蛋白质芯片技术.ppt

蛋白质芯片技术蛋白质芯片技术目目 录录一一 蛋白质芯片技术产生的背景蛋白质芯片技术产生的背景二二 蛋白质芯片的概念蛋白质芯片的概念三三 蛋白质芯片的主要特点蛋白质芯片的主要特点四四 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类五五 蛋白质芯片技术的简要操作步骤蛋白质芯片技术的简要操作步骤六六 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用一一 蛋白质芯片技术产生的背景蛋白质芯片技术产生的背景 随着人类和其他生物的全基因组序列随着人类和其他生物的全基因组序列的完成，人们开始认识到基因仅仅是生物的完成，人们开始认识到基因仅仅是生物体遗传信息的载体，而生命活动的执行者、体遗传信息的载体，而生命活动的执行者、表观性状的体现者则由基因编码的产物表观性状的体现者则由基因编码的产物蛋白质所行使。基因只是一种编码，由它蛋白质所行使。基因只是一种编码，由它指导细胞合成蛋白质，而几乎所有的生物指导细胞合成蛋白质，而几乎所有的生物化学反应均发化学反应均发 生在复杂的蛋白质分子之生在复杂的蛋白质分子之间或有蛋白质参与，所有的外在表现均由间或有蛋白质参与，所有的外在表现均由种类繁多的种类繁多的蛋白质蛋白质所决定。所决定。l随随着着分分子子生生物物学学技技术术的的发发展展，生生物物芯芯片片技技术术研研究究工工作作不不断断深深入入，DNADNA芯芯片片技技术术被被逐逐渐渐用用于于对对生生物物样样品品中中核核酸序列表达的检测和比较研究。酸序列表达的检测和比较研究。l随随着着DNADNA芯芯片片技技术术的的不不断断成成熟熟，以以及及基基因因研研究究所所取取得得的的令令人人瞩瞩目目的的成成果果，进进一一步步推推动动蛋蛋白白质质功功能能的的研研究究及及相相关关技技术术的的发发展展，蛋蛋白白质质芯芯片片技技术术因因此应运而生此应运而生。二二 蛋白质芯片的概念蛋白质芯片的概念蛋白质芯片蛋白质芯片是将各种微量纯化的蛋白是将各种微量纯化的蛋白质阵列在一种高密度的固相载体上，质阵列在一种高密度的固相载体上，并与待测样品杂交，以测定相应蛋白并与待测样品杂交，以测定相应蛋白质的性质、特征以及蛋白质与生物大质的性质、特征以及蛋白质与生物大分子之间的相互作用的方法。分子之间的相互作用的方法。三三 蛋白质芯片的主要特点蛋白质芯片的主要特点1.1.高通量高通量2.2.灵敏度较高灵敏度较高3.3.重复性好重复性好4.4.操作自动化操作自动化四四 蛋白质芯片的分类蛋白质芯片的分类u按蛋白质性质分类按蛋白质性质分类1.1.无无活活性性芯芯片片：将将已已经经合合成成好好的的蛋蛋白白质质以以高高密密度度阵阵列列点点样样在在芯芯片片上上，进进行行杂杂交交反反应。应。2.2.有有活活性性芯芯片片：把把生生物物体体直直接接点点在在芯芯片片上上，并原位表达蛋白质。并原位表达蛋白质。u按形式分类按形式分类1.1.玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建）玻璃载玻片芯片（在玻璃表面构建）2.3-D2.3-D胶芯片（在多孔凝胶垫上构建）胶芯片（在多孔凝胶垫上构建）3.3.微孔芯片（在微孔板上构建）微孔芯片（在微孔板上构建）不同种类的蛋白质芯片的特不同种类的蛋白质芯片的特点点类别类别特点特点玻璃表面构建的玻璃表面构建的蛋白质芯片蛋白质芯片可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便很容易蒸发；不适合用于多步反应；造价便宜；容量较小；容易发生交叉污染宜；容量较小；容易发生交叉污染多孔微胶垫上构多孔微胶垫上构建的蛋白质芯片建的蛋白质芯片可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；不易蒸发；可以用于多步反应，不易蒸发；可以用于多步反应，但是有其较但是有其较固定的缓冲条件；造价昂贵；固定的缓冲条件；造价昂贵；容量较大；不容量较大；不易发生交叉污染易发生交叉污染微孔板上构建的微孔板上构建的蛋白质芯片蛋白质芯片可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；可以与基因芯片的制作和检测工具配套使用；不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容不易蒸发；适用于多步反应；造价便宜；容量较大；不易发生交叉污染量较大；不易发生交叉污染五五 