玉木耳乙醇提取物的抗氧化活性及其部分有效部位含量分析.pdf

8DOl:10.16720/ki.tcyj.2023.115Special Wild Economic Animal and Plant Research特产研究玉木耳乙醇提取物的抗氧化活性及其部分有效部位含量分析陆珠1,任梓铭1,王月1,纪淑娟1,杨阳3,王欢2*，于延申1（1.吉林省蔬菜花卉科学研究院，吉林长春130 0 33；2.长春中医药大学，吉林长春130 117 3.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南海口57 110 1)摘要：本文研究玉木耳乙醇粗提物中的有效成分以及抗氧化活性。以玉木耳的乙醇粗提物为研究对象，研究其抗氧化活性及其部分有效部位。玉木耳粗提物具有良好的DPPH自由基的清除能力，当样品浓度在50 0 0 g/mL时，玉木耳乙醇粗提物对DPPH自由基的清除能力与阳性对照BHT相当；当样品浓度达到12 50 g/mL时，虽然清除能力比BHT弱，但对羟基自由基也具有清除能力；当样品浓度高于2 50 0 mg/mL时，玉木耳乙醇粗提物对ABTS自由基的清除能力与阳性对照BHT相当。玉木耳乙醇粗提物的FRAP值虽然都低于阳性对照，但是总体看玉木耳的总还原能力很强；当样品浓度为12 50 ug/mL时，总酚含量为2 2.1g，提取率为3.9 1%；黄酮含量为6.2 57 ug，提取率为6.2 6%。玉木耳的乙醇粗提物中含有总酚和总黄酮，且具有清除DPPH自由基、羟基自由基、ABTS自由基的能力和总还原能力。关键词：玉木耳；乙醇提取物；抗氧化活性；总酚；总黄酮中图分类号：TS201.2Analysis of Antioxidant Activity and Partially Effective Parts of Ethanol文献标识码：AExtract of Auricularia cornea文章编号：10 0 1-47 2 1(2 0 2 3)0 4-0 0 0 8-0 5LU Zhul,REN Zimingl,WANG Yuel,JI Shujuan,YANG Yang3,WANG Huan?*,YU Yanshen1*(1.Jilin Province Vegetable and Flower Research Institute,Changchun 130033,China;2.Ginseng Academy,Changchun Uni-versity of Chinese Medicine,Changchun 130117,China;3.Environment and Plant Protection Institute,Chinese Academy ofTropical Agricultural Sciences,Haikou 571101,China)Absrtact:In order to investigate the active components and antioxidant activity of the ethanol extract of Auricularia cornea Var.Li.Me-thods:the scavenging capacity of DPPH free radical,-OH free radical and ABTS free radical and the total antioxidant capacity of the ethanolextract of Auricularia cornea var.Li.as raw material were studied,and the contents of total phenols and total flavonoids of the active com-ponents were determined.The results:the crude ethanol extract of Auricularia cornea Var.Li had good scavenging capacity of DPPH freeradical,When the sample concentration is at 5 O00 g,the scavenging ability of jade fungus to PPPH free radicals is comparable to that ofpositive control BHT.When the sample concentration reaches 1 250 g,although the scavenging ability is weaker than BHT have