一株淡紫拟青霉PT1菌株的培养特性及生物学特性.pdf

热带林业2023年6 月第5 1 卷第2 期一株淡紫拟青霉PT1 菌株的培养特性及生物学特性唐慧贵州林业勘察设计有限公司，贵州贵阳5 5 0 0 0 0摘要：淡紫拟青霉是植物线虫的重要生物防治真菌。采用菌物学及森林病理学研究方法，对一株淡紫拟青霉（实验室前期筛选出对松材线虫有高效杀伤作用的菌株)的培养特性及生物学特性进行了研究。研究淡紫拟青霉PT1在不同碳源、氮源、温度、pH下的生长速度。在常规培养下，观察淡紫拟青霉PT1的菌落形态及其产生孢子的时间。筛选出最适温度，最适pH以及最适碳源、氮源。对菌落形状、大小、颜色、质地进行描述。用改良PDA培养淡紫拟青霉PT1菌株，每天在无菌环境下，挑取少许菌丝于载玻片上，置于显微镜下观察是否有孢子的产生，在培养到第4天时发现有孢子的产生。观察发现菌落呈白色，培养2 0 d左右菌落颜色变为淡紫色。关键词：淡紫拟青霉菌PT1;培养特性；生物学特性中图分类号：Q939.5Cultural and Biological Characteristics of the Strain Paecilomyces lilacinus PT1Guizhou Forestry Reconnaissance And Design Co.,Ltd,Guiyang Guizhou 550000Abstract:The Paecilomyces lilacinus is a important natural biocontrol fungus of plant nematodes.The methodsof mycology and forest pathology were used for researching culture characteristics and biological characteristicsof the strain Paecilomyces lilacinus PT1.The growth rates of Paecilomyces lilacinus PT1 on different carbonsource,nitrogen source,temperature and pH value were measured.The colony morphology and sporulation timeof Paecilomyces lilacinus PT1 under the routine culture were observed.The optimum temperature,optimum pHvalue,optimum carbon source and nitrogen source were screened out.And the shape,size,color,and texture ofthe colony were described.Paecilomyces lilacinus strain PT1 was cultured with modified PDA medium,pickingsome hyphae on the slide in sterile environment and observe spore production with microscope every day.Thespores are observed on the forth day,and the color of colony is white,after about twenty days it became lavender.Key words:Paecilomyces lilacinus strain PT1,Culture characteristics,Biological characteristics1前言1.1淡紫拟青霉简介淡紫拟青霉（Paecilomyceslilacinus）在Answorth（1 9 7 3）系统中属于半知菌亚门丝孢纲丝孢目丛梗孢科拟青霉属。菌丝体发达，呈疏松棉絮作者简介：唐慧（1 9 9 7-），女，苗族，贵州贵阳人，林业助理工程师，主要从事森林经理和森林规划方面工作，E-mail:。86文献标识码：BTang Hui状，分生孢子直接从菌丝或分生孢子梗上产生，分生孢子梗不形成孢梗束或分生孢子座。至今该属报道有近5 0 个种，皆为昆虫病原菌和线虫病原菌，是一些植物寄生线虫的重要天敌，能寄生于卵，也能侵染幼虫和雌虫，可明显减轻多种作物根结线虫、孢囊线病虫害研究doi:10.3969/j.issn.1672-0938.2023.02.019TROPICAL FORESTRYvOL.51 NO.2 Jun.2023虫、茎线虫等植物线虫病的危害。