分子肿瘤概论(研究生)学生总结ppt课件.ppt

绪绪 论论 重庆医科大学病理教研室重庆医科大学病理教研室 王娅兰王娅兰 教授教授(博士生导师博士生导师)分子病理学分子病理学(molecular pathology)(molecular pathology)基本概念基本概念 现代分子生物学现代分子生物学 vs vs 传统病理学传统病理学 疾病发生过程中疾病发生过程中 分子事件及其与疾病发生的关系分子事件及其与疾病发生的关系 揭示揭示 根本机制根本机制 个性化治疗依据个性化治疗依据 本课程基本内容本课程基本内容 针对基本病理过程针对基本病理过程 分子事件分子事件本课程组人员构成本课程组人员构成 分子肿瘤概论分子肿瘤概论一、有关肿瘤的基本概念（复习）一、有关肿瘤的基本概念（复习）肿瘤（肿瘤（tumor,neoplasm)tumor,neoplasm)基因水平基因水平 调控失常调控失常 异常增生异常增生 新生物新生物肿瘤生物学行为肿瘤生物学行为-浸润、转移能力浸润、转移能力 浸润浸润 (invasion)(invasion)：起源处迁移：起源处迁移 侵入周围邻近组织侵入周围邻近组织转移转移(metastasis)(metastasis)：从原发部位从原发部位血管、淋巴管、体腔血管、淋巴管、体腔它处继续生长它处继续生长与原发瘤同样类型肿瘤与原发瘤同样类型肿瘤 （转移瘤或继发瘤）（转移瘤或继发瘤）转移的途径转移的途径浸润生长是恶性肿瘤生长的特点，浸润生长是恶性肿瘤生长的特点，也是肿瘤转移过程必经的第一步。也是肿瘤转移过程必经的第一步。肿瘤的组织结构肿瘤的组织结构 实质实质 （parenchyma)parenchyma)间质间质 （mesenchyma,stroma)mesenchyma,stroma)肿瘤间质的主要成分肿瘤间质的主要成分1 1 血管血管毛细血管，小动、静脉毛细血管，小动、静脉血窦样血管血窦样血管血管球样增生血管球样增生 血管内皮增生肿胀，绒癌、浅表皮肤黑色素瘤则无血血管内皮增生肿胀，绒癌、浅表皮肤黑色素瘤则无血管，通过弥散获氧管，通过弥散获氧2 2 结缔组织间质结缔组织间质 （1 1）纤维和基质）纤维和基质 胶原纤维胶原纤维 常规常规 HE HE-红红 特殊化学染色特殊化学染色 VGVG 改良法改良法-红红 Masson Masson-兰色兰色 构成成分构成成分 I II IIII II III型胶原原纤维型胶原原纤维 又由相应原纤维分子构成又由相应原纤维分子构成 免疫组化或分子生物学方法可区别免疫组化或分子生物学方法可区别弹力纤维弹力纤维 常规常规 HEHE-淡红色淡红色 特殊化学染色特殊化学染色 WeigertWeigert或或Verhceff-Verhceff-暗兰或黑色，弹力暗兰或黑色，弹力 酶消化后阴性酶消化后阴性 网状纤维网状纤维 银染银染-黑色，故也称嗜银纤维。黑色，故也称嗜银纤维。PAS-PAS-强阳性强阳性 成分成分 胶原蛋白为主要成分胶原蛋白为主要成分 细胞间质网状纤维细胞间质网状纤维-型胶原蛋白型胶原蛋白 基底膜网状纤维基底膜网状纤维-型胶原蛋白和型胶原蛋白和 层黏连蛋白（层黏连蛋白（lamininlaminin）纤维黏连蛋白纤维黏连蛋白 FibronectinFibronectin（FNFN）作用作用 A.A.连接基质中各种成分连接基质中各种成分 B.B.介导细胞外基质成分与细胞表面连接介导细胞外基质成分与细胞表面连接黏蛋白黏蛋白 又称蛋白多糖（又称蛋白多糖（proteoglycanproteoglycan）如透明质酸，硫酸肝素等如透明质酸，硫酸肝素等 骨黏素骨黏素 （osteonectinosteonectin）（2 2）基底膜）基底膜 (basement membrane,BM)(basement membrane,BM)多种成分多种成分 与肿瘤浸润关系密切与肿瘤浸润关系密切 型胶原型胶原 -不形成纤维，与不形成纤维，与、型胶原不同型胶原不同 层黏连蛋白层黏连蛋白 （laminin,LMlaminin,LM）-有与细胞膜有与细胞膜LM LM 受体相结合的位点受体相结合的位点 （3 3）细胞成分）细胞成分 固有的细胞成分固有的细胞成分 -纤维母细胞和纤维细胞纤维母细胞和纤维细胞-肌纤维母细胞肌纤维母细胞 -间充质细胞间充质细胞 -巨噬细胞巨噬细胞-树突状细胞树突状细胞 反应性细胞成分反应性细胞成分 各种细胞浸润各种细胞浸润 -淋巴细胞淋巴细胞 最常见最常见 -浆细胞浆细胞 -巨噬细胞巨噬细胞 都属免疫活性细胞都属免疫活性细胞 二、肿瘤浸润、转移的分子机制二、肿瘤浸润、转移的分子机制（一）肿瘤细胞的浸润转移（一）肿瘤细胞的浸润转移 1.1.肿瘤细胞增殖和扩展肿瘤细胞增殖和扩展 浸润转移的前提和基础浸润转移的前提和基础 2.2.