the scav-enging ability of OH radicals;When the sample concentration is higher than 2 500 g,the scavenging ability of jade fungus to ABTS freeradicals is comparable to that of positive control BHT.Although the FRAP values of jade fungus are lower than those of the positive control,the overall reduction ability of jade fungus is very strong.When the sample concentration was 1 250 g,the total phenolic content was0.022 1 mg,and the extracting rate was 3.91%.The content of brass was 6.257 g,and the extracting rate was 6.26%.It is concluded thatthe ethanol extract of Auricularia cornea Var.Li have good DPPH radicals,-OH radicals,ABTS+free radical scavenging capacity and totalantioxidant capacity,its antioxidant activity increases with the increase of concentration,when the sample concentration reaches a certainconcentration,its antioxidant activity is comparable to BHT.Keywords:Auricularia cornea;ethanol extract;antioxidant activity;total phenols;general flavone收稿日期：2 0 2 2-0 9-2 7基金项目：黑木耳种质资源创制及新品（系）选育项目（2 0 2 2 0 2 0 2 10 5NC）作者简介：陆珠（19 9 1-)，女，吉林公主岭人，硕士，助理研究员，从事食用菌栽培与育种研究。通讯作者：于延申（19 6 5-），男，硕士，研究员，从事食用菌栽培与育种研究；王欢（19 8 7-)，女，博士，助理研究员，从事大型真菌资源的开发与利用研究。第4期玉木耳（Auricularia corneaVar.Li.)1l是2 0 15年李玉院士团队发现的天然变异菌株。2 0 2 1年，李玉院士在开讲啦节目中对玉木耳进行了介绍。玉木耳有“白富美”的美誉，含有多糖、粗蛋白和脂肪酸等多种有效成分 2-4，是药食兼用菌，极具开发价值。在吉林、河南和辽宁等8 个省份进行广泛栽培,经济效益显著 5。7年间大家对玉木耳的研究主要是围绕其栽培技术、栽培配方和栽培基质等方面展开。2 0 2 0 年后，多数集中在玉木耳多糖的提取、制备以及活性研究。罗敬文等 6 利用水提醇沉法提取玉木耳多糖并对其抗氧化活性进行了初步的研究。金凤石 7 利用高压蒸煮法对玉木耳多糖进行了提取。王楠等 8 采用不同提取方法对玉木耳多糖结构及抗氧化活性的影响进行了研究。张思覃 9 采用超声辅助提取玉木耳黄酮并对其工艺进行了优化。王鹏等 10 对玉木耳多糖体外消化及抗氧化活性进行了研究。玉木耳多糖及玉木耳总黄酮都具有很好的抗氧化活性 11,12 。以上研究均集中在对玉木耳多糖的研究，但是目前针对玉木耳粗提物中的有效成分及抗氧化活性相关内容的研究报道较少。本文选用乙醇对玉木耳粗多糖进行提取，其毒性小且来源方便。本研究设备名称Device name酶标仪离心机旋转蒸发仪油浴锅数显恒温水浴锅电子分析天平循环水真空泵粉碎机1.4试验方法1.4.1供试样品制备取玉木耳干品2 0 0 g，粉碎后过14目筛，经1.5倍体积浓度为9 0%的乙醇溶液连续提取3次，每次2 4h，过滤后合并3次提取液，减压浓缩，得到乙醇粗提物2 g。配制成浓度为10 mg/mL的甲醇溶液备用。1.4.2DPPH 自由基清除能力测定参照 Zhou 等 13的方法。