淡紫拟青霉广泛分布于全世界各地，具有功效高、寄主广、易培养等优点。1.2实验研究背景松材线虫病，即松树萎病，其病原为嗜木伞真滑刃线虫（Bursaphelenchus xylophilus）2,其传播蔓延速度快、防治难度大，又被称为松树癌症、无烟的森林火灾3。松材线虫在世界广泛分布，是继榆枯萎病、板栗疫病、松针疱疹锈病之后的第四大森林病害，属于特大毁灭性灾害，被列为森林病虫害之首 4,对森林资源以及经济造成了严重的影响。有研究发现，用淡紫拟青霉PT1菌株的发酵液处理松材线虫，其2 4h、48 h、7 2 h 的校正死亡率都高达1 0 0%，表现出较强的杀松材线虫的能力 5 。研究淡紫拟青霉PT1菌株的培养特性对研究防治松材线虫有着重要的意义。2 材料与方法2.1实验材料2.1.1实验菌株来源该实验所用淡紫拟青霉PT1菌株来源于中国林科院微生物菌株平台，前期试验证明其对松材线虫杀虫高效菌株。2.1.2实验药品琼脂、硫酸镁、磷酸二氢钾，葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇、牛肉膏、蛋白陈、硫酸铵、酵母膏。2.2.3实验器材表1 试验所用仪器设备Tab.1 Instruments and Equipment Used in the Test仪器名称产地全温振荡培养箱HZQ-F160生物洁净工作台BCN-1360立式压力蒸汽灭菌器TYAIB大容量恒温培养摇床HZQ-X100光学显微镜BM20002.2实实验方法2.2.1不同温度对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响用改良PDA培养基（培养基成分：马铃薯2 0 0 g、水1 0 0 0 mL、琼脂2 0 g、葡萄糖2 0 g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁1.5 g)培养淡紫拟青霉PT1菌株。设置5 个温度梯度，分别为1 5、2 0、2 5、30、35；每个温度做5 个重复，重复3次。在温箱避光培养7 d，用十字交又法测量菌落直径，每2 4h测量1 次，并记录测量的结果，比较各个温度的菌落生长状况，筛选出使淡紫拟青霉PT1菌株生长状况最好的温度。2.2.2不同碳源对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响以改良PDA为基础培养基，配方同上。替换碳源，供试碳源有：麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、甘露醇；每个碳源做5 个重复，重复3次。在温箱2 8 避光培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径，每2 4h测量1次，并记录测量结果，比较各个碳源的菌落生长状况，筛选出使淡紫拟青霉PT1菌株生长状况最好的碳源。2.2.3不同氮源对淡紫拟青霉PT1菌株的生长影响以改良PDA为基础培养基,培养基配方同上。供试氮源有：蛋白陈、牛肉膏、硫酸铵、酵母膏；每个氮源做5 个重复，重复3次。在温箱2 8 避光培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径，每2 4h测量1 次，并记录测量的结果，比较各个氮源的菌落生长状况，筛选出使淡紫拟青霉PT1菌株生长状况最好的氮源。2.2.4不同pH对淡紫拟青霉PT1菌株的生长影响以改良PDA为基础培养基培养淡紫拟青霉PT1菌株，培养基配方同上。设置6 个pH梯度，分别为pH4、p H 5、p H 6、p H 7、p H 8、p H 9；每个pH做5 个重复，重复3次。在温箱2 8 避光培养7 d，用十字交叉法测量菌落直径，每2 4h测量1 次，并记录测量结果，比较各个pH的菌落生长状况，筛选出淡紫拟青霉PT1菌株生长状况最好的pH。2.2.5淡紫拟青霉PT1菌株菌落观察用改良PDA培养基（配方同上)培养淡紫拟青霉PT1菌株，温箱2 8 避光培养，每天观察菌落的颜型号中国哈尔滨中国北京中国上海中国常州中国病虫害研究色、大小、质地、形状、纹路等，并记录观察结果，拍照。观察7 d,设置5 个重复。2.2.6淡紫拟青霉PT1菌株产孢时间的观察用改良PDA培养基（配方同上)培养淡紫拟青霉PT1菌株；每天用接种针挑取少许菌丝置于滴有水滴的载玻片上，盖上盖玻片，置于光学显微镜下观察是否有孢子的产生，并拍照，记录产孢时间以及孢子的形态。