乙腈中黄曲霉毒素B1溶液标准物质的研制及不确定度评估.pdf

以黄曲霉毒素 B1固体粉末为原料，采用重量-容量法准确配制乙腈中黄曲霉毒素 B1溶液标准物质。采用高效液相色谱串联高分辨质谱法和紫外-可见分光光度法对主要成分进行定性确证，然后开展乙腈中黄曲霉毒素 B1溶液标准物质均匀性检验和稳定性考察，采用多家实验室联合定值，并对结果进行不确定评估。结果表明，该标准物质的特性值为（4.990.13）g/mL（k=2），均匀性和稳定性良好。在-18 条件下，稳定性可延长至 24 个月，符合有证标准物质技术规范要求。采用溯源比对的方式定值，过程简单、量值准确，不确定评估合理，适合溶液标准物质的研制。关键词：黄曲霉毒素 B1；标准物质；不确定度；重量-容量法中图分类号：O656 文献标识码：ADevelopmentandUncertaintyEvaluationofSolutionCertifiedReferenceMaterialforAflatoxinB1inAcetonitrileWANG Xinglong1,2,LIU Shaoying2,ZHU Yin1,NI Xiaofeng1,CAI Qiang1*(1.Yangtze Delta Region Research Institute of Tsinghua University,Jiaxing 314000,China;2.Hangzhou Center for Disease Prevention and Control,Hangzhou 310000,China)Abstract:Using aflatoxin B1 solid powder as the raw material,the weight volume method is used to accurately prepare the standard substance for aflatoxin B1 solution in acetonitrile.Qualitative confirmation of the main components is carried out using high performance liquid chromatography tandem high resolution mass spectrometry and ultravioletvisible spectroscopy.Then,the homogeneity test and stability inspection of aflatoxin B1 solution reference material in acetonitrile are carried out,and several laboratories are used to jointly determine the value,and the results are evaluated for uncertainty.The results show that the certified value of this standard substance is(4.990.13)g/mL(k=2),with good uniformity and stability.At-18 ,the stability can be extended to 24 months,meeting the requirements of certified reference material technical specifications.The method of traceability comparison is used to determine the value,which is simple in process,accurate in quantity,reasonable in uncertainty evaluation,and suitable for the development of solution reference materials.Keywords:aflatoxin B1;certified reference material;uncertainty;gravimetric-volumetric method黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）主要是由黄曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（A.parasiticus）等多种真菌产生的次生代谢产物，是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮（香豆素）。