养殖场非洲猪瘟自检实验室操作规范及关键点.pdf

实践Practice64生产文 侯亮雪 柳城县马山镇农业农村服务中心 自检实验室在养殖场非洲猪瘟防控中起着关键作用。通过建立自检实验室，养猪场可以提高针对疫病早期发现、早期报告、早期诊断和早期处置的能力。此外，自检实验室可以为养殖场提供快速、准确的检测结果，帮助养殖场制定科学合理的疫病防控策略。养殖场非洲猪瘟自检实验室操作规范及关键点随着全球养殖业的快速发展，疫病防控成为决定养殖业能否可持续发展的关键因素之一。非洲猪瘟作为一种高度致命的急性传染性病毒病，可导致家猪和野猪的高发病率和高死亡率。自2018年以来，非洲猪瘟在中国及周边国家持续流行，给养猪业造成了严重损失。因此，加强非洲猪瘟防控，对确保养猪业的安全与发展具有重要意义。自检实验室在养殖场非洲猪瘟防控中起着关键作用，通过建立自检实验室，养殖场可以提高针对疫病早期发现、早期报告、早期诊断和早期处置的能力。此外，自检实验室可以为养殖场提供快速、准确的检测结果，帮助养殖场制定科学合理的疫病防控策略。然而，如何建立一个符合标准、操作规范的养殖场非洲猪瘟自检实验室，以及在实际检测中如何确保检测结果的准确性和可靠性，成为亟待解决的问题。1 非洲猪瘟病毒流行病学特点1.1 结构和特点非洲猪瘟病毒是一种双链DNA病毒，基因组大小约在170194kb，编码150167个ORFs。病毒具有复杂的结构，直径约为200250nm，由4层结构组成：内核、内膜、外膜和顶针。病毒具有较强的抗干扰素能力，能够有效抵抗宿主的免疫应答。病毒对紫外线、干燥环境、酸性环境和一些化学消毒剂敏感，如2%的石碱、0.5%的高锰酸钾和0.2%的过氧化氢等。非洲猪瘟病毒有多个血清型，但所有血清型均能引起家猪和野猪的感染。病毒按照感染程度可分为高致病性、中等致病性和低致病性3类。感染高致病性病毒后，猪的发病率和死亡率可达100%，而感染低致病性病毒可能发展为慢性病，表现为猪群间歇性疫情。作者简介：侯亮雪（1989.08-）女，广西柳州人，壮族，本科，助理兽医师，主要从事兽医工作65 PIGS TODAYJuly 20231.2 病毒的传播途径和感染过程1.2.1 传播途径 非洲猪瘟病毒可以通过多种途径传播，包括直接接触传播、间接接触传播、媒介生物传播和野猪传播。直接接触传播是最主要的传播方式，病毒可以通过宿主的粪便、尿液、唾液、鼻涕和血液等体液传播。间接接触传播主要是通过被污染的饲料、饮水、器具、运输工具等间接物体传播。蜱虫是非洲猪瘟病毒的重要传播媒介，野猪是非洲猪瘟病毒的重要宿主，均可导致病毒在家猪和野猪群体间的传播。1.2.2 感染过程非洲猪瘟病毒侵入宿主细胞的过程包括吸附、侵入和融合。病毒通过顶针与宿主细胞表面受体结合，进一步进入细胞。在细胞内，病毒利用宿主细胞的生物合成系统进行病毒复制、组装和释放。病毒感染后，可在猪只体内引起广泛的病变，包括发热、出血、充血、淋巴结肿大等症状。2 非洲猪瘟自检实验室的建立与管理2.1 实验室的选址与布局实验室的选址与布局对实验室的运行效率、安全性和检测准确性具有重要影响。实验室应选址于养殖场内相对独立、远离猪舍和饲料加工区的地方。理想的距离应至少在100m以上，以降低病毒传播的风险。选址应充分考虑实验室周边环境，避免噪音、振动、污染源等对实验室工作的干扰。而非洲猪瘟自检实验室的布局应遵循功能分区和清洁污染分离的原则。实验室应分为样品接收区、核酸提取区、扩增区和检测区等功能区。各功能区之间要设置缓冲区或通道，以降低交叉污染的风险。样品接收区应设有专用冰箱，温度控制在28。核酸提取区应配置生物安全柜，避免污染风险。扩增区需设置PCR仪和避免气溶胶污染。检测区应配备荧光定量PCR仪或其他检测设备，有计算机进行数据分析。2.2 实验室设备及耗材的配置实验室设备和耗材的配置对非洲猪瘟自检实验室的运行至关重要。