蛋白质芯片技术的简介蛋白质芯片技术的简介操作步骤操作步骤提出生物学问题提出生物学问题（实验目的）（实验目的）样品预处理样品预处理（重组蛋白，制备一、二级抗体，重组蛋白，制备一、二级抗体，荧光标记，配蛋白印记缓冲液）荧光标记，配蛋白印记缓冲液）生化反应生化反应化学偶合，加底物，化学偶合，加底物，反应温度和时间，反应温度和时间，冲洗条件冲洗条件检测检测（荧光和比色扫描或拍照，（荧光和比色扫描或拍照，参数设置）参数设置）数据分析和建模数据分析和建模（图象量化，标准化，图象量化，标准化，采集蛋白信息，建立模型）采集蛋白信息，建立模型）3 3蛋白质芯片制备蛋白质芯片制备6 61 1（一）蛋白质芯片的制备（一）蛋白质芯片的制备一一 固相载体及其处理固相载体及其处理载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）二二 蛋白质的预处理蛋白质的预处理选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解三三 点制微阵列点制微阵列可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等四四 固定微阵列上的蛋白样点固定微阵列上的蛋白样点膜为载体：芯片放入湿盒膜为载体：芯片放入湿盒,37,37C 1hC 1h载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白载玻片为载体：化学修饰产生醛基固定蛋白五五 微阵列的封闭微阵列的封闭主要封闭试剂：主要封闭试剂：BSABSA（二）抗原抗体的固化（二）抗原抗体的固化1 1 化学性固定化学性固定化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离化学性配基包括疏水基团、阴离子、阳离子、金属离子、混合离子等子、金属离子、混合离子等 2 2 生物性固定生物性固定生物性配基包括受体、配体、酶、抗体生物性配基包括受体、配体、酶、抗体-抗抗原等原等 （三）捕获分子（三）捕获分子1 1 抗体抗体由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一由于具有高度的特异性和亲和性，单克隆抗体是比较好的一种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰种探针蛋白质。用其构筑的芯片可用于检测蛋白质的表达丰度及确定新的蛋白质。度及确定新的蛋白质。2 2 寡聚核苷酸寡聚核苷酸适配体适配体,即寡聚核苷酸即寡聚核苷酸 能够作为捕获分子用于连接蛋白质，能够作为捕获分子用于连接蛋白质，并且有很高的特异性和亲和力。并且有很高的特异性和亲和力。3 3 肽样寡聚体肽样寡聚体鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系鉴于多肽具有小分子和蛋白质的双重优势，在蛋白质芯片系统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。统中，多肽是另一种具有发展前景的捕获分子。4 4 小分子配体小分子配体制备捕获分子最为有效的方式制备捕获分子最为有效的方式小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行小分子配体的鉴定主要通过组合文库的方法进行5 5 重组蛋白重组蛋白纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在纯化或重组蛋白是另一种类型的捕获分子，特别是应用于在蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋蛋白质功能分析方面，如蛋白质相互作用、翻译后修饰、蛋白质白质-小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合小分子间相互作用和自身抗体。