从国内外部分地区 AFTB1污染状况及膳食暴露风险评估中发现，虽然总体污染水平不高1-3，但是黄曲霉毒素有显著的慢性毒性，摄入大剂量AFTB1后会对氧化、遗传、肝脏系统造成一定程度的损伤4-5。目前不同国家和地区对黄曲霉毒素检测种类和限值要求均不同，例如我国 食品安全国家标准 食品中真菌毒素含量（GB 27612017）中对AFTB1有限量要求，欧盟除规定了 AFTB1的限量外，还作者简介：王兴龙（1988），男，山东德州人，硕士，助理研究员，研究方向为食品安全与营养相关的检测分析。通信作者：蔡强（1972），男，安徽蚌埠人，博士，研究员，研究方向为环境与食品相关的检测分析。E-mail：。第 4 期83王兴龙等：乙腈中黄曲霉毒素B1溶液标准物质的研制及不确定度评估规定了 4 种黄曲霉毒素总和的限量要求。真菌毒素标准物质，无论从品种上还是从数量上都无法满足国际互认和量值比对的溯源需要，因此有必要开展系统的AFTB1标准物质的研制工作，对于保证食品中 AFTB1监测检测及风险评估数据一致性评价具有重要意义。根据标准物质量值的溯源性、准确度、精密度等技术指标，本研究采用高效液相色谱串联高分辨质谱法、紫外-可见光谱法对 AFTB1进行表征与鉴定。通过使用满足计量学特性要求的测量方法和计量器具，采用了8家实验室联合定值，同时考察了其均匀性、稳定性，并系统地评估了在研制过程引入的不确定度。1 材料与方法1.1 仪器与试剂1260 高效液相色谱仪，美国 Agilent 公司；QE高分辨液质联用仪，美国 Thermo Scientific 公司；Lambda 35 紫外-可见分光光度计，美国 PerkinElmer公司；XSE105DU电子天平，美国Mettler Toledo公司；Milli-Q 超纯水仪，美国 Millipore 公司。黄曲霉毒素 B1标准溶液（GBW 10174），中国计量科学研究院；黄曲霉毒素B1固体粉末（纯度99%以上），以色列 Fermentek 公司；乙腈，色谱纯，德国默克公司。1.2 实验方法1.2.1 标准物质候选物选择为了进一步确认原料（黄曲霉毒素 B1固体粉末）的准确可靠，分别采用高分辨质谱法、紫外分光光度法对购买的原料进行了主成分定性分析。将经过主成分定性分析的标准物质原料，采用重量-容量法配制标准物质溶液6。黄曲霉毒素 B1在乙腈中相对稳定7，因此选择适量乙腈，将 9.97 mg AFTB1固体充分溶解，将冷却后的溶液沿玻璃棒小心转入 2 000 mL 的容量瓶中，定容至刻度。分装至 5 mL 洁净干燥器的棕色安瓿瓶中，每个包装量为 4 mL，将安瓿瓶快速熔封，共分装 474 个包装单元，置于-18 冰箱内保存。AFTB1原料充足，满足复制的要求。1.2.2 定性分析（1）高效液相色谱条件色谱柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm2.1 mm，1.9 m）；流动相：A 为超纯水，B 为乙腈-甲醇溶液（体积比 1 1）；柱温：35；进样量：2 L；等度洗脱。（2）高分辨质谱条件NCE：30/50/70；模 式：Full MS/ddMS2，Full MS分辨率为 70 000，dd MS2分辨率为 17 500；离子源模式为 ESI+。（3）紫外-可见光谱分析采用紫外-可见光谱分析法测定配制好的AFTB1溶液标准物质，波长扫描范围为200450 nm，分析化合物紫外可见光吸收光谱。1.2.3 高效液相色谱-紫外检测法定量分析色谱柱：XTerra RP18（150 mm4.6 mm，5 m）；流动相：乙腈-甲醇溶液（50+50）；柱温 35；进样体积：10 L；紫外检测器：检测波长为 359 nm；标准溶液及待测溶液直接进样，外标法单点定值。梯度洗脱01 min，B相30%；17 min，B相变化至90%；7 9 min，B 相保持 100%；9 13 min，B 相保持 30%。1.2.4 均匀性检验根据 标准物质的定值及均匀性、稳定性评估（JJF 13432022）8，对标准物质进行均匀性研究。采用简单随机抽取方式，抽取 15 瓶样品，按照 1.2.3 确定的分析方法，每一瓶抽取 3 份子样进行测定，最小取样量为 10 L。采用单因素方差分析法（F 检验法）对检测数据进行统计分析9，判断标准物质的均匀性。1.2.5 稳定性考察稳定性是所有标准物质的关键特征之一，通常评估样品短期稳定性和长期稳定性。短期稳定性评估采用同步稳定性评估方法，将制备好的溶液标准物质统一保存在 60 条件下，分别在第 0 天、第 1 天、第3 天、第 5 天、第 7 天取 2 份样品于-18 下保存，所有取出的样品平行测定 2 次。长期稳定性评估，在-18 条件下，分别于第 0 个月、第 1 个月、第 3 个月、第 6 个月每个时间点取 2 个样品，每个样品平行测定3 次。以监测时间和监测结果拟合直线，采用趋势分析法对结果进行统计分析10。