于9 6 孔酶标板中分别加入2 10-4mol/mL的DPPH的乙醇溶液2 0 0 L,再分别依次加入2 0 0 L浓度为 10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.2 5 mg/mL、0.625 mg/mL、0.312 5 m g/m L、0.156 2 5 m g/m L、0.078125mg/mL浓度的样品，每个样品浓度3次重陆珠，等：玉木耳乙醇提取物的抗氧化活性及其部分有效部位含量分析Table 1 Main equipment设备型号Device modelM200 ProStratos-75005289EYELAN1300EYELAOSB2200HH-3ABT25sSHZ-D(III)A11BS025复，混匀，室温避光反应30 min，测定反应液在波长517 nm下的吸光值。以甲醇代替样品为空白组，以同浓度的BHT为阳性对照组。DPPH自由基清除率（R1，%)按下式进行计算。R1=1-（A 样品吸光值一A显色剂本底吸光值）/A0空白吸光值10 0%1.4.3羟基自由基清除能力测定参照吴俐等 14 的方法。于9 6 孔酶标板中分别加入10 0 L浓度10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 m g/m L、1.2 5 m g/m L、0.6 2 5 m g/m L、0.312 5 mg/mL、0.156 2 5 m g/m L、0.0 7 8 12 5 m g/m L 的样品与10 0 L浓度为9 mmol/L的FeSO4溶液、10 0 L浓度为9 mmol/L的水杨酸-乙醇溶液和10 0 L浓度为9 mmol/L的H2O2溶液混合均匀，每个样品浓度3次9从玉木耳的乙醇粗提物中提取了玉木耳总酚和总黄酮,并对其DPPH 自由基、羟基自由基、ABTS 自由基的清除能力和总还原能力4种抗氧化活性指标进行了测定，为玉木耳有效成分的深入研究和开发利用提供理论依据。1木材料与方法1.1供试材料玉木耳干品于吉林省蔬菜花卉科学研究院食用菌研究所栽培获得，栽培所用菌种来源于吉林农业大学李玉院士团队。1.2主要试剂没食子酸、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）、2，4，6-三吡啶基（TPTZ）、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）、铵盐（ABTS）、芦丁、福林酚、硝酸铝、氢氧化钠、三氯化铁、无水乙醇、硝酸铵、甲醇、二甲基亚砜(DMSO);硫酸钾、水杨酸和硫酸亚铁等试剂均为国产分析纯。1.3主要设备本研究主要采用的仪器设备信息，见表1。表1主要设备东京理化器械（株）独资工厂国华电器有限公司赛多利斯科学仪器有限公司上海瑞兹仪器设备有限公司公司FirmTECANThermo Fisher10重复，37 水浴30 min后，测定反应液在波长510 nm下的吸光值。以甲醇代替样品为空白组，以同浓度的2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)为阳性对照组。羟基自由基清除率(R2，%)按下式进行计算。R2=1（A 样品吸光值一A显色剂本底吸光值）/A0空白吸光值10 0%1.4.4ABTS自由基清除能力测定参照Li等 15 的方法，于9 6 孔酶标板中分别加入18 0 L浓度10 mg/mL、5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.2 5 mg/mL、0.6 2 5 mg/mL、0.312 5 mg/mL、0.156 2 5 m g/m L、0.0 7 8 12 5 m g/m L 浓度的样品与ABTS+工作液36 0 L混合均匀，震荡30 s，每个样品浓度3次重复，室温避光反应6 min后，测定各反应液在波长7 34nm下的吸光值。以甲醇代替样品为空白组，以 BHT为阳性对照组。ABTS 自由基清除率(R3，%)按下式进行计算。R3=1（A 样品吸光值A显色剂本底吸光值）/A0空白吸光值10 0%1.4.5总还原能力测定参照文献SZAFRANSKA等 16 的方法,Fe3+在酸性条件下可被样品中还原物质还原为Fe2+的价态，在波长59 3nm下具有最大紫外吸收。根据氧化还原反应的比色法原理，将样品的吸光值换算为硫酸亚铁的浓度进行比较。配制FRAP工作液及硫酸亚铁标准溶液，取0.3mol/L的醋酸盐缓冲液，缓冲液pH为3.5的溶液25 mL,10 mmol/L 的 TPTZ 溶液 2.5 mL,20 mmol/L 的FeCl3溶液2.5mL混合均匀后置于37 水浴中孵育30 min。标准曲线绘制：分别取0.1mmol/L、0.2 m m o l/L、0.3 mmol/L、0.4 m m o l/L、0.6 m m o l/L 和 0.8 mmol/L,1.0 mmol/L、2.0 m m o l/L、4.0 m m o l/L 和 8.0 mmol/L 的硫酸亚铁标准液30 L与FRAP工作液30 0 L混匀，每个样品浓度3次重复，于37 水浴反应5min，测定反应液在波长59 2 nm下的吸光值。