肿瘤血管生成肿瘤血管生成(tumor angiogenesis)(tumor angiogenesis)肿瘤浸润转移的必要条件肿瘤浸润转移的必要条件3.3.肿瘤细胞分离脱落，与细胞外基质黏附肿瘤细胞分离脱落，与细胞外基质黏附 （1 1）瘤细胞表面负电荷增加）瘤细胞表面负电荷增加 （2 2）瘤细胞黏附力的改变）瘤细胞黏附力的改变 瘤细胞自身结构异常瘤细胞自身结构异常 瘤细胞同质黏附力下降瘤细胞同质黏附力下降 指同种瘤细胞之间的黏附力指同种瘤细胞之间的黏附力瘤细胞异质黏附力增加瘤细胞异质黏附力增加 指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力指肿瘤细胞与其它不同细胞及间质的黏附力同质黏附力降低，有利于肿瘤细胞分离；同质黏附力降低，有利于肿瘤细胞分离；异质黏附力的增加，有利于瘤细胞与基底膜、间质成分粘附并异质黏附力的增加，有利于瘤细胞与基底膜、间质成分粘附并穿过这些组织穿过这些组织均由黏附因子介导均由黏附因子介导通过配通过配-受体之间的识别和结合实现受体之间的识别和结合实现 （3 3）肿瘤黏附因子）肿瘤黏附因子(adhesion molecules)(adhesion molecules)细胞表面结构细胞表面结构 钙黏蛋白钙黏蛋白(cadherin)(cadherin)又称为钙连接素，钙黏素。又称为钙连接素，钙黏素。依赖细胞外钙依赖细胞外钙 介介导导钙钙离离子子依依赖赖性性细细胞胞与与细细胞胞（同同源源细细胞胞）的的黏附黏附 据分布不同据分布不同 E-E-钙黏蛋白钙黏蛋白 P-P-钙黏蛋白钙黏蛋白 N-N-钙黏蛋白钙黏蛋白 H-cad H-cad 整合素整合素(integrin)(integrin)-细胞表面糖蛋白细胞表面糖蛋白 ，约有，约有20 20 多个亚型多个亚型 -各种肿瘤细胞表面整合素种类不同各种肿瘤细胞表面整合素种类不同-肿瘤生长各个阶段表达水平也不同肿瘤生长各个阶段表达水平也不同 免免 疫疫 球球 蛋蛋 白白 超超 基基 因因 家家 族族(immunoglobulin(immunoglobulin superfamily)superfamily)主要参与细胞与细胞间的连接主要参与细胞与细胞间的连接 ICAM-1 ICAM-1（细胞间黏附分子（细胞间黏附分子-1-1）VCAM-1 VCAM-1（血管黏附因子）（血管黏附因子）NCAM NCAM（神经细胞黏附因子）（神经细胞黏附因子）其它其它 包括包括CEA CEA、DCCDCC选择素选择素(selectin)(selectin)内源性植物凝血素（凝集素）内源性植物凝血素（凝集素）作用作用 介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附介导内皮细胞、血小板与瘤细胞黏附 选择素家族包括：选择素家族包括：P-selectin P-selectin E-selectin E-selectin L-selectin L-selectin CD44 CD44 及其它及其它 CD 44(CD 44(透明质酸受体透明质酸受体)路易斯寡糖（路易斯寡糖（SLESLEX X，,s-Lewis,s-LewisX X ）4.4.瘤细胞的迁移瘤细胞的迁移(migration)(migration)及化学趋向性及化学趋向性 (1)(1)瘤细胞的运动瘤细胞的运动 黏附；肌动蛋白、微管、中间丝黏附；肌动蛋白、微管、中间丝 (2)(2)瘤细胞运动的调节瘤细胞运动的调节据其作用，大致可分为两大类：据其作用，大致可分为两大类：仅影响运动的因子仅影响运动的因子 迁移刺激因子（迁移刺激因子（MSFMSF）既影响运动又影响生长的因子既影响运动又影响生长的因子 AMF(AMF(自分泌运动因子自分泌运动因子)HGF/SF HGF/SF（肝细胞生长因子（肝细胞生长因子/分散因子分散因子)(3)(3)瘤细胞的化学趋向性瘤细胞的化学趋向性 21KD 21KD 的蛋白质的蛋白质 骨吸收因子骨吸收因子 5.5.细胞外基质的降解细胞外基质的降解(1)(1)肿瘤浸润细胞外基质的步骤肿瘤浸润细胞外基质的步骤 Liotta 1986Liotta 1986年提出年提出 第一步第一步 黏附于基底膜或其他间质成分黏附于基底膜或其他间质成分 第二步第二步 分泌蛋白酶并激活分泌蛋白酶并激活,降解瘤细胞降解瘤细胞 邻近的细胞外基质邻近的细胞外基质 第三步第三步 进入受蛋白酶降解的基质区域内进入受蛋白酶降解的基质区域内 (2)(2)肿瘤细胞产生的蛋白水解酶肿瘤细胞产生的蛋白水解酶丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子丝氨酸蛋白酶类及其抑制因子 