粪菌移植对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障的保护.ppt

粪菌移植对溃疡性结肠粪菌移植对溃疡性结肠炎肠粘膜屏障的保护炎肠粘膜屏障的保护 导导 师：武师：武 华华 学学 生：程巩生：程巩选题依据选题依据国内外研究现状及创新国内外研究现状及创新研究方案研究方案研究计划及预算研究计划及预算选选 题题 依依 据据 粪菌移植 炎症性肠病 肠粘膜屏障粪菌移植粪菌移植n n粪菌移植(fecal microbiota transplantation，FMT)是将健康人粪便中的功能菌群移植到菌群分布异常的患者胃肠道内，重建其健康的菌群分布结构，实现肠道及肠道外疾病恢复的一种治疗方式。在世界医学史上至少始于公元4世纪，但是直到近几年才得到了恢复的一种治疗方式。FMT在现代医学中的概念包括4个层面的含义：(1)从健康捐赠者粪便中分离功能菌群；(2)移植到患者消化道；(3)重建患者肠道菌群状态；(4)目的在于治疗肠内外疾病。炎症性肠病炎症性肠病 炎症性肠病炎症性肠病炎症性肠病炎症性肠病inflammatory bowel diseases inflammatory bowel diseases inflammatory bowel diseases inflammatory bowel diseases IBD IBD IBD IBD 是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性是一组病因未明的累及胃肠道的慢性炎症性疾病包括溃疡性结肠炎疾病包括溃疡性结肠炎疾病包括溃疡性结肠炎疾病包括溃疡性结肠炎ulcerative colitis UCulcerative colitis UCulcerative colitis UCulcerative colitis UC和和和和克罗恩病克罗恩病克罗恩病克罗恩病Crohns diseasesCDCrohns diseasesCDCrohns diseasesCDCrohns diseasesCD。近年来发病率呈。近年来发病率呈。近年来发病率呈。近年来发病率呈逐年上升趋势逐年上升趋势逐年上升趋势逐年上升趋势 其病因和发病机制尚不明确，与遗其病因和发病机制尚不明确，与遗其病因和发病机制尚不明确，与遗其病因和发病机制尚不明确，与遗传环境微生物免疫等多种因素密切相关。传环境微生物免疫等多种因素密切相关。传环境微生物免疫等多种因素密切相关。传环境微生物免疫等多种因素密切相关。肠粘膜屏障肠粘膜屏障 肠黏膜是机体中一处最大的黏膜表面肠黏膜是机体中一处最大的黏膜表面,它不但是它不但是营养物质消化吸收的重要场所，同时也是人体最大营养物质消化吸收的重要场所，同时也是人体最大的细菌储存器官和病原微生物、毒素侵入机体的主的细菌储存器官和病原微生物、毒素侵入机体的主要门户。肠黏膜屏障是指由机械屏障、生物屏障、要门户。肠黏膜屏障是指由机械屏障、生物屏障、免疫屏障等组成的一个复杂而又庞大的立体防御体免疫屏障等组成的一个复杂而又庞大的立体防御体系，其主要作用是能够有效地阻止肠道内的有害物系，其主要作用是能够有效地阻止肠道内的有害物质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、质如细菌和毒素穿过肠粘膜进入人体内其他组织、器官和血液循环，使机体内环境保持相对稳定器官和血液循环，使机体内环境保持相对稳定,维持机体的正常生命活动。维持机体的正常生命活动。当各种原因引起肠黏膜损伤、萎缩、肠道通透当各种原因引起肠黏膜损伤、萎缩、肠道通透性增加或肠道菌群失调时，就容易导致肠道细菌性增加或肠道菌群失调时，就容易导致肠道细菌易位和易位和(或或)肠源性内毒素血症，从而诱发或加重肠源性内毒素血症，从而诱发或加重全身炎性反应综合征全身炎性反应综合征(systemic inflammatory(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)response syndrome,SIRS)或引起多器官功能衰竭或引起多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF)(multiple organ failure,MOF)形成恶性循环。近形成恶性循环。近期的研究表明：炎性肠病（期的研究表明：炎性肠病（IBDIBD）病人肠黏膜对）病人肠黏膜对肠道内共生菌群不恰当的免疫反应是导致疾病发肠道内共生菌群不恰当的免疫反应是导致疾病发生发展的重要原因之一。尽管还没有确定哪一种生发展的重要原因之一。尽管还没有确定哪一种菌对肠黏膜免疫屏障有影响，但目前的研究发现菌对肠黏膜免疫屏障有影响，但目前的研究发现IBDIBD病人肠道内菌群的数量和丰度都较正常人低病人肠道内菌群的数量和丰度都较正常人低国内外研究现状及创新之处国内外研究现状及创新之处近年来FMT在治疗复发性肠道艰难梭状芽孢杆菌感染中取得了很好的疗效。