样品的抗氧化能力以硫酸亚铁当量（mmol/g）表示。测定反应液在波长59 2 nm下的吸光值，以标准曲线上求得硫酸亚铁浓度(umol/L)定义为FRAP值。FRAP值越大，表示抗氧化能力越强。无水乙醇为空白，BHT为阳性对照。1.4.6总酚含量测定参照余海龙等 17 的方法，绘制标准曲线：分别取浓度为0.0 8 mg/mL的没食子酸标准品 0 L、10 L、2 0 L、30 L、40 L、50 L、6 0 L、7 0 L和8 0 L,用蒸馏水补足至8 0 L,加入30 L的1mol/L的福林酚溶液混合后室温避光反应8 min，再加入6 0 L的10%的碳酸钠溶液，混匀后室温避光反应30 min，加入蒸馏水补足至50 0 L，每个样品浓度3次重复，特产研究测定在波长7 50 nm下的吸光值。根据Folin-Ciocalteu比色法原理，测定玉木耳乙醇提取物的甲醇溶液的总酚含量。样品代替没食子酸测定波长7 50 nm下的吸光值。1.4.7总黄酮含量测定参照缪钱江等 18 的方法，绘制标准曲线：分别取0.1mg/mL的芦丁对照品8 0 L，160L、2 40 L、32 0 L和40 0 L于EP管中,加入30 L的5%亚硝酸钠溶液，充分震荡，放置6 min，然后加入30L的10%硝酸铝溶液混匀后放置6 min，最后加入400L的4%的氢氧化钠溶液，以蒸馏水补足至10 0 0 L每个样品浓度3次重复，混匀后室温放置15min，测定在波长514nm下的吸光值，测定样品的总酚含量。以样品代替芦丁对照品，测定波长514nm下的吸光值。1.4.8数据处理采用SPSS20.0软件对数据进行处理及分析，通过GraphPad Prism8.00软件作图。2结果与分析2.1 DPPH自由基清除能力不同浓度玉木耳的乙醇粗提物的甲醇溶液对DPPH自由基的清除能力，见图1。玉木耳乙醇粗提物和BHT在试验浓度范围内对DPPH 的清除能力呈良好的量效关系，都是随着浓度增加，清除能力也逐渐增强，尤其玉木耳乙醇粗提物最为明显。当样品浓度在7 8.12 5250g/mL时，清除能力低于50%；当样品浓度在5 000 g/mL 时,对 DPPH 自由基的清除能力与阳性对照相当。由此说明，当玉木耳乙醇粗提物浓度达到一定程度对DPPH 自由基有很强的清除能力。王楠等 8 和王鹏等 10 对玉木耳多糖的研究以及罗娅等 12 对玉木耳总黄酮的研究均证实了玉木耳对DPPH自由基有很强的清除能力。1.5%/率凰清甲月H1.00.50.078.125156.6312.625.01250.0002.500.05.000.000样品浓度/(ug/mL)The sample concentration图1DPPH清除能力测定Fig.1 The scavenging activity of DPPH2.2羟基自由基清除能力不同浓度的玉木耳的乙醇粗提物的甲醇溶液对羟基自由基的清除率,见图2。玉木耳乙醇粗提物和BHT在实验浓度范围内对羟基自由基的清除能力呈良好的2023年第45卷第4期-o玉木耳 BHT16.6255005.0000.000第4期量效关系，当样品浓度小于12 50 g/mL时，玉木耳对羟基自由基的清除能力几乎为零。当样品浓度在12 50 10000g/mL时，羟基自由基的清除能力随着样品浓度的增加而增强,到10 mg/mL时与对照相当。0.4-玉木耳%/率制清甲月HO-0.30.20.10.01.125.250500156.2312.5625.0001250.0002500.000500.00010000.000样品浓度/(ug/mL)The sample concentration图2 羟基自由基清除能力测定Fig.2The scavenging activity of hydroxyl radical2.3ABTS自由基清除能力测定不同浓度玉木耳的乙醇粗提物的甲醇溶液对ABTS自由基的清除率，见图3。当样品浓度在7 8.12 5 2 50 0 g/mL时随着样品浓度的增加，对ABTS的清除能力逐渐增强，当样品浓度高于2 50 0 g/mL时，玉木耳乙醇粗提物对ABTS自由基的清除能力与阳性对照BHT相当。0.4%/率制清甲月HO-0.30.20.10.0Fig.3Scavenging activity of ABTS2.4总还原能力测定硫酸亚铁标准液浓度、吸光度分别设为X和Y，根据图4得到由FeSO4标准曲线计算的回归方程为：浓度/(g/mL)BHT(CK)FRAP值玉木耳Auriculariacornea注：数据以平均值标准误表示(n=3)。Note:Values are expressed as means SE(n=3).