致犊牛肺炎A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及同源性分析.pdf

2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）试验研究试验研究试验研究试验研究 1 致犊牛肺炎 A 型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定 及同源性分析 孟 霞1,2，王佳芸1,2，黄蓝田1,2，朱心仪1,2，郭 佳1,2，张宜辉3，尹文兵3，刘晓芳4，王建辉5，李建基1,2，朱国强1,2，王 亨1,2*（1.扬州大学兽医学院/江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏 扬州 225009；2.江苏高校动物重要疫病和重要人兽共患病防控技术国际合作联合实验室/农业与农产品安全教育部国际联合研究实验室，江苏 扬州；3.扬州大学实验农牧场，江苏 扬州；4.江苏省兴化市畜牧兽医站，江苏 泰州；5.江苏省睢宁县畜牧兽医技术指导站，江苏 徐州）摘要：本研究旨在对江苏某牧场引发犊牛呼吸道综合征的多杀性巴氏杆菌进行分离鉴定，并分析其遗传进化关系及耐药情况。首先对引起犊牛呼吸道症状致犊牛死亡案例进行剖检，发现肺脏肿大，肺门淋巴结肿胀、出血，肺部形成多处结节，然后取肺门淋巴结进行细菌分离培养与鉴定，并进行16S rRNA扩增、测序分析、血清型鉴定和耐药性分析。质谱鉴定和测序分析结果显示，该菌株与A型多杀性巴氏杆菌属于同一亚群，其序列与已经发布的CQ2、CQ7菌株同源性较近。药敏结果显示，该菌株对林可霉素耐药，对其余13种常用抗生素具有高度敏感性。以上结果表明，引发该牧场犊牛肺炎的病原为A型多杀性巴氏杆菌，且与国内报道的A型多杀性巴氏杆菌同源性较高，提示A型多杀性巴氏杆菌在国内牧场具有较广泛的流行性。本研究为犊牛呼吸道综合征的病原学调查和多杀性巴氏杆菌流行病学提供数据参考。关键词：犊牛；多杀性巴氏杆菌；分离鉴定；药敏试验；同源性分析 中图分类号：S852.61 文献标识码：A 文章编号：1007-1733（2023）08-0001-06 多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）是多种动物的重要病原菌，可感染猪、牛、羊、兔、家禽、野生动物等，也可感染人类，主要侵袭呼吸系统和引发出血性败血症1。根据其荚膜抗原的差异性，多杀性巴氏杆菌可分为A、B、D、E、F 5种血清型，基于荚膜形成相关基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD 等的特异性，Townsend等通过在不同基因位点设计特异性引物，建立了一种荚膜血清型多重PCR分型方法2。kmt1基因作为多杀性巴氏杆菌种特异性基因，也被广泛用于该菌的鉴别3。荚膜型巴氏杆菌是引起牛呼吸系统疾病综合征的主要病原之 一，主要引发肺炎症状。该病多为散发，致病菌可经消化道和呼吸道感染，存在于病畜的多种组织、体液、分泌物及排泄物中。当犊牛处于寒冷、闷热、潮湿、拥挤、通风不良、长途运输、饲料突变、营养缺乏等情况时，可诱发该病。此病一旦发生，传染快、危害大、死亡率高，常造成犊牛养殖的重大经济损失4。此外，研究还发现多杀性巴氏杆菌能与造成牛呼吸道综合征的其他病原，如牛支原体、牛副流感病毒3型等，发生混合感染，导致疾病的发病率和死亡率进一步升高5。目前，疫苗免疫和生物防控是预防多杀性巴氏杆菌病的主要方法，但Pm具有多种血清 试验研究 基金项目：扬州大学专业学位研究生教学案例库建设项目；江苏现代农业产业技术体系建设专项资金资助（JATS2022499）；扬州大学卓越本科课程建设工程项目资助（2022ZYKCC-33）；江苏省333高层次人才培养工程资助项目；江苏高校优势学科建设工程资助项目（PAPD）；江苏高校品牌专业建设工程资助项目（TAPP）；高等学校学科创新引智计划资助（D18007）共同第一作者 *通讯作者 山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 2 型，且不同血清型交叉保护力弱，加之抗生素的广泛使用，耐药菌株不断形成，故该病仍在多个地区流行6。研究发现，中国牛群易感染A、B型巴氏杆菌，常导致肺炎、肺纤维化及出血性败血症。其中，犊牛肺炎常由型巴氏杆菌所致，而成年牛的出血性败血症多由型巴氏杆菌感染7。本试验从江苏省某养殖场患有呼吸道症状的死亡犊牛中，分离鉴定出荚膜A型多杀性巴氏杆菌，并对其遗传进化和部分生物学特性进行了研究，旨在为临床防控该病提供理论依据。