关键设备和耗材包括生物安全柜、PCR仪、荧光定量PCR仪、冰箱和超低温冰箱、离心机、恒温水浴、移液器、一次性耗材和试剂。这些设备和耗材应选择质量可靠、符合标准的品牌产品，以提高检测效率和准确性。为确保非洲猪瘟自检实验室操作的安全性和实验结果的准确性，每间实验室应配备专用工作服、无菌乳胶手套、一次性口罩、鞋套和帽子、稀释后的84消毒液、75%的酒精、废液桶等专用物品，并严格禁止各区域的仪器、耗材等交叉使用。这些措施可有效避免操作污染和实验结果的误差。2.3 实验室人员的培训与管理为确保实验室工作的顺利进行和实验结果的准确性，实验室人员的培训与管理至关重要。基础培训、专业技能培训、定期培训、考核与评估、安全管理、信息交流与沟通以及激励与奖励是培训与管理实验室人员的关键因素。这些措施将有助于提高实验室人员的能力和素质，促进实验室工作的高效运转和科研水平的提升。2.4 试剂和样品的储存与处理试剂和样品的储存与处理在实验室工作中至关重要，正确的储存与处理能够确保试剂的稳定性和样品的可靠性。试剂储存方面需要注意试剂说明书上的储存条件、分类存放、安全防护和有效期检查。样品储存方面需要根据其性质和稳定性进行储存、使用清洁容器、集中存放和采取安全防护措施。试剂和样品处理方面需要检查其状态、遵循操作规程、采取无菌操作、严格生物安全措施和按规定处理废弃物。3 非洲猪瘟的检测方法与关键点在确保生物安全防护的前提下，科学采集样本进行检测。遵循养殖场非洲猪瘟变异株防控技术指南的要求，采集血液、病死猪组织、骨髓样本和猪实践Practice66生产粪等样本类型，放入专用容器中密闭包装，尽快送检。3.1 样本采集3.1.1 血液样本尽量在发病初期，病毒滴度较高时采集，每头猪采集510mL血液，使用无抗凝剂的真空采血管。通常采集静脉血液，从耳缘静脉、颈静脉或后蹄静脉进行采集。采集后将血液置于室温下静置24h，离心分离血清，4保存或冷冻。3.1.2 病死猪组织通常采集组织为淋巴结、脾、肝、肾、肺等器官，采集各部位组织约12g，采集时应避免破损组织，使用无菌器具进行操作，采集后将组织放入无菌塑料袋冷冻保存。还可以选择提取股骨或胫骨，将骨髓钻穿，用针管抽取骨髓液，将骨髓液置于无抗凝剂的真空采血管，冷藏或冷冻保存。3.1.3 猪粪样本每头猪采集1020g粪便，使用无菌塑料勺或器具，尽量避免沾染泥土和其他杂质，将粪便置于无菌塑料袋，冷藏或冷冻保存。3.2 样本接收和储存样品实验室收到样品时，首先要检查样品包装是否完好无损，无泄漏或污染现象。检查样品标签，确认样品来源、采样日期、样品类型等信息，核对样品清单和实际收到的样品数量，确保无误。其次，将收到的样品信息录入样品管理系统或样品登记簿，以便于跟踪和查询，为每个样品分配唯一的样品编号，确保追溯性。根据样品类型，将样品分区存放，避免交叉污染。对于冷藏样品，应在28条件下进行存储；对于冷冻样品，应在-20或更低温度下进行存储。如果样品需要进行长期保存，可考虑将其存储在-80的超低温冰箱中。3.3 样品预处理对于冷冻样品，在进行实验前需要将其解冻。最好的解冻方法是将样品放在冰浴中，避免在室温下解冻，以防止微生物生长和样品成分变质。尽量避免多次反复冻融，以免影响样品质量。对于复杂的生物样品，如血液、组织等，需要进行分离处理。可采用离心、过滤等方法将所需成分与其他成分分离，如血清、血浆、细胞等。对于组织样品，在分析前需要将其均质化，可以采用匀浆器、研磨、超声波等方法将组织破碎，提高目标物质的提取效率。将所需的目标物质从复杂基质中提取出来，以便于后续分析。常用的提取方法有液液萃取、固相萃取等。在某些情况下，需要对样品进行浓缩，以提高检测灵敏度。可以采用旋转蒸发、减压浓缩等方法进行浓缩。对于某些复杂基质的样品，需要进行纯化处理，以去除可能干扰实验结果的杂质。可以采用凝胶过滤、离子交换柱、固相萃取等方法进行纯化。