1.2.6 标准物质的定值本溶液标准物质采用 8 家实验室间联合定值。为确保定值过程中的可溯源性与质量控制，在定值过84生物化工2023 年程中将标准物质溶液直接与一级有证标准物质溶液GBW 10174 比对，单点外标法定值。向每家定值单位发放2个包装的AFTB1溶液标准物质（包装1、包装2），每个包装平行测定 6 次，提供 12 个测定结果。数据经过正态分布检验、组内可疑值检验、组间数据精度检验后，将有效数据汇总，计算总平均值和标准偏差。2 结果与分析2.1 高分辨质谱定性分析将 AFTB1溶液标准物质用 20%乙腈水溶液逐级稀释至 100 ng/mL，按照 1.2.2 项方法进行测试，测定结果见图 1。得出的 AFTB1质荷比为 313.069 64，AFTB1理论质荷比为 313.070 6611。按照高分辨质谱的判定原则，两者基本符合。AFTB1主要碎片离子285.1、241.0，与国家标准GB 5009.22201612相一致。由此可以判定，溶液中的主成分为 AFTB1。2.2 紫外光谱分析定性研究AFTB1化合物在乙腈中的紫外-可见光谱如图 2所示，在 223 nm，264 nm 和 359 nm 波段左右处，存在最大吸收，与 RODRICKS13报道的 AFTB1在甲醇中的最大吸收波段（223 nm、265 nm 和 361 nm）基本一致，初步鉴定化合物为 AFTB1。2.3 均匀性检验及最小取样量的确定对随机抽取的 15 个样本中黄曲霉毒素 B1实测数据采用 F 检验进行统计分析，通过组间方差和组内方差的比较判断各组测量值之间有无系统误差。查表得 F（0.05,14,30）=2.037，乙腈溶液中黄曲霉毒素 B1成分分析标准物质均匀性数据的 F 计算值为1.145，小于 F（0.05,14,30）=2.037，说明在95%的置信区间内，乙腈中黄曲霉毒素B1分布均匀，同时确定最小取样量为10 L。2.4 稳定性检验短期稳定性是评估运输过程对标准物质量值的影响。在 95%置信水平下进行短期稳定性评估，发现乙腈中黄曲霉毒素 B1测定值随时间变化的拟合直线斜率为|1|=0.000 244，斜率标准偏差 S(1)=0.001 141，t0.95,3=3.18，|1|t0.095,3S(1)。说明 60 条件下，乙腈中黄曲霉毒素在 7 d 内是稳定的。m/z100806040200150200201.090 52214.061 81241.048 78242.056 55269.043 67270.051 39285.074 89313.069 64257.080 08243.064 44229.085 22284.066 99298.046 26300250350相对丰度/%图 1 黄曲霉毒素 B1的高分辨质谱图波长/nm0.600.550.500.450.400.350.300.250.200.150.100.050.00-0.04191200300400250350451吸光度0.63图 2 乙腈中黄曲霉毒素 B1的紫外光谱第 4 期85王兴龙等：乙腈中黄曲霉毒素B1溶液标准物质的研制及不确定度评估长期稳定性数据以平均值归一化后，其结果见图 3。虚线内的两条黑实线代表乙腈中黄曲霉毒素 B1随时间变化的不确定度。在 95%置信水平下，乙腈中黄曲霉毒素 B1测定值随月份变化的拟合直线斜率为|1|=0.000 714 286，斜率标准偏差 S(1)=0.001 649 572，t0.95,3=4.30，|1|t0.095,3S(1)。乙腈中黄曲霉毒素 B1溶液标准物质在-18 条件下储存至少6个月内稳定。基于趋势分析，可将货架期延长至 24 个月，以此来评估长期稳定性引入的不确定度14。99.21%100.79%9095100105110051015202530浓度/%时间/月图 3 乙腈中黄曲霉毒素 B1长期稳定性归一化结果2.5 联合定值的结果本次定值共有 8 家单位（A、B、C、D、E、F、G、H）参与，均参考 1.2.3 确定的方法进行测定，详见 表 1。根据达戈斯提诺（DAgostioon）法检验数据的正态性。统计量 Y=1.49，位于-3.61 1.59（p=0.99），故接受所有数据为正态分布；经格拉布斯（Grubbs）法检验，所有参与定值实验室的每组数据中|v1|均（0.05,12）s，无可疑值需要剔除；经科克伦（Cochran）法检验，科克伦检验结果 C 为 0.160，小于 C（0.05,8,12）=0.275，说明各组间数据等精密度。因此，乙腈溶液中黄曲霉毒素 B1定值结果为 8家实验室测定结果的总平均值，即 4.99 g/mL。2.6 不确定度评定根据相关文献及技术规范8，确定了影响乙腈中黄曲霉素毒素 B1测定结果的各个不确定度分量，主要包括：标准物质的均匀性引起的不确定度 u(bb)；标准物质的稳定性引起的不确定度；标准物质的定值过程带来的 A 类不确定度和 B 类不确定度。