3 结果与分析3.1温度对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响温度对淡紫拟青霉PT1菌株的生长影响较大，87热带林业2023年6 月第5 1 卷第2 期温箱避光培养7 d后，结果显示：当温度为30 时，淡紫拟青霉PT1的菌落直径较其他几个温度是最大的，其生长到第7 天的菌落直径为4.2 5 cm，其次是20、2 5,其淡紫拟青霉PT1菌株的菌落直径分别为3.6 1 cm、3.45 c m，但温度在35 时，淡紫拟青霉PT1菌株的菌落直径为1.8 2 cm，是生长状况最差的。从图1 的曲线图可以看出，代表30 的曲线最陡，表明淡紫拟青霉PT1菌株在30 时，菌株的生长速度最快；代表35 的曲线则特别平缓，菌株的生长速度特别缓慢，几乎没怎么生长。综上所述，淡紫拟青霉PT1菌株在30 时，生长状况最好，在35 时，生长速度特别缓慢，在前6 d，2 5 的比2 0 的生长状况要好，在第7 天时，2 0 下培养的淡紫拟青霉PT1菌株比2 5 下培养的淡紫拟青霉PT1菌株快，原因可能是由于2 5 的温箱在中途没有关好门，导致温箱内实际温度降低，不到2 5，导致生长速度减缓，可能是2 0 时，淡紫拟青霉PT1菌株才开始快速生长，具体原因有待继续研究。4.504.003.503.002.502.001.501.000.500.00151.27201.34251.48301.21351.23图1 不同温度菌株生长直径随时间变化Fig.1 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains atDifferent Temperatures with Time3.2碳源对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响在葡萄糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、乳糖、淀粉这6种碳源中，菌株均可生长（图2）。由于淡紫拟青霉PT1菌株生长缓慢，所以当菌株生长到第7 天时仍未长满培养皿。2 8 温箱培养7 d后，不同碳源的培养基上的淡紫拟青霉PT1菌株的生长情况不同。由图2 可以看出，当淡紫拟青霉PT1菌株生长到第7天时，由蔗糖作为碳源的培养基培养的淡紫拟青霉PT1菌株的菌落直径为最大，菌落的最大直径为4.78cm；由葡萄糖作为碳源的培养基培养的淡紫拟88青霉PT1菌株的菌落直径是相对最小的，培养到第7天的菌落直径为3.35 cm。由图2 的曲线图可以看出，代表蔗糖的曲线较陡，则说明在以蔗糖为碳源的培养基上，淡紫拟青霉PT1菌株的生长速度较其他碳源快；而代表葡萄糖的曲线比较平缓，则说明在以葡萄糖为碳源的培养基上，淡紫拟青霉PT1菌株的生长较其他碳源缓慢。综上所述，在供试的6 种碳源中，最适合淡紫拟青霉PT1菌株生长的碳源是蔗糖，不适合淡紫拟青霉PT1菌株生长的碳源为葡萄糖。12麦芽糖1.68一淀粉1.50一葡萄糖1.48一甘露醇1.40一一乳糖1.38煎糖1.30图2 不同碳源菌株生长直径随时间变化Fig.2 Variation Diagram of Growth Diameter of Strains withDifferent Carbon Sources with Time3.3氮源对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响菌株在供试氮源培养基上均能生长（图3）。不同氮源对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响较大，121.461.541.801.661.3132.052.701.782.651.802.351.722.751.582.181.502.53天数：d341.722.131.982.412.352.702.612.781.411.52天数：d43.133.032.703.272.653.10562.572.822.783.193.103.253.353.801.621.7253.584.103.533.933.103.253.834.323.434.033.834.4073.083.613.454.251.82病虫害研究628下培养7 d后，不同氮源培养基上的淡紫拟青霉PT1菌株生长差异较明显。