1 材料与方法 1.1 材料 主要仪器和试剂：PCR仪和Gel-DocXR凝胶成像系统购自BIO-RAD公司；MALDI Bio-typer微生物鉴定系统、质控标准品、甲酸和基质溶液购自布鲁克公司；Taq酶和DNA Marker购自北京全式金生物技术有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；胎牛血清购自浙江天杭生物技术股份有限公司；抗菌药物药敏纸片（14种）购自杭州微生物试剂有限公司；MH琼脂购自青岛海博生物技术有限公司；LB培养基和血琼脂平板均为实验室配制。1.2 方法 1.2.1 多杀性巴氏杆菌的组织分离 （1）病情介绍：江苏某奶牛养殖场，犊牛自10月开始陆续出现呼吸道症状，发病率在10%左右。经过治疗，治愈率为92.3%。近期气温出现骤变，又出现个别犊牛死亡，就诊并开展病原诊断。（2）细菌分离：对死亡犊牛进行剖检，无菌采集肺组织，低温送至实验室检测。无菌采集肺门淋巴结样本，接种于含5%绵羊鲜血的琼脂培养基，37 培养1824 h。挑取表面光滑、湿润、边缘较整齐的半透明、灰白色单菌落，转接于含10%胎牛血清的LB液体培养基，37，180 r/min振荡培养68 h后，进行革兰氏染色镜检。1.2.2 多杀性巴氏杆菌的质谱和PCR鉴定 （1）质谱鉴定：挑取单菌落，涂抹至MALDI靶板，依次加1 L质控标准品（BTS），自然干燥，加1 L 70%的甲酸水溶液，自然干燥，加1 L基质溶液，自然干燥，然后进行质谱仪检测。根据质谱图，通过与Bio-typer数据库的特异性指纹图谱进行相关比对后鉴定微生物。（2）引物的设计与合成：根据文献报道的多杀性巴氏杆菌的种特异性引物序列2，由北京擎科生物科技有限公司合成引物（表1）。（3）PCR扩增体系：PCR反应在25 L体系中进行，2Taq酶12.5 L，ddH2O 8.5 L，上游引物及下游引物各1 L，模板DNA 2 L。扩增程序：95，5 min；95 ，1 min，55 ，退 火1 min，72，延伸1 min，35个循环；72，10 min。PCR反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并扫描照相。1.2.3 16S rRNA基因测序和血清型分析 （1）引物合成：用于扩增多杀性巴氏杆菌16S rRNA基因的通用引物，以及文献报道的多杀性巴氏杆菌血清型鉴定引物2，均由北京擎科生物有限公司合成（表2）。（2）PCR扩增：利用16S rRNA基因通用引物进行PCR反应，反应体系为：2Taq酶12.5 L，ddH2O 8.5 L，上游引物及下游引物各1 L，模板DNA 2 L。反应程序如下：94，5 min；94，1 min，54，退火1 min，72，延伸1 min，35个循环；72，延伸10 min。PCR产物送北京擎科生物科技有限公司测序鉴定，确定所分离细菌为多杀性巴氏杆菌后，再进行血清型鉴定。利用5种荚膜血清分型引物进行多重PCR反应，25 L反应体系为：2Taq酶12.5 L，ddH2O 5.5 L，5对上游引物及下游引物各0.5 L，模板DNA 2 L。反应程序如下：94，5 min；94，1 min，55，退火1 min，72，延伸1 min，35个循环；72 延伸10 min。利用琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR扩增产物。（3）系统进化树分析：从GenBank下载数据库中已有的多杀性巴氏杆菌16S rRNA全基因序列，利用分子进化遗传分析软件MEGA 7.0对上述测序的多杀性巴氏杆菌16S rRNA全基因序列和下载的序列进行遗传进化分析。2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）试验研究试验研究试验研究试验研究 3 表1 多杀巴氏杆菌种特异性引物信息 基因 名称 序列（5-3）目的片段大小（bp）Pm-F KMT1T7 ATCCGCTATTTACCCAGTGG Pm-R KMT1 KMT1SP6 GCTGTAAACGAACTCGCCAC 460 表2多杀巴氏杆菌血清型引物及16S rRNA引物 血清型 基因 名称 序列（5-3）目的片段大小（bp）CAPA-F TGCCAAAATCGCAGTCAG A hyaD-hyaC CAPA-R TTGCCATCATTGTCAGTG 1 044 CAPB-F CATTTATCCAAGCTCCACC B bcbD CAPB-R GCCCGAGAGTTTCAATCC 760 CAPD-F TTACAAAAGAAAGACTAGGAGCCC D dcbF CAPD-R CATCTACCCACTCAACCATATCAG 657 CAPE-F TCCGCAGAAAATTATTGACTC E ecbJ CAPE-R GCTTGCTGCTTGATTTTGTC 511 CAPF-F AATCGGAGAACGCAGAAATCAG F fcbD CAPF-R TTCCGCCGTCAATTACTCTG 851 16S-F AGAGTTTGATCCTGGCTCAG/16S rRNA 16S-R TACGGCTACCTTGTTACGACTT 1 400 1.2.4 药物敏感性试验 利用K-B法药敏试验检测分离株对常用药物的敏感性。