纤溶酶纤溶酶基质金属蛋白酶（基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPmatrix metalloproteinases,MMP）需钙、锌离子作辅助因子需钙、锌离子作辅助因子 MMP MMP 分类分类 胶原酶：如间质胶原酶胶原酶：如间质胶原酶 （CollagenaseCollagenase）明胶酶：如明胶酶明胶酶：如明胶酶A(gelatinase A)A(gelatinase A)间质溶素：如间质溶素间质溶素：如间质溶素1 1、2 2 膜型基质金属蛋白酶：膜型基质金属蛋白酶：、型型 胱氨酸蛋白酶类胱氨酸蛋白酶类 Cathepsin B Cathepsin B 天（门）冬氨酸蛋白酶天（门）冬氨酸蛋白酶 cathepsin D,E cathepsin D,E 6.6.瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子瘤细胞以主动方式入循环管道并形成栓子 微小淋巴管、微小静脉壁微小淋巴管、微小静脉壁 缝隙缝隙 血管血管 基底膜缺损基底膜缺损 瘤细胞存在形式瘤细胞存在形式 单个单个 成团成团 同类癌栓同类癌栓 异类癌栓异类癌栓 黏附分子对其发挥调节作用黏附分子对其发挥调节作用 7.7.在在特特定定器器官官的的毛毛细细血血管管滞滞留留并并黏黏着着，再再次次穿穿过过血血管管壁壁并并定定居居、增殖增殖 器官特异性（选择性）机制器官特异性（选择性）机制 (1)(1)黏附分子的作用黏附分子的作用 (2)(2)化学趋化因子（归巢现象化学趋化因子（归巢现象)(3)(3)微环境不适合微环境不适合 (4)(4)与免疫状态有关与免疫状态有关 （二）机体免疫状态与肿瘤浸润转移（二）机体免疫状态与肿瘤浸润转移 参与控制转移的免疫细胞主要有参与控制转移的免疫细胞主要有 NK NK 细胞细胞 巨噬细胞巨噬细胞 T T 淋巴细胞淋巴细胞 （三）肿瘤浸润转移相关基因（三）肿瘤浸润转移相关基因 转移相关基因转移相关基因指指基基因因的的表表达达和和改改变变能能够够促促进进或或导导致致肿肿瘤瘤发发生生转转移移的的基基因因 （四）肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移（四）肿瘤表观遗传改变与肿瘤浸润转移表观遗传学表观遗传学(Epigenetics)(Epigenetics)-与遗传学与遗传学(genetic)(genetic)相对应的概念相对应的概念-表型状态改变，基因型不改变表型状态改变，基因型不改变 -没有没有DNADNA序列变化的情况下，序列变化的情况下，可遗传的基因表达改变，导可遗传的基因表达改变，导致的基因产物的变化。致的基因产物的变化。-1942-1942年提出，上世纪年提出，上世纪8080年代后期逐渐兴起的一门新学科年代后期逐渐兴起的一门新学科 DNADNA的的“后天性后天性”修饰修饰 CpGCpG岛高甲基化岛高甲基化癌细胞基因组低甲基化癌细胞基因组低甲基化组蛋白残基的各种修饰组蛋白残基的各种修饰磷酸化磷酸化乙酰化乙酰化甲基化甲基化（五）肿瘤干细胞（五）肿瘤干细胞(tumor stem cell,TSC)(tumor stem cell,TSC)2001 2001年由年由ReyaReya等提出等提出 20062006年美国癌症研究协会（年美国癌症研究协会（AACRAACR）定义）定义 存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分存在于肿瘤组织中具有无限自我更新能力并能产生不同分化程度的肿瘤细胞的细胞化程度的肿瘤细胞的细胞 特征特征 (1)(1)无限增殖和多向分化无限增殖和多向分化 (2)(2)存在自我更新的信号传导途径存在自我更新的信号传导途径 (3)(3)具不同表型，异质性，对放化疗不敏感具不同表型，异质性，对放化疗不敏感 (4)(4)具有端粒酶活性具有端粒酶活性 (5)(5)能转移到各种不同的组织能转移到各种不同的组织 （六）肿瘤微环境与肿瘤浸润转移（六）肿瘤微环境与肿瘤浸润转移 肿瘤细胞肿瘤细胞间质细胞间质细胞 细胞外基质细胞外基质间质细胞所分泌的活性介质（细胞因子）间质细胞所分泌的活性介质（细胞因子）共同构成的局部内环境共同构成的局部内环境 微环境改变微环境改变肿瘤细胞肿瘤细胞-自分泌和旁分泌自分泌和旁分泌 全身和局部组织全身和局部组织-代谢、分泌、免疫代谢、分泌、免疫 结果：结果：限制或促进肿瘤的发生和发展限制或促进肿瘤的发生和发展 三三.肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用肿瘤学研究中常用的分子生物学基本技术及其应用(一一)蛋白表达异常的检测蛋白表达异常的检测-免疫组化（荧光）定位免疫组化（荧光）定位 -ELISA-ELISA和和Western blot Western blot 定量定量抗原抗原抗体抗体标标记记标标记记抗原抗原标标记记标标记记抗原抗原标标记记标标记记抗原抗原标标记记（二）基因拷贝数、转录产物（二）基因拷贝数、转录产物mRNAmRNA异常异常 -核酸分子生物学方法进行检测核酸分子生物学方法进行检测核酸变性、复性基本性质核酸变性、复性基本性质常用方法常用方法 1.1.核酸分子杂交（核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridisationnucleic acid molecular hybridisation）技术）技术最常用的基本技术最常用的基本技术基本原理：基本原理：-标记的已知碱基序列标记的已知碱基序列（DNADNA或或RNARNA单链片段）单链片段）（探针（探针probe probe）（同位素（同位素P P3232 I I125125 非同位素非同位素 生物素生物素 地高辛地高辛 荧光素）荧光素）-检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之检测靶核酸（待测核酸）中是否存在与之 同源的序列同源的序列 （1 1）原位杂交）原位杂交 （ISHISH）（2 2）荧光原位杂交）荧光原位杂交 （FISHFISH），），（3 3）双色（多色）银染原位杂交（）双色（多色）银染原位杂交（DSISHDSISH）（4 4）Southern blot(DNA Southern blot(DNA 杂交杂交)（5 5）Northern blot(RNA Northern blot(RNA 杂交杂交)2.2.聚合酶链反应（聚合酶链反应（polymerase chain reaction,polymerase chain reaction,PCRPCR）技术）技术 又称体外基因扩增又称体外基因扩增利用利用DNADNA变性和复性原理变性和复性原理体外进行体外进行特定的特定的DNA DNA 片段高效扩增片段高效扩增 获得或放大特异基因信号的重要手段获得或放大特异基因信号的重要手段扩增产物的检测扩增产物的检测 凝胶电泳分析凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 (最常用最常用)聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 单一条带单一条带 Real-time PCR Real-time PCR 原位原位PCRPCR RT-PCR RT-PCR3.3.基因芯片技术基因芯片技术(三三)基因突变的检测方法基因突变的检测方法1.1.聚合酶链反应聚合酶链反应-单链构象多态性分析（单链构象多态性分析（Single strand Single strand conformation polymorphism analysis of polymerase conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products,PCR-SSCPchain reaction products,PCR-SSCP）长度相同，但碱基序列不同的单链长度相同，但碱基序列不同的单链DNA DNA 构象不同构象不同在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳在非变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳迁移率（泳动率）不同迁移率（泳动率）不同基本方法基本方法 作作PCRPCR 将产物变性而成为单链将产物变性而成为单链 进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 显示结果显示结果 可用同位素可用同位素/荧光素标记荧光素标记 非同位素标记非同位素标记 2.PCR-2.PCR-限制性片段长度多态性（限制性片段长度多态性（restrection fragment restrection fragment length polymorphisms,RFLPlength polymorphisms,RFLP）分析技术）分析技术基本原理基本原理 -序列中一个碱基发生改变序列中一个碱基发生改变 -使原来的内切酶位点消失使原来的内切酶位点消失或产生新的酶切位点或产生新的酶切位点-用限制性内切酶消化用限制性内切酶消化PCRPCR扩增出来的扩增出来的DNADNA片段片段 -检测其酶切片段长度的差异检测其酶切片段长度的差异3.3.