由图3可以看出，在氮源为牛肉膏的培养基上淡紫拟青霉PT1菌株生长最好，菌落直径为4.47 cm；其次为以酵母膏为氮源的培养基上淡紫拟青霉PT1菌株，菌落直径为3.9 8 cm；以蛋白陈为氮源的培养基上淡紫拟青霉PT1菌株，菌落直径为3.8 0 cm；直径最小的是以硫酸铵为氮源的培养基上生长的淡紫拟青霉PT1菌株，其菌落直径为2.9 5 cm。由图3可以看出，牛肉膏的曲线较陡，说明淡紫拟青霉PT1菌株在以牛肉膏为氮源的培养基中生长速度较其他氮源快；代表硫酸铵的曲线明显比较平缓，则说明淡紫拟青霉PT1菌株在以硫酸铵为氮源的培养基上的生长速度较缓慢。综上所述，在供试4种氮源中，淡紫拟青霉PT1菌株在以牛肉膏为氮源的培养基中的生长状况是最好，而在以硫酸铵为氮源的培养基中淡紫拟青霉PT1菌株的生长状况是4种氮源中最差的。74.254.183.354.724.454.78TROPICAL FORESTRY5.004.504.003.503.002502.001.500.501.000.00牛肉膏1.38蛋白陈1.30一硫酸铵1.40一酵母膏1.44图3不同氮源菌株生长随时间变化直径Fig.3 Diameter Diagram of Growth of Strains with DifferentNitrogen Sources with Time3.4pH对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响菌株在试验所设置的pH范围内都能生长（图4）。不同的pH对淡紫拟青霉PT1菌株生长的影响各不相同。由图4的柱状图可以看出，当pH为8 时，淡紫拟青霉PT1菌株的菌落直径是最大，菌落直径为4.25cm;其次是pH为7 时，淡紫拟青霉PT1菌株的菌落直径，其菌落直径为4.2 3cm，两者相差不大。但pH为4时，淡紫拟青霉PT1菌株的菌落生长情况最不理想，其菌落直径在第7 天时为2.48 cm。由图4可以看出，代表pH4的曲线较平缓，说明淡紫拟青霉在pH为4的培养基上生长状况不好；代表pH8的曲线比较直且陡，说明在pH为8 的培养基上淡紫拟青霉PT1菌株的生长速度较均匀且较快；pH为7 的培养基的在第3天到第6 天时，淡紫拟青霉PT1菌株的生长状况比pH为8 时的要好，但pH7的生长速度不均匀，第6 天到第7 天时生长速度有所下降；代表pH9曲线比较直，说明在pH为9 的培养基上生长的淡紫拟青霉PT1菌株的生长速度比较均匀。综上所述，淡紫拟青霉PT1菌株适合在偏碱性的环境中生长，且生长速度较快，不适合在偏酸性的环境下生长，其生长的最适pH范围为7 8。4.504.0050002.502.001.501.000.500.00-pH41.10一pHS1.20一pH61.33一pH71.33一pH81.25pH91.18图4不同pH菌株生长随时间变化直径Fig.4 Diameter Diagram of Growth of Strains with DifferentpH Values Changing with TimeVOL.51 NO.2 Jun.20233.5淡紫拟青霉PT1菌株的菌落形态观察用改良PDA培养淡紫拟青霉PT1菌株，2 8 避光培养，每天用肉眼观察淡紫拟青霉PT1菌株的菌落形态，观察发现淡紫拟青霉PT1菌株起初菌落颜121.921.451.601.59121.451.451.531.581.821.4332.722.251.842.25天数：d341.581.902.052.502.152.402.683.232.302.872.032.45天数：d43.302.652.062.7452.052.702.703.533.322.9053.783.152.463.212.253.152.953.923.833.3064.133.552.703.5862.483.503.254.234.253.83病虫害研究74.473.802.953.987色为白色，菌丝呈放射状向四周均匀扩散，因此其菌落形状为均匀的圆形，菌落质地呈疏松棉絮状，淡紫拟青霉PT1菌株的生长速度较缓慢，所以培养1 0 d后仍然没有长满培养皿。在淡紫拟青霉PT1菌株长到2 0 d左右时，菌落颜色开始变化从白色变为淡紫色，逐渐长满培养皿。图5 淡紫拟青霉PT1培养形态Fig.5 Culture Morphology of Paecilomyces lilacinus PT13.6淡紫拟青霉PT1菌株产孢时间的观察用改良PDA培养淡紫拟青霉PT1菌株，2 8 避光培养。每天在超净工作台内用接种针挑取少许菌丝在滴了水的载玻片上，盖上盖玻片，置于光学显微镜下用40 倍镜观察孢子。