将处理后的样品悬浮在适当的缓冲液或检测液中，调整至所需浓度，以便于后续分析。对于可能含有悬浮颗粒或沉淀物的样品需要进行过滤处理。可以使用微孔滤膜或针对特定颗粒大小的过滤器进行过滤。3.4 核酸提取在检测非洲猪瘟过程中，核酸提取是关键步骤之一。以下是非洲猪瘟核酸提取的关键点：（1）选择适当的核酸提取方法：根据实验室条件和设备，选择合适的核酸提取方法，如酚-氯仿法、磁珠法或硅胶柱法。各种方法在操作复杂性、时间需求和纯度方面有所不同，需要根据实际需求选择。（2）样品质量：确保样品的质量和完整性，避免受到污染或降解。在采集、储存和处理过程中，严格遵循无菌操作规程。（3）提取缓冲液：使用适当的提取缓冲液，以确保高效且特异性地提取核酸。根据所选方法，缓冲液可能需要包含盐、洗涤剂或蛋白酶等成分。（4）优化提取条件：根据具体试剂和设备，优化核酸提取过程中的条件，如离心时间、洗脱体积等。这些参数可能会影响到提取效果和核酸纯度。（5）核酸纯度和浓度检测：提取完成后，通过光谱测定法67 PIGS TODAYJuly 2023或其他方法检测核酸的纯度和浓度，确保核酸样品达到检测方法所要求的纯度和浓度标准。（6）核酸保存：将提取的核酸在适当的条件下保存，如-20或-80，以防止降解。确保核酸样品在使用前仍具有良好的质量。3.5 PCR扩增反应在非洲猪瘟检测中，PCR是一种敏感且特异性的检测方法。关键点包括选择合适的引物和探针、使用高质量的PCR试剂和酶、优化PCR反应条件、使用无核酸水和消毒剂、加入负对照和阳性对照、使用凝胶电泳或实时荧光PCR方法检测PCR产物以及根据实验结果进行结果解释和验证。这些关键点可以确保PCR反应的特异性和敏感性，并提高检测结果的准确性和可靠性。4 非洲猪瘟自检实验室的质量控制与评估非洲猪瘟自检实验室的质量控制与评估至关重要，以确保检测结果的准确性。实施措施包括遵循标准操作规程（SOP）、定期培训实验室人员、实行内部质量控制、维护和校准关键设备、妥善管理试剂和样品、监控实验室环境、参与外部质量评估、审核检测结果以及持续改进。这些措施有助于保持实验室操作的一致性和准确性，避免污染和误差，确保实验室检测性能达到最佳水平。5 非洲猪瘟自检实验室在养殖场防控中的应用通过建立自检实验室，养殖场可以实施早期诊断、及时处理和防止疫情扩散的措施。以下是非洲猪瘟自检实验室在养殖场防控中的应用：（1）早期诊断：通过自检实验室的设立，养殖场可以对疑似非洲猪瘟病例进行快速、准确的诊断。及时发现感染病例有助于防止病毒在养殖场内扩散。（2）实时监测：养殖场可以定期对猪群进行监测，以评估非洲猪瘟病毒的存在和感染状况。通过实时监测，养殖场能够及时了解病毒感染情况，从而采取相应的防控措施。（3）生物安全措施评估：养殖场可以根据自检实验室的检测结果，评估现有生物安全措施的有效性，如隔离设施、消毒程序和员工培训等。根据评估结果，养殖场可以采取适当措施提高生物安全水平，降低疫情发生的风险。（4）疫苗接种效果评估：若养殖场实施了非洲猪瘟疫苗接种计划，自检实验室可帮助评估疫苗接种效果，为养殖场提供依据以调整疫苗接种策略。（5）病例处理与防疫措施：在检测到非洲猪瘟病例后，养殖场可以立即采取措施，如隔离、扑杀感染猪只、消毒病区等。通过自检实验室的协助，养殖场能够更快速、有效地执行这些措施，降低病毒传播的风险。6 结论非洲猪瘟自检实验室在养殖场的防控策略中发挥着至关重要的作用。通过实施严格的质量控制与评估措施，确保实验室操作的一致性、准确性和可靠性，有助于提高检测结果的准确性。养殖场应关注实验室人员培训、设备维护、试剂与样品管理等方面，以确保在非洲猪瘟疫情发生时能够及时发现和控制疫情，保证养殖业的健康与可持续发展。非洲猪瘟自检实验室在养殖场的防控策略中发挥着至关重要的作用。通过实施严格的质量控制与评估措施，确保实验室操作的一致性、准确性和可靠性，有助于提高检测结果的准确性。