因此，国外相继开始采用该方法治疗IBD。但粪菌移植治疗炎症性肠病的研究目前正处于起步阶段，尚需逐步开展针对粪菌移植治疗对照研究提供更有力的依据，因此开展粪菌移植在治疗炎症性肠病中应用的研究具有深远的现实意义。本课题旨在评价粪菌移植对炎症性肠病大鼠血清DAO及D-乳酸影响，研究其对大鼠肠粘膜屏障的保护作用。从而为进一步临床应用提供依据。国内外研究现状及创新之处国内外研究现状及创新之处 现阶段，FMT研究大部分是关于FMT治疗复发性CDI和IBD的个案或系列病例报道,但FMT导致患者肠道菌群具体发生何种有益变化及其潜在的机制仍不完全清楚。本实验在于研究粪菌移植对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜屏障的保护作用，此项研究目前鲜有报道。研究方案研究方案BBE EC CDDAA实验分组实验分组建立模型建立模型干预措施干预措施预期成果预期成果技术路线技术路线实验分组实验分组 健康雄性SD大鼠54只，体重250300g，随机分为3组：（A）空白对照组 （B）模型生理盐水组 （C）模型粪菌移植组建立模型建立模型 大鼠造模前大鼠造模前1 d1 d禁食禁食24 h24 h，不禁水，称重后，不禁水，称重后，3 3的戊巴比妥腹腔注射麻的戊巴比妥腹腔注射麻醉醉(或乙醚或乙醚)，5 52 2，4 4，6 6三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸(TNBS W(TNBS WV)V)按按100 mg100 mgkgkg一一150 mg150 mgkg(kg(约等于约等于TNBSTNBS原液原液OO4mL4mL0 06 mL6 mL相当于相当于200 g200 g大鼠大鼠20 mg20 mg30 mg)30 mg)；分别加入乙醇；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段；分别加入乙醇；体位为头朝下，用聚丙烯管插入肛门上段8 8 cmcm，注射器注人。再倒立，注射器注人。再倒立1 15 min5 min左右，以防药液溢出，左右，以防药液溢出，UCUC一次性灌一次性灌肠。肠。新鲜粪菌液制备流程：新鲜粪菌液制备流程：将供体新鲜粪便样本置于搅拌器中，将供体新鲜粪便样本置于搅拌器中，0 09 9NaClNaCl溶液进行初步均质加工（新鲜粪便与溶液进行初步均质加工（新鲜粪便与0 09 9NaClNaCl溶液的比值为溶液的比值为1:51:5）；）；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；将粪便浆体经不锈钢滤网过滤去除其中的大颗粒物质；冰冰上转运至实验室并在采集后上转运至实验室并在采集后2h2h内进行处理；内进行处理；将样本在氮气生物工程厨将样本在氮气生物工程厨内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理；内进行称重并在匀浆器中进一步匀质处理；浆体逐级经过直径浆体逐级经过直径2 20mm0mm、1 10 mm0 mm、0 05mm5mm和和0 025mm25mm的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的不锈钢滤网过滤以去除未吸收的食物残渣和小颗粒物质；的食物残渣和小颗粒物质；将再次过滤的样本以将再次过滤的样本以60006000转转minmin的速率的速率离心离心15min15min，并将沉淀再悬浮于，并将沉淀再悬浮于0 09 9NaClNaCl溶液中，得几乎无色无味的溶液中，得几乎无色无味的粪菌液。获得的新鲜粪菌液可立即进行移植，也可加入无菌甘油后置于粪菌液。获得的新鲜粪菌液可立即进行移植，也可加入无菌甘油后置于一一8080作为冰冻样本保存作为冰冻样本保存1 18 8周。周。干预措施干预措施 三组大鼠按大鼠正常灌肠剂量灌入粪菌移植液三组大鼠按大鼠正常灌肠剂量灌入粪菌移植液及生理盐水。及生理盐水。A A、B B组给生理盐水灌肠；组给生理盐水灌肠；C C组给予组给予粪菌移植液。饲养期间粪菌移植液。饲养期间,于第于第3 3、7 7、1111天天3 3个时间点个时间点每组分别取每组分别取5 5只大鼠取血测量相关指标，并取肛门只大鼠取血测量相关指标，并取肛门以上以上8cm8cm肠段卷起，置肠段卷起，置1010中性甲醛中固定，石蜡中性甲醛中固定，石蜡包埋、切片、包埋、切片、HEHE染色后显微镜下观察。在光镜下染色后显微镜下观察。在光镜下观察组织损伤程度并采用观察组织损伤程度并采用ChiuChiu氏氏6 6级评分法评估损级评分法评估损伤程度伤程度检测指标及意义检测指标及意义D-乳酸乳酸 D-D-乳酸是肠道固有细菌的代谢终产物，乳酸是肠道固有细菌的代谢终产物，几乎哺乳动物机体的各种组织均不产生几乎哺乳动物机体的各种组织均不产生D-D-乳酸，乳酸，也没有代谢分解也没有代谢分解D-D-乳酸的酶系统，所以血浆中的乳酸的酶系统，所以血浆中的D-D-乳酸基本上来源于肠道。