将细菌接种于含5%绵羊鲜血的琼脂平板上，37 培养1824 h，挑取单菌落于LB液体培养基制备菌悬液，用浊度仪调整浊度为0.5麦氏单位，用棉签在MH琼脂表面均匀涂布，使菌液布满平板，室温放置5 min左右。然后将药敏纸片贴于琼脂表面，放置15 min后，于37 倒置培养1618 h，测量抑菌圈直径。根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）抗微生物药物敏感性试验执行标准（2008年）进行结果判定。2 结果 2.1 剖检病变 将肺脏组织进行剖检，可见肺叶肿大，呈暗红色，发生肝样变；肝变部切面粗糙，呈细小的颗粒状突起，切面上可见多个脓肿灶（图1A），邻近的肺门淋巴结肿胀、出血（图1B）。2.2 细菌培养特性及形态观察 绵羊血琼脂平板上形成表面光滑、湿润、边缘较整齐的半透明灰白色菌落（图2）。革兰氏染色后观察为两极浓染的革兰氏阴性短杆菌（图3）。图1肺脏和肺门淋巴结剖检病变 A.肺部形成脓肿；B.肺门淋巴结肿胀、出血 图2 细菌形态 图3 革兰氏染色镜检 2.3 质谱鉴定结果 将分离菌株的指纹图谱与Bio-typer数据库进行比对，该分离菌株被鉴定为多杀性巴氏杆菌（图4）。山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 4 图4 多杀性巴氏杆菌质谱峰图 2.4 16S rRNA和荚膜血清型基因多重PCR扩增结果 该菌株基于16S rRNA基因扩增出1 400 bp的特异性目的条带，并检测到巴氏杆菌特异性基因kmt1，扩增出460 bp的特异性目的条带，确定该菌株为巴氏杆菌菌株。利用多重PCR方法对所分离的菌株进行荚膜血清型鉴定，检测到荚膜 血清型A型（目的条带为1 044 bp），后经测序确定该分离株为A型多杀性巴氏杆菌，命名为YZ01（图5）。图5 PCR鉴定 M.DL2000；1.kmt1 PCR产物；2.荚膜A型多重PCR产物；3.16S rRNA PCR产物 2.5 16S rRNA系统发育进化分析 分离株16S rRNA 基因序列与GenBank己发布的多杀性巴氏杆菌16S rRNA全基因序列的系统发育进化树分析结果显示，YZ01与A型多杀性巴氏杆菌同源性较近，并与其余4株巴氏杆菌CQ2、CQ7、Fcf76、Fcf15形成独立分支（图6），表明该菌株与这四株菌株序列同源性较高。图6 多杀巴氏杆菌YZ01株16S rRNA进化树 2.6 多杀性巴氏杆菌分离株药敏试验结果 药敏试验结果显示：多杀性巴氏杆菌分离株对林可霉素耐药，对克林霉素中度敏感，对多西环素、氟苯尼考、多粘菌素B、庆大霉素、卡那1 400 1 044 460 2023年第年第年第年第8期期期期（总第总第总第总第313期期期期）试验研究试验研究试验研究试验研究 5 霉素、青霉素、阿莫西林、美罗培南、丁胺卡那、头孢氨苄、氨苄西林、环丙沙星12种抗生素高度敏感（表3）。表3 药敏试验结果 敏感性判定标准（mm）药物 R I S 抑菌圈直 径（mm）结果 克林霉素 14 15-20 21 15 I 林可霉素 24 24-30 30 20 R 多西环素 12 13-15 16 21 S 氟苯尼考 12 13-17 18 20 S 多粘菌素B 8 8-11 12 16 S 庆大霉素 12 13-14 15 16 S 卡那霉素 13 14-17 18 20 S 青霉素 19 20-27 28 30 S 阿莫西林 13 14-17 18 20 S 美罗培南 18 18-34 34 35 S 丁胺卡那 14 15-16 17 18 S 头孢氨苄 14 15-17 18 20 S 氨苄西林 18 19-21 22 25 S 环丙沙星 15 16-20 21 22 S 注：S.敏感；I.中度敏感；R.耐药 3 讨论与结论 巴氏杆菌是动物呼吸道常见细菌之一。当外界环境（如季节更替、温差等）变化较大时，动物机体免疫力下降，易发生多杀性巴氏杆菌感染，且多见于犊牛8。本研究从江苏某规模化奶牛场发病的犊牛脏器分离到多杀性巴氏杆菌，通过多重PCR确诊为A型多杀性巴氏杆菌。自2008年国内首次报道牛感染A型多杀性巴氏杆菌以来，关于A型菌株的分离报道逐渐增多9。通过16S rRNA构建进化树分析发现，该菌株与之前国内报道分离的A型多杀性巴氏杆菌具有较高的同源性，说明A型多杀性巴氏杆菌在江苏牧场出现流行。药敏试验证实，该分离菌对大部分的常用抗生素敏感，可以根据药物敏感性试验，选择相关药物进行规范治疗。