变性梯度凝胶电泳法（变性梯度凝胶电泳法（denaturing gradient gel denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)electrophoresis,DGGE)基本原理基本原理 电泳时，不同浓度凝胶温度不同电泳时，不同浓度凝胶温度不同 DNADNA链中有一个碱基改变链中有一个碱基改变 在不同的温度发生解链在不同的温度发生解链 电泳迁移率改变电泳迁移率改变 4.DNA 4.DNA 序列分析（序列分析（DNA sequencing DNA sequencing）5.5.荧光原位杂交荧光原位杂交 (FISH)(FISH)6 6 DNA DNA 芯片技术（芯片技术（DNA chip DNA chip）（四）肿瘤的微卫星不稳定性分析（四）肿瘤的微卫星不稳定性分析微卫星不稳定性（微卫星不稳定性（microsatellite instability,microsatellite instability,MIMI）,是指简单重复序列的增加或丢失是指简单重复序列的增加或丢失 检测方法检测方法 PCR+DNA PCR+DNA 序列凝胶电泳序列凝胶电泳（五）肿瘤易感性检测（五）肿瘤易感性检测 采用相应基因变异方法进行检测采用相应基因变异方法进行检测（六）肿瘤相关病毒（六）肿瘤相关病毒 核酸杂交技术与核酸杂交技术与PCRPCR技术技术 (七七)基因重组技术基因重组技术 主要目的是获得某一基因或主要目的是获得某一基因或DNADNA片段的大片段的大 量拷贝量拷贝 (八八)基因转染（基因转染（gene transfectiongene transfection）技术）技术（九（九）RNARNA干涉干涉(RNA interference(RNA interference）核酸杂交核酸杂交/PCR/PCR技术与免疫组化技术与免疫组化/荧光、荧光、WBWB方法结合方法结合 免疫组化免疫组化/荧光荧光 在翻译水平上定位研究基因表达在翻译水平上定位研究基因表达 核酸杂交核酸杂交/PCR/PCR技术技术 检测检测DNA/RNADNA/RNA，在基因或转录水平研究基因在基因或转录水平研究基因表达表达 （十）（十）激光捕获显微切割技术激光捕获显微切割技术(Laser capture(Laser capture microdissectionmicrodissection，LCM)LCM)-显微镜直视下显微镜直视下-组织切片组织切片-确定、分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞确定、分离、纯化单一类型细胞群或单个细胞 （十一）共聚焦激光扫描显微镜技术（十一）共聚焦激光扫描显微镜技术(Confocal Laser(Confocal Laser Scanning MicroscopeScanning Microscope，CLSM)CLSM)细胞细胞“CTCT”，上世纪，上世纪8080年代年代-组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察生理信号及细胞形态改变生理信号及细胞形态改变 应用应用 能观察各种荧光标记的能观察各种荧光标记的-组织（包括活组织）组织（包括活组织）-培养细胞培养细胞-粘附细胞粘附细胞-细胞涂片细胞涂片-石蜡切片石蜡切片-冰冻切片冰冻切片 （十二）基因芯片技术（十二）基因芯片技术 发现差异表达基因发现差异表达基因 后面内容直接删除就行后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用主要经营：网络软件设计、图文设计制作、主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等发布广告等公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！到让客户满意！致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPTPPT设计、计划书、策划案、学习课件、各设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求类模板等方方面面，打造全网一站式需求The user can demonstrate on a projector The user can demonstrate on a projector or computer,or print the presentation or computer,or print the presentation and make it into a film to be used in a and make it into a film to be used in a wider fieldwider field