2.6.1 均匀性引入的不确定度根据均匀性测定结果，由均匀性引入的不确定度可按式（1）表示6。22422)sSu bbnv=(（1）式中：S2为组内方差；n 为组内测量次数，n=3；vs为组内自由度，Vs=30。均匀性检验过程中，15 个样本，3 平行，45 个数据的均值为 5.04。则由均匀性检验引入的相对不确定度为()()()()()()2242relrelrelA2)0.007 20.143%5.040.001 14 70.160%4.9970.001 65 240.792%5.003sSu bbnvu bbubbXu stsustsXu ltsultsXsun=(2.6.2 稳定性引入的不确定度由稳定性引入的不确定度可按式（2）表示15。u(ts)=s(1)X （2）式中：s(1)为回归分析斜率的标准偏差；X 为稳定性评估的时间。短期稳定性考察时，14 个样本的平均值为 4.997 g/mL；长期稳定性考察时，12个样本的平均值为5.003 g/mL。则由短期稳定性引入的相对不确定度为()()()()2242relrelrelA2)0.007 20.143%5.040.001 14 70.160%4.9970.001 65 240.792%5.003sSu bbnvu bbubbXu stsustsXu ltsultsXsun=(由长期稳定性引入的相对不确定度为()()relA2)0.072 00.143%5.040.001 14 70.160%4.9970.001 65 240.792%4.997u ltsultsXsun=(。2.6.3 定值过程引入的不确定度定值过程引入的 A 类不确定度按式（3）计算16。表 1 联合实验室定值结果单位测定结果/（g/mL）平均值/（g/mL）RSD/%123456789101112A4.984.975.035.045.005.054.964.984.945.035.085.045.010.85B5.055.014.914.984.965.054.944.945.035.104.985.095.001.23C5.065.064.974.964.974.995.095.045.044.934.925.045.011.12D5.004.954.935.005.084.964.964.965.024.985.044.974.990.86E4.904.925.094.974.984.985.044.914.904.904.954.934.961.22F5.065.064.954.974.904.925.065.055.035.014.925.035.001.23G4.985.044.975.064.975.015.055.074.965.094.905.035.011.11H4.904.944.934.904.924.954.965.064.974.965.035.024.961.03注：表中 1 6 为包装 1 的测定结果，7 12 为包装 2 的测定结果。86生物化工2023 年A2)0.072 00.143%5.040.001 14 70.160%4.9970.001 65 240.792%4.997sSu bbnvu bbubbXu stsustsXu ltsultsXsun=（3）式中：s 为各实验室定值结果平均值的标准偏差；n 为实验室个数。则由定值过程引入的 A 类相对不确定度为AArel0.007 570.152%4.99uuX=定值过程引入的 B 类不确定度由标准溶液不确定引入，根据 GWB 10174 标准物质证书规定，标准溶液的相对扩展不确定为 2%（k=2），则由定值过程引入的 B 类相对不确定度为 uBrel=2/2=1。2.7 不确定度的合成通过以上分析，将各分量合成总相对不确定度：()()()()()()()()22222relrelrelrelArelBrel222220.143%0.160%0.792%0.152%1%1.302%uubbustsultsuu=+=+=当 k=2 时，相对扩展不确定度 Urel=kurel=2 1.302%=2.604，则扩展不确定度U=UrelX=2.604 4.99=0.13 g/mL。因此，乙腈溶液中黄曲霉毒素 B1成分分析标准物质特性值表示为（4.990.13）g/mL（k=2）。3 结论本文制备的黄曲霉毒素溶液标准物质，经均匀性、稳定性考察，结果无显著性变化。对黄曲霉毒素B1的量值进行不确定度评定，发现影响不确定度的主要因素为均匀性、稳定性及定值过程相关的 A 类不确定度与 B 类不确定度。该溶液标准物质溯源至国家一级标准物质 GBW 10174，符合相关国家标准物质技术规范要求，特性值表示为（4.990.13）g/mL。该标准物质的研制，为实现量值可比性提供了物质保障与技术支撑。