研究发现，牛呼吸道疾病综合征（bovine respiratory disease complex，BRDC）在全球范围内造成了巨大的经济损失，严重影响养牛业的发展10。本研究中，从患有呼吸道疾病的犊牛肺门淋巴结分离鉴定出荚膜A型多杀性巴氏杆菌，其临床表现为气喘咳嗽、呼吸困难、肺部有捻发音；剖检肺脏可见，病变肺叶肿大，呈暗红色，发生肝变，切面粗糙，其伴有多发性脓肿块，表明该犊牛发病已经多日，提示牧场需要加强对犊牛的日常管理。对于出现呼吸道症状的犊牛，应及时进行检查，并根据发病的情况进行隔离和救治。对环境加强消毒和生物防控，并注射多杀性巴氏杆菌疫苗，增强免疫力，提高疾病防控水平。近年来的报道表明，型多杀性巴氏杆菌正逐渐成为引起BRDC巴氏杆菌的主要血清型11。Dabo等12和Ewers等3的研究发现，引起BRDC的巴氏杆菌中，A型多杀性巴氏杆菌发病率分别为80%和92%。目前，针对巴氏杆菌检测方法常见有2种，其中经典的分离培养生化鉴定法，条件要求不高，易于操作，但耗时相对长；分子生物学方法具有特异性强、灵敏度高等优点，被广泛用于巴氏杆菌的实验室快速检测13，其对仪器要求高，人员需要具备一定的专业知识，但无法拿到病原，无法开展后续研究如药敏试验等。本试验通过分离、质谱鉴定并结合分子生物学方法对分离菌株进行鉴定，成功分离并鉴定出荚膜A型多杀性巴氏杆菌，为该牧场犊牛呼吸道疾病防控提供依据。进化树分析发现，本试验的分离株与其余4株巴氏杆菌CQ2、CQ7、Fcf76、Fcf15形成独立分支，说明该菌株与这四株菌株序列同源性较高。高尚等14于2021年分离的两株A型巴氏杆菌的同源性与海南分离株同源性较高。另研究发现不同国家的分离株有较高的同源性，故多杀性巴氏杆菌在多国均有流行15。此外，在本试验中分离的犊牛多杀性巴氏杆菌来源于肺门淋巴结，对于诊断更加可靠，同时采用质谱分析，速度提升，可以更好地满足临床检测需要。据报道16，我国养殖牛的呼吸系统疾病中，引发出血性败血症的巴氏杆菌主要为荚膜B型多杀性巴氏杆菌，A型较少，且目前国内用于预防牛多杀性巴氏杆菌疫苗株均为荚膜血清型B型菌山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医山东畜牧兽医 2023年第年第年第年第44卷卷卷卷 6 株。本次规模化牧场发生的犊牛肺炎病原来自A型多杀性巴氏杆菌，且与其他的部分报道来自同一主分支，因此有必要开展A型多杀性巴氏杆菌疫苗的研制，对于保障动物养殖健康发展尤为重要。综上，该牧场犊牛肺炎由荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌引起，该研究丰富了国内致牛肺炎的多杀性巴氏杆菌的数据，也提示目前A型多杀性巴氏杆菌导致的犊牛肺炎需要纳入牧场管理。因此，开展牛源多杀性巴氏杆菌病的流行病学调查研究，同时加强生物防控和积极采取预防措施，对于保护产业健康发展具有重要意义，也为进一步推动牛A型多杀性巴氏杆菌疫苗的研发提供参考。参考文献 1 Narcana IK,Suardana IW,Besung INK.Molecular characteristic of Pasteurella multocida isolates from Sumba Island at East Nusa Tenggara Province,Indonesia.Veterinary world,2020,13（1）:104-109.2 Townsend KM,Boyce JD,Chung JY,et al.Genetic organization of Pasteurella multocida cap Loci and development of a multiplex capsular PCR typing system.Journal of clinical microbiology,2001,39（3）:924-929.3 Ewers C,Lbke-Becker A,Bethe A,et al.Virulence genotype of Pasteurella multocida strains isolated from different hosts with various disease status.Veterinary microbiology,2006,114（3-4）:304-317.4 Furian TQ,Borges KA,Laviniki V,et al.Virulence genes and antimicrobial resistance of Pasteurella multocida isolated from poultry and swine.Brazilian 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