重组蛋白可以以融合蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。蛋白的形式，从体外表达的细菌系统中分离纯化。（四）微阵列设计与制备（四）微阵列设计与制备1 1 人工制备芯片人工制备芯片 主要有两种主要有两种,即手工点样和免疫打点印迹即手工点样和免疫打点印迹装置。装置。存在着的明显问题是不能够建立高密度存在着的明显问题是不能够建立高密度芯片、样品和捕获分子消耗大和敏感性较芯片、样品和捕获分子消耗大和敏感性较低低2 2 微阵列制备仪微阵列制备仪主要有主要有直接接触式和非接触式两种类型直接接触式和非接触式两种类型,也也是目前市场上常用的两种方法是目前市场上常用的两种方法（五）抗原或抗体的标记（五）抗原或抗体的标记1 1 酶标记酶标记常用的标记酶有辣根过氧化物酶常用的标记酶有辣根过氧化物酶(HRP)(HRP)、碱性磷酸酶碱性磷酸酶(AP)(AP)等等.2 2 荧光物标记荧光物标记荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨荧光免疫分析中常用的荧光物质有异硫氨酸荧光素、丹磺酰氯、罗丹明酸荧光素、丹磺酰氯、罗丹明-异硫氰酯异硫氰酯等。等。（六）蛋白质芯片检测方法（六）蛋白质芯片检测方法1 1 以质谱技术为基础的直接检测法以质谱技术为基础的直接检测法如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术如表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-(SELDI-TOF-MS),TOF-MS),可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化可以使吸附在芯片表面的靶蛋白离子化,在电场在电场力的作用下飞行力的作用下飞行,通过检测离子的飞行时间计算出质量电通过检测离子的飞行时间计算出质量电荷比荷比,用以分析蛋白质的分子量和相对含量。用以分析蛋白质的分子量和相对含量。2 2 蛋白质标记法蛋白质标记法常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中常用的芯片信号检测是将芯片置入芯片扫描仪中,通过采通过采集各反应点的荧光位置、荧光强弱集各反应点的荧光位置、荧光强弱,再经相关软件分析图再经相关软件分析图像像,即可以获得有关生物信息。即可以获得有关生物信息。六六 蛋白质芯片的应用蛋白质芯片的应用1 1 用用于于蛋蛋白白质质-蛋蛋白白质质、蛋蛋白白质质-核核酸酸、蛋蛋白白质质-脂脂类类等等相相互互作作用用研研究究；特特异异性性蛋蛋白白质质的的筛筛选选；功功能能蛋蛋白白质质组组研研究。究。例例如如，应应用用酵酵母母蛋蛋白白质质芯芯片片进进行行钙钙调调蛋蛋白白的的研研究究；应应用用磷磷脂脂酰酰肌肌醇醇来来筛筛选磷脂酰肌醇的结合蛋白。选磷脂酰肌醇的结合蛋白。2 2 疾疾病病诊诊断断的的研研究究。目目前前，临临床床上上应应用用的的蛋蛋白白质质芯芯片片主主要要是是用用于于检检测测肿肿瘤瘤标标志志物物的的蛋蛋白白质质芯芯片片。它它的的应应用用范范围围主主要要在在以以下几个方面：下几个方面：（1 1）用用于于肿肿瘤瘤患患者者的的辅辅助助诊诊断断、疗疗效效判判断断、病病情情监监测测、预预后后评评估估及及判判断断肿肿瘤瘤有有无无复复发和转移等。发和转移等。（2 2）用用于于肿肿瘤瘤高高危危人人群群的的定定期期筛筛查查。高高危危人人群群主主要要是是指指4545岁岁以以上上的的人人群群、患患各各种种慢慢性性炎炎症症和和各各种种慢慢性性疾疾病病的的患患者者、有有肿肿瘤家族史和肿瘤高发区居民等。瘤家族史和肿瘤高发区居民等。（3 3）用用于于肿肿瘤瘤分分子子流流行行病病学学调调查查及及肿肿瘤瘤生生物学研究物学研究。3 抗抗体体筛筛查查。例例如如，对对噬噬菌菌体体抗抗体体库库一一次次可可对对上上万万个个不不同同的的抗抗体体克克隆隆进进行检测。行检测。4 药物筛选、药代动力学研究。药物筛选、药代动力学研究。5 在毒理学中的应用。在毒理学中的应用。6 环境监测环境监测。7 食品卫生安全的监测。食品卫生安全的监测。