参考文献1 FARHAT J,NIDA Z,ZILLIHUMA N,et al.Risk assessment of hepatocellular carcinoma with aflatoxin B1 exposure in edible oilsJ.Toxins,2022,14(8):547.2 董文亚,陈晨,赵秀兰,等.山东省市售花生及其制品中黄曲霉毒素B1污染状况分析与膳食暴露评估J/OL.中国油脂:1-112023-04-12.http:/ TOMS M,ESTELA H,MAGDA C,et al.Human health risk associated with the consumption of aflatoxins in popcornJ.Risk Management and Healthcare Policy,2020,13:2583-2591.4 王佳曼.黄曲霉毒素 B1亚慢性暴露对雄性小鼠氧化、遗传系统的损伤及其作用机制 D.重庆:西南大学,2017.5 孙晓琦,崔晓旭,李伟,等.黄曲霉毒素 B1诱导的 AA 肉鸡亚慢性肝损伤模型的建立与评价 J.中国家禽,2016,38(24):28-32.6 李先江,国振,赵光亮,等.GBW(E)100675 乙腈中展青霉素溶液标准物质的研制 J.分析试验室,2021,40(7):860-864.7 LI S Q,LI X M,LIU X H,et al.Stability Evaluation of aflatoxin B1 solution certified reference material via ultra-high performance liquid chromatography coupled with high-resolution mass spectrometryJ.ACS Omega,2022,7(44):05829.8 国家市场监督管理总局.标准物质的定值及均匀性、稳定性评估:JJF 13432022S.北京:中国标准出版社,2022.9 YANG M R,LIU F,WANG M,et al.Development of a whole liquid egg certified reference material for accurate measurement of enrofloxacin residueJ.Food Chemistry,2020,309:125253.10 YANG M R,JIAN L B,WANG M,et al.Study of a new matrix certified reference material for accurate measurement of florfenicol in prawn meat powderJ.Measurement,2021,185:110011.11 胡巧茹,丛中笑,沙美兰,等.超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定花生中 4 种黄曲霉毒素和 11 种农药残留 J.分析测试学报,2019,38(4):396-402.12 国家卫生和计划生育委员会,国家食品药品监督管理总局.食品安全国家标准 食品中黄曲霉毒素 B 族和 G 族的测定:GB 5009.222016S.北京:中国标准出版社,2016.13 RODRICKS J V.Separation and purification of aflatoxins B1,B2,G1 and G2,and comparison of semisynthetic aflatoxins B2 and G2 with naturally-occurring aflatoxins B2 and G2J.J Am Oil Chem Soc,1969,46(3):149-151.14 JOSEPHS R D,KRSKA R,MACDONALD S,et al.Production of a calibrant certified reference material for determination of the estrogenic mycotoxin zearalenoneJ.Anal Bioanal Chem,2004,378:1182-1189.15 YANG M R,LI S,WANG M,et al.Study of an egg powder certified reference material for accurate measurement of florfenicol residueJ.Microchemical Journal,2021,168:106330.16 杨君,董国强,付红蕾,等.QuEChERS-液相色谱/串联质谱法测定青椒中噻虫嗪残留的不确定度分析 J.分析试验室,2021,40(9):1039-1043.