当肠道发生急性缺血乳酸基本上来源于肠道。当肠道发生急性缺血时，局部细菌大量增殖，破坏了肠粘膜的生物屏时，局部细菌大量增殖，破坏了肠粘膜的生物屏障，由于肠缺血致肠粘膜绒毛顶端上皮脱落，细障，由于肠缺血致肠粘膜绒毛顶端上皮脱落，细胞旁路途径增加而致肠粘膜通透性增加，此时肠胞旁路途径增加而致肠粘膜通透性增加，此时肠道中细菌产生的大量道中细菌产生的大量D-D-乳酸通过受损粘膜经循环乳酸通过受损粘膜经循环入血，故监测血中入血，故监测血中D-D-乳酸水平可及时反映肠粘膜乳酸水平可及时反映肠粘膜损害程度和通透性变化。损害程度和通透性变化。检测指标及意义检测指标及意义血浆二胺氧化酶（血浆二胺氧化酶（血浆二胺氧化酶（血浆二胺氧化酶（diamine oxidasediamine oxidase，DAODAO）活性）活性）活性）活性测定测定测定测定 DAO DAO是肠粘膜细胞的标志物，存在于哺乳动是肠粘膜细胞的标志物，存在于哺乳动物小肠绒毛上层，在其他组织和细胞中几乎不存物小肠绒毛上层，在其他组织和细胞中几乎不存在，生理状况下血浆中在，生理状况下血浆中DAODAO活性很低，在肠粘膜活性很低，在肠粘膜受损时，由肠粘膜细胞释放的受损时，由肠粘膜细胞释放的DAODAO大量入血，使大量入血，使血中浓度大幅度上升。有研究证实，血浆血中浓度大幅度上升。有研究证实，血浆DAODAO活活性升高的时相早于内毒素和性升高的时相早于内毒素和D-D-乳酸，提示血浆乳酸，提示血浆DAODAO活性作为反映肠屏障功能损伤指标不仅特异活性作为反映肠屏障功能损伤指标不仅特异度强，灵敏度也较高，且检测方法简便、费用低，度强，灵敏度也较高，且检测方法简便、费用低，是反映肠粘膜结构完整性较理想的指标。是反映肠粘膜结构完整性较理想的指标。检测指标及意义检测指标及意义 HEHE染色后光镜观察组织病理改变。染色后光镜观察组织病理改变。雄性雄性SD大鼠模型大鼠模型空白对照组空白对照组粪菌移植组粪菌移植组于于3、7、11天各处死天各处死6只大鼠只大鼠测血清指标浓度取结肠组织测血清指标浓度取结肠组织HE染色后光镜观察染色后光镜观察数据数据SPSS13.0统计软件分析统计软件分析技技 术术 路路 线线生理盐水组生理盐水组统计学分析统计学分析 采用Spss13.0统计软件包进行分析，各组实验数据用均数标准差表示，血清学指标比较采用单因素方差分析，P0.05表示差异有统计学意义。预期成果预期成果 给予生理盐水保留灌肠的溃疡性结肠给予生理盐水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠与给予粪菌水保留灌肠的溃疡炎大鼠与给予粪菌水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠相比，血清性结肠炎大鼠相比，血清DAO及及D-乳乳酸检测值增大，说明粪便菌群移植对酸检测值增大，说明粪便菌群移植对于溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜屏障具于溃疡性结肠炎大鼠的肠黏膜屏障具有保护作用。有保护作用。给予粪菌水保留灌肠的溃疡性结肠炎给予粪菌水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠与给予生理盐水保留灌肠的溃疡大鼠与给予生理盐水保留灌肠的溃疡性结肠炎大鼠相比，炎症性肠病病理性结肠炎大鼠相比，炎症性肠病病理下观察损伤较轻。下观察损伤较轻。研究计划研究计划2014.08-2015.03课题调研，文献检索，做好综述2015.03-2015.7进行动物饲养，做好预实验；收集实验数据,完成实验2015.7-2016.03总结实验结果，进行统计分析撰写并发表论文研究基础研究基础vv 与本课题有关的，前期研究工作积累和已取得的与本课题有关的，前期研究工作积累和已取得的研究工作成绩研究工作成绩已参阅大量与课题相关的中英文文献及与本课题已参阅大量与课题相关的中英文文献及与本课题参考性较强的相关研究资料和理论。参考性较强的相关研究资料和理论。导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富的临床经导师武华教授有深厚的学术造诣和丰富的临床经验以及实验室实践能力，可为实验提供理论技术验以及实验室实践能力，可为实验提供理论技术指导。指导。已基本掌握动物饲养、免疫组化等试验操作的基已基本掌握动物饲养、免疫组化等试验操作的基本要领。本要领。