在培养到4d时，在光学显微镜下观察到有孢子的产生，有的分生孢子直接着生于菌丝上，有的分生孢子着生于分生孢子梗上，在显微镜下观察到菌丝接近透明，分生孢子透明，近圆形，分生孢子梗较粗壮。产生分生孢子时的菌落形态如图6，分生孢子如图7。89发酵培养的最佳培养基的配方，蔗糖+黄豆粉+0.005g/L FeS047H20+0.008g/LMnS04+0.002g/LH,BO3+0.005g/L ZnSO4+0.004g/L CuSO4+0.004g/LNa2Mo04+0.002g/LCoC12+0.04g/L肌醇为最佳培养基配方，其最佳生长碳源和淡紫拟青霉PT1菌株一样，也为蔗糖。周靖等人 9 则以查实培养基为基础，采用正交试验研究淡紫拟青霉的培养条件，其研究热带林业2023年6 月第5 1 卷第2 期2T4.8图6 产生分生孢子时的菌落形态(第4天)Fig.6Colonial Morphologyof ConidiaGermination(4th days)4 结论与讨论该试验研究了淡紫拟青霉PT1菌株培养特性，实验结果表明，能使淡紫拟青霉PT1菌株生长的最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为牛肉膏，最适生长温度为30，最适生长pH为7 8,淡紫拟青霉PT1菌株初期没有长满培养皿时的菌落颜色为白色，培养2 0 d左右，菌落也逐渐长满了培养皿，菌落颜色也从白色变为淡紫色，菌丝呈放射状向四周扩散，菌落现状为圆形，菌落质地为疏松棉絮状，其分生孢子无色近圆形，直接着生在菌丝上，或者着生在分生孢子梗上，淡紫拟青霉PT1菌株在35 时几乎不生长，生长速度及其缓慢，在偏碱性的环境下生长较好。李芳等人6也对淡紫拟青霉的培养特性进行了研究,结果显示淡紫拟青霉NH-PL-03菌株在发酵过程中，pH是相对稳定的，在快速生长时pH下降，在培养到第7天至第9 天时,pH回升,并且维持在6 7,碳源的消耗量随着菌丝生长液在逐渐增加。彭鑫等人 7 对玫烟色拟青霉QH-4的形态特征，分生孢子的萌发环境条件进行了研究，研究结果显示其分生孢子在可萌发的pH范围较大，在pH5p H 1 1 条件下都可萌发，但偏酸或者偏碱都会导致其萌发率降低，其分生孢子萌发的最适温度范围为2 5 2 7，生长条件较宽松与淡紫拟青霉PT1菌株相比，对生长环境的酸碱度和温度的要求不高。夏振远等人8 采用正交试验研究了淡紫拟青霉IPC菌株的发酵培养基，其研究结果发现适当增加通气量，pH控制在5 6，温度控制在2 9 更适合淡紫拟青霉IPC菌株液体的深层发酵，该研究还发现了适合淡紫拟青霉IPC菌株图7 分生孢子形态Fig.7Conidia Morphology结果显示，最佳碳源为蔗糖，最佳氮源为硝酸铵，最佳pH范围为5 6,最佳温度为30，与淡紫拟青霉PT1菌株的最佳碳源和最佳温度是相同的。大量的研究显示，淡紫拟青霉对根结线虫的防治效果好，而淡紫拟青霉防治松材线虫的研究少之又少，而有研究发现淡紫拟青霉对松材线虫也有较高的防治作用5 ，所以研究淡紫拟青霉PT1菌株的培养特性对防治松材线虫有促进作用，也是该实验的创新点，该实验的不足之处在于研究的不够深入，碳氮源的种类较少，可采用正交实验研究适合淡紫拟青霉PT1生长的最佳培养基。参考文献1张春龙，肖炎农,余旗红,等.淡紫拟青霉的特性与研究进展D.湖北植保,2 0 1 2(2):48-5 1.2潘沧桑.关于Bursaphelenchus中译名的商椎 .厦门大学学报（自然科学版),2 0 0 4,43(1):1 7 1-1 7 2.3程瑚瑞.南京黑松上发生的萎蒿线虫病.森林病虫通讯，1983(4):1.4王明旭.松材线虫发病条件的研究概况.湖南林业科技，2007,34(5):4-10.5魏博涵，张，申家兴，等.1 5 个生防菌株乙酸乙酯提取物对松材线虫的杀虫活性.D).林业科技,2 0 1 7,42(1):2 4-2 6.6李芳,刘波,黄素芳,等.淡紫拟青霉NH-PL-03菌株的培养特性.福建农林大学学报（自然科学版）,2 0 0 5,34(1)：25-29.7彭鑫.玫烟色拟青霉的形态特征和分生孢子萌发环境条件的研究.金陵科技学院学报，2 0 1 6,32(3)：7 6-7 9.8夏振远，杨树军，李云华，等.淡紫拟青霉最佳液体培养基和发酵条件研究.西南农业大学学报，2 0 0 2,2 4(3)：2 38-2 40.9周靖，廖美德，徐汉虹.淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)培养条件的优化.微生物学杂志，2 0 0 7,2 7(2)：45-48.90病虫害研究