眼类器官的体内移植及组织工程支架的应用.pdf

移植前沿眼类器官的体内移植及组织工程支架的应用胡乐怡刘臻臻刘奕志【摘要】眼类器官是指在体外利用干细胞诱导形成的一种与眼内组织具有相似细胞类型和功能的结构，将其移植入体内实现眼的修复再生是再生医学重点研究方向之一，也为重大致盲性眼病的治疗提供了新的方向与策略。组织工程支架作为生物组织或细胞生长的载体，能为眼类器官的体内移植提供支撑，并促进其体内成熟。眼类器官与组织工程的有机结合是实现眼类器官体内整合，并重建相应结构和功能的重要手段。本综述总结了眼类器官及其体内移植的研究现状，并重点关注了组织工程支架辅助的眼类器官移植相关研究，旨在为今后的眼类器官与组织工程学交叉研究提供思路与参考。【关键词】眼类器官；致盲性眼病；干细胞；体外培养；体内移植；排斥反应；再生医学；组织工程支架【中图分类号】R617,R318【文献标志码】A【文章编号】1674-7445（2023）05-0003-07In vivo transplantation of eye organoids and application of tissue engineering scaffolds Hu Leyi,Liu Zhenzhen,Liu Yizhi.Zhongshan Ophthalmic Centre,Sun Yat-sen University,State Key Laboratory of Ophthalmology,Guangdong Provincial KeyLaboratory of Ophthalmology and Visual Science,Guangdong Provincial Clinical Research Center for Ocular Diseases,Guangzhou510623,ChinaCorresponding author:Liu Zhenzhen,Email:DOI:10.3969/j.issn.1674-7445.2023059基金项目：广东省自然科学基金（2023A1515011102）作者单位：510623广州，中山大学中山眼科中心眼科学国家重点实验室广东省眼科视觉科学重点实验室广东省眼部疾病临床医学研究中心作者简介：胡乐怡（ORCID：0000-0002-3433-2340），博士，研究方向为晶状体发育与再生，Email：HLY通信作者：刘臻臻（ORCID：0000-0002-4853-2474），博士，副教授，研究方向为晶状体再生、屈光性白内障手术，Email：第 14 卷第 5 期器官移植Vol.14No.52023 年 9 月Organ TransplantationSep.2023【Abstract】Eyeorganoidreferstoastructurethatpossessesresemblingcelltypesandfunctionstointraoculartissues,whichisinducedbystemcellsin vitro.Transplantingitintothebodyforeyerepairandregenerationisoneofthekeyresearchdirectionsinregenerativemedicine,whichalsoprovidesanoveldirectionandstrategyforthetreatmentofmajorblindingdiseases.Asacarrierofbiologicaltissueorcellgrowth,tissueengineeringscaffoldcouldsupportin vivotransplantation of eye organoids and promote their maturation.Organic combination of eye organoids and tissueengineeringisacriticalapproachtorealizein vivointegrationofeyeorganoidsandreconstructcorrespondingstructuresandfunctions.Inthisreview,thelatestresearchstatusofeyeorganoidsandin vivotransplantationweresummarized,andrelevantstudiesoftissueengineeringscaffold-assistedeyeorganoidtransplantationwerehighlighted,aimingtoprovideideasandreferenceforsubsequentinter-disciplinaryresearchofeyeorganoidsandtissueengineering.