研究基础研究基础 已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径已具备的实验条件，尚缺少的实验条件和拟解决的途径（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落（包括利用国家重点实验室和部门开放实验室的计划与落实情况）实情况）山西医科大学中心实验室拥有进行细胞培养和分子生山西医科大学中心实验室拥有进行细胞培养和分子生物学实验的设备和技术力量，包括荧光及倒置显微镜、医物学实验的设备和技术力量，包括荧光及倒置显微镜、医学图象处理系统和低温冰箱等主要仪器设备，同时可利用学图象处理系统和低温冰箱等主要仪器设备，同时可利用生理实验室及相关科室的仪器设备。实验所需的相关的分生理实验室及相关科室的仪器设备。实验所需的相关的分子生物学试剂和免疫组化试剂均可从基因工程公司和试剂子生物学试剂和免疫组化试剂均可从基因工程公司和试剂公司购买。动物中心实验室有饲养动物的动物房和饲养条公司购买。动物中心实验室有饲养动物的动物房和饲养条件。件。分子免疫实验室和动物中心的指导老师有丰富的理论实分子免疫实验室和动物中心的指导老师有丰富的理论实验技术和操作经验，可为实验提供操作理论技术指导。验技术和操作经验，可为实验提供操作理论技术指导。经费预算经费预算支出科目金额|（万元）计算根据及理由合计0.70科研业务费0.25文献检索费、复印、学术交流、开题等实验材料费0.40进行动物饲养，做好预实验；收集实验数据,完成实验仪器设备费0.50流式细胞仪等参考文献参考文献1.Harrison OJ Maloy KJ.Innate immun eactivation inintestinal homeostasis.1.Harrison OJ Maloy KJ.Innate immun eactivation inintestinal homeostasis.J Innate Immun J Innate Immun，20112011，3:585-5933:585-5932.McGuckinMA2.McGuckinMA，Eri REri R，Simms LASimms LA，etal.Intestinal barrier dysfunction In inflammatory bowel etal.Intestinal barrier dysfunction In inflammatory bowel 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7卷第卷第1313期期6.Xavier RJ,Podolsky DK.Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease J.6.Xavier RJ,Podolsky DK.Unravelling the pathogenesis of inflammatory bowel disease J.Nature,2007,448(7152):427-434Nature,2007,448(7152):427-434参考文献参考文献7.Nagalingam NA,Lynch SV.Role of the microbiota in inflammatory bowel diseases7.Nagalingam NA,Lynch SV.Role of the microbiota in inflammatory bowel diseasesJ J.Inflamm.Inflamm Bowel Dis,2012,18(5):968-984.Bowel Dis,2012,18(5):968-984.8.DuPont AW,DuPont HL.The intestinal microbiota and chronic disorders of the gut8.DuPont AW,DuPont HL.The intestinal microbiota and chronic disorders of the gutJ.Nat Rev J.Nat Rev Gastroenterol Hepatol,2011,8(9):523-531.Gastroenterol Hepatol,2011,8(9):523-531.9.Gough E,Shaikh H,Manges AR.Systematic review of intestinal microbiota transplantation(fecal 9.Gough E,Shaikh H,Manges AR.Systematic review of intestinal microbiota transplantation(fecal bacterio therapy)for recurrent Clostridium difficile infectionbacterio 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