陆珠，等：玉木耳乙醇提取物的抗氧化活性及其部分有效部位含量分析BHT2-0.5硫酸亚铁标准液浓度/（mmol/L）Concentration of ferrous sulfate standard solution图4硫酸亚铁标准曲线Fig.4The standard curve of FeSO4玉木耳的总抗氧化能力测定见表2。由表2 可知，玉木耳乙醇粗提物和BHT在实验浓度范围内的还原能力呈良好的线性关系，都是随着浓度增加还原能力也逐渐增强，玉木耳乙醇粗提物的FRAP值都低于阳性对照。当玉木耳乙醇粗提物浓度达到10 0 0 0 g/mL时，总还原能力接近 BHT。2.5总酚含量以没食子酸标准品的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程为Y=1.5576X-0.0002，R2=0.9991，见图5。由此得出当样品浓度为12 50 g/mL-。玉木耳王BHT500.0002505.0001250.02.500.05000.0样品浓度/(g/mL)The sample concentration图3ABTS清除能力测定Table 2The total antioxidant capacity of A.cornea78.125156.250868.34.19621.1359.63.6445.30.911Y=0.986 4X-0.060 6,R2=0.996 7。4.54.03.53.02.52.01.51.00.50.0Q时，总酚含量为2 2.1ug，提取率为3.9 1%。本研究采用90%的乙醇分3次进行提取，可能导致总酚含量偏低，提取率不高。90800.000.00010.000.000Y=0.9864X-0.060 6R=0.996 713707060605050404030302020101000Fig.5 The standard curve of gallic acid表2 玉木耳的总抗氧化能力测定312.500625.0001 012.54.21 141.51.7532.50.8640.43.14800.10.2没食子酸标准品/(ug/uL）图5没食子酸标准曲线1 250.0002.500.0001 4241.31 837.51.1722.44.4816.16.550.30.45 000.0002.524.91.8977.91.20.5Gallic acid standard0.610 000.0003 2592.42 417.21.50.7122.6总黄酮含量以芦丁标准品的浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，计算回归方程为Y=4.8424X-0.0025，R2=0.9967,见图6。由此得出当样品浓度为12 50 g/mL时黄铜含量为6.2 57 ug，提取率为6.2 6%。本研究可能在一定程度上验证了罗娅等 12 2 0 2 0 年对玉木耳总黄酮的研究，乙醇体积分数为8 0%时，玉木耳中总黄酮提取量达到最大值。本研究采用9 0%的乙醇进行提取，最终得到玉木耳的粗提物再进行溶解测量，可能导致总黄酮损失一部分。0.250.200.150.100.050.000-0.05Fig.6 The standard curve of rutin3结论玉木耳的乙醇粗提物具有良好的DPPH自由基、羟基自由基、ABTS 自由基的清除能力和总抗氧化能力，其抗氧化活性随着浓度的增大而增强，当样品浓度达到一定浓度时，其抗氧化活性与BHT相当。当玉木耳乙醇粗提物浓度为12 50 g/mL时,总酚含量为2 2.1g,提取率为3.9 1%；黄铜含量为6.2 57 g，提取率为6.2 6%。玉木耳多糖及玉木耳总黄酮都具有很好的抗氧化活性 11,12 。通过对玉木耳乙醇粗提物中有效成分的研究证实了玉木耳乙醇粗提物具有很好的抗氧化活性，说明玉木耳很多成分都具有很好的抗氧化活性。本研究对玉木耳乙醇粗提物中的总酚和总黄酮进行了提取，但研究并不深入，未来可围绕玉木耳总酚和总黄酮的提取方法和提取工艺优化等方面进行研究。特产研究1 WU F,YUNG Y,HE S H,et al.Global diversity and taxonomyof the Auricularia auricula-judae,comple(Auriculariales,Bas-idiomycota)J.Mycological Progress,2015,14(10):1-16.2李晓，张阔谭.木耳属白色变异菌株的研究进展 J.食药用菌,2 0 16,2 4(4):2 30-2 38.3曾凡清,钟方翼,蒋俊.浙江地区玉木耳栽培技术 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