【Key words】Eye organoid;Blinding disease;Stem cell;In vitro culture;In vivo transplantation;Rejection;Regenerativemedicine;Tissueengineeringscaffold人类 80%的感知来自视觉，角膜失代偿、白内障、青光眼、年龄相关性黄斑变性及视网膜色素变性等眼病会导致患者生活质量大幅下降。目前受视力障碍和失明影响的人口比例高，导致巨大的健康和经济负担，故寻找治疗各类眼病，尤其是致盲性眼病的新方法成为眼科科研工作者及临床医师需要思考的问题。类器官是干细胞在体外培养后，形成的具有与体内目标组织器官有相似结构及部分生理功能的一种立体结构。该体外培养体系模拟体内发育过程，通过给予合适的营养环境、生长因子的刺激、细胞间的相互作用等，使干细胞经历细胞归集和空间定向谱系命运分化的过程，实现细胞的自组织1-2。近十几年来，类器官相关的研究蓬勃发展3，如今类器官的构建已经涉及脑、胃肠、肾脏、肝脏、肺脏、心脏、胰腺、胆囊等全身各个器官以及肿瘤等病理组织；在眼内，类器官培养更是细化到视网膜、角膜、晶状体、眼部腺体等亚结构4。对于致盲性眼病中眼组织终末期的失代偿，眼类器官可以作为理想的移植物实现对体内组织的替代和营养供给。近十年来人们不断尝试并取得了令人兴奋的结果。而如何实施眼类器官的培养、筛选、体内转运以及是否需要组织工程支架辅助结构维持和连接等，是进行眼类器官体内移植相关研究需要考虑的重要细节。1眼类器官概述1.1 视网膜类器官作为眼部第一个以类器官形式被体外培养出来的亚组织结构，视网膜类器官相关研究占了眼类器官研究的绝大部分，且整体发展较为成熟。自 2011 年开始，Eiraku 等5、Zhong 等6、Lowe 等7根据悬浮和贴壁培养各自的优势，构建出不同大类的视网膜类器官培养体系，这些体系在后期各项研究中被不断优化，生成具有更高诱导效率、更成熟细胞结构及电生理功能的体外结构。目前，视网膜类器官已被用来模拟视网膜色素变性、视网膜母细胞瘤、Leber 先天性黑朦、年龄相关性黄斑变性等疾病以探究疾病发展过程8-11，完成了对部分药物或物质的筛选及评估12，并成功以细胞悬液或细胞片的形式被移植入动物眼内，实现了细胞的整合和视觉的部分恢复13。1.2 角膜类器官角膜类器官的研究在角膜干细胞体外扩增、各类角膜特异性细胞定向分化及共培养研究的基础上逐渐发展起来14。2016 年 Hayashi 等15利用诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcell，iPSC）得到自形成外胚层自主多区（self-formedectodermalautonomousmulti-zone，SEAM），分离眼表外胚层区域细胞离体进行分类扩增后得到复层角膜上皮组织，并在植入致盲模型兔体内后能恢复部分视力。2017 年 Foster 等16和 Susaimanickam 等17进一步建立和优化角膜类器官培养体系，以得到更丰富的角膜细胞种类及更符合生理的组织结构。目前在应用上，角膜类器官常与微流控生理系统结合，形成模拟角膜生理状态的一种机械可控的微环境，以实现对药物的筛选和对干眼症等疾病的模拟18-19。1.3 晶状体类器官晶状体类器官又被称为晶状体小体，对其的体外构建是与利用晶状体内源性细胞实现晶状体再生修复并行的研究方向20。2010 年 Yang 等21利用三阶段培养得到了表达晶状体细胞标志物的透明立体结构；Murphy 等22分选纯化细胞提高了类器官的诱导效率；Ali 等23对比发现外周血单核细胞来源的 iPSC和胚胎干细胞诱导得到的晶状体类器官转录组具有高650器官移植第 14 卷相似度；Fu 等24于 2017 年创立“煎蛋”模型提高了晶状体类器官的体积和透明度，并在后期的研究中模拟各类白内障，对羊毛甾醇等药物效果进行评估25-26。