔芋栽培过程中应加强管理及时改善作物的生长环境控制病菌传播途径有效预防和控制魔芋软腐病病害的大面积爆发 此外课题组后续将进一步对陕南地区珠芽魔芋软腐病病原物种类、遗传多样性及进化关系等做更系统的调查和分析明确软腐病病害发生和流行的主要因素为珠芽魔芋软腐病的防治技术研究奠定基础参 考 文 献:刘二喜.魔芋种质资源分类鉴定技术、引种适应性评价及繁殖特性研究.恩施:湖北民族学院.黄义钧 徐桂红 陈兵先 等.种魔芋属植物观赏价值及引种适应性评价.现代农业科技():.钟伏付 苏娜 杨廷宪 等.魔芋品种选育与改良研究进展.湖北农业科学 ():.何斐 王冉 雷雨俊 等.魔芋白绢病菌菌丝生长及微菌核形成的影响因素研究.江西农业学报():.张迅.珠芽魔芋葡甘低聚糖制备、性质及对 吸附能力的研究.重庆:西南大学.代雪凤 朱丽 张盛林 等.魔芋软腐病拮抗放线菌筛选.西南大学学报(自然科学版)():.修建华 姬广海 王敏 等.魔芋软腐病菌分子鉴定与遗传多样性.微生物学报 ():.姬广海 吴亚鹏 白学慧 等.抗生素溶杆菌对魔芋软腐病和根际微生物多样性的影响.江西农业大学学报 ():.魏环宇 魏薇 杨敏 等.云南省珠芽魔芋()软腐病病原菌鉴定.植物病理学报 ():.:.邓利玲 徐小青 杨延迅 等.珠芽魔芋精粉的理化性质.食品科学 ():.黄晴.两种魔芋精粉的基础应用特性研究.武汉:华中农业大学.周德庆.微生物学实验手册.上海:上海科技出版社:.程丽娟 薛泉宏 来航线 等.微生物学实验技术.西安:世界图书出版公司.(下转第 页)张龙芝等:珠芽黄魔芋软腐病病原菌分离与鉴定不知道在使用杀虫剂时应使用哪种类型的个人防护装备 农药对于人体健康与环境的风险考虑不足 对于非靶标生物的影响认识仅限于存在果园内的远离果园的其它生态系统里的生物果农意识不到会受影响 在施药时追求雾滴小覆盖面广却忽略雾滴漂移现象以及漂移后会产生药害或者污染环境的问题 有保护秦岭周边良好生态环境的意识但是对农药使用行为会对秦岭生态环境造成影响认识不足 在理论上指出农药是一种降低风险的投入因为它减少了破坏性害虫造成的生产损失因此对风险的态度是农户施药行为的主要驱动因素 等发现了强有力的证据支持 提出的理论即对病虫害关注度高的农民更有可能使用过量的农药农药的使用认识是决定防治效果以及使用风险的决定因素 了解农民使用农药时的主观意愿使教育培训或农业推广有针对性地在农民群体中实施是有效降低的农药风险的预防措施 有研究结果表明农民对过度使用农药的负面后果了解越多就越有可能使用更少量的农药 通过本次调查列出农户使用农药时可能产生风险的行为在今后的用药指导和培训中应该将这些问题 作为重点内容从根本上降低农药使用环节将带来的风险参 考 文 献:.:.:.:():.().宋晓斌郑文峰张学武.陕西猕猴桃病虫害调查概述.森林病虫通讯():高贝贝.农药职业背负式喷雾场景暴露风险评估.北京:中国农业科学院.李亚红 朱晓明 杨普云 降低农药风险农民田间学校培训方法.中国植保导刊():.:.().:.().(上接第 页)卢美欢 李利军 马英辉 等.陕南地区魔芋软腐病病原菌的鉴定及生长特性研究.陕西农业科学 ():.何斐 段佳丽 罗宝芳 等.岚皋魔芋软腐病病原细菌生物多样性研究.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.徐炜.岚皋县魔芋软腐病和白绢病病原菌的分离鉴定和生物防控初探.杨凌:西北农林科技大学.何斐 张忠良 崔鸣 等.放线菌对魔芋的防病促 生 作 用 .园 艺 学 报 ():.徐炜 王婷婷 刘列平 等.陕西岚皋县魔芋软腐病原菌的分离与鉴定.西北农林科技大学学报(自然科学版)():.张世昌 张宇璐 谭晓东 等.拮抗链霉菌 的筛选及其在不同含水量土壤中对白菜软腐病的防病效果/.中国生物防治学报.:/././.钟灵坤 徐翠虹 黄泽铭 等.胡萝卜软腐果胶杆菌 发光菌株的构建和应用.浙江大学学报(农业与生命科学版)():.吴旭 杨敏 刘佳妮 等.珠芽魔芋对细菌性软腐病的抗性鉴定研究.亚热带植物科学 ():.陕西农业科学 年第 卷第 期