1.4 眼部腺体类器官眼部腺体类器官的研究目前主要涉及泪腺。2021 年 Bannier-Hlaout 等27建立了小鼠和人类泪腺类器官的长期培养体系，实现神经递质引起的泪液分泌，并可在移植后产生成熟的泪液产物。2022 年Hayashi 等28则在前期诱导角膜类器官的基础上，从SEAM 中分选出泪腺原基细胞并诱导出泪腺类器官，进一步实现了管腔结构和分泌泪膜蛋白等物质功能的成熟。泪腺类器官目前的应用也主要集中于干眼症疾病模型构建和相关药物筛选29，将其进行体内移植修复和替代受损泪腺也是被关注的研究点28。2眼类器官的体内移植在类器官研究初期，研究者就开始尝试将体外诱导得到的类器官植入动物活体内。自 2012 年 Yui 等30成功移植小肠类器官并减轻了急性肠炎小鼠症状后，肝脏、脑、视网膜、皮肤、肾脏、胰腺、肺脏、心脏等来自各胚层的类器官都被尝试植入体内，得到了良好的体内整合31，类器官展现出比单纯体外培养更成熟的结构，也具备一定功能。如今类器官体内移植研究更是已经投入临床开展试验，为受疾病苦痛的患者带来了希望32。为了治疗各种致盲性眼病，眼科研究者尝试将各眼部亚组织类器官移植入活体。与眼类器官研究数量整体情况相对应，眼类器官体内移植研究也以视网膜类器官体内移植为主，其余眼部亚结构则涉及角膜和泪腺。用于体内移植的视网膜类器官主要存在两种形式：视网膜片和视网膜细胞。2014 年 Assawachananont等33将视网膜类器官小球切成片层状，吹至小鼠视网膜下腔，发现移植物能在宿主视网膜中存活，发展出具有完整内外段的结构化外核层，并与宿主视网膜细胞产生突触连接。后期不同研究团队则进一步构建鼠、猴等视网膜疾病动物模型，并通过组织学标志物检测、电生理检查、行为测试等发现植入的视网膜类器官片不仅能与宿主形成突触连接，还能使移植区形成可被检测到的电生理活动，且模型动物能形成轻微的光感知34-36。而视网膜类器官中单类细胞的移植，以研究感光（前体）细胞、视网膜神经节细胞和视网膜祖细胞为主37，基本方法是将不同培养阶段的类器官消化成单细胞悬液，利用细胞表面特异性蛋白标志物或敲入基因的荧光分选出特定类型细胞后再注射入眼内。视网膜类器官源性的感光（前体）细胞在移植至视网膜下后一小部分（15%）能迁移穿过外界膜，与宿主视网膜外核层整合或进行物质交换38，表达感光细胞特异性蛋白 recoverin（RCVRN）和同源异型框蛋白（orthodenticlehomeobox2，OTX2）等，并在体内存活约半年13，使视网膜变性疾病模型动物对光产生反应39-41。类器官源性的视网膜神经节细胞体内移植已经实现了在宿主体内的整合存活（存活率5%）和 THY-1 膜糖蛋白（THY-1membraneglycoprotein，THY1/CD90）、脑特异性 POU 结构域同源盒基因 3a（brainspecifichomeobox/POUdomainprotein3a，BRN3A）、神经细胞黏附分子配体1（neuralcelladhesionmoleculeL1，NCAM-L1/CD171）等特异性标志物的表达42。由于视网膜类器官中诱导形成的神经节细胞比例较低（0.1%30.0%）且诱导分化至 24 周后几乎消失43-44，导致最终获得的可移植细胞比例较低，同时类器官源神经节细胞轴突较短（100m），影响与宿主之间的突触连接形成45，其体内移植相关研究不如感光细胞体内移植相关研究成熟；但研究者通过修改诱导体系、在培养基内添加脑源性神经营养因子、与 Mller 胶质细胞共培养或共移植等方法实现了移植效果的优化46。相较类器官视网膜片的移植，细胞移植缺失了对视网膜原有分层结构的保留，但能实现与宿主更直接的接触和吻合，减少“玫瑰花结（rosettes）”团块形成对体内整合的影响，减少因类器官中可能残留未分化的干细胞而引起的致瘤性，且普遍对手术操作的技术要求更低47。而无论使用何种类器官移植形态，为实现更佳且更能转化至临床的体内移植，研究者都需长期关注视网膜类器官细胞表面标志物的筛选、同类细胞的纯化、大规模生产、冻存和运输等研究进展。除了视网膜类器官体内移植之外，2016 年Hayashi 等15将 iPSC 诱导得到的 SEAM 来源的角膜上皮细胞片移植到角膜切除术后的新西兰兔的眼表，成功地加速了角膜屏障功能的恢复，并继续表达角膜特异性蛋白。2022 年，该研究团队将 48 个同样来自 SEAM 且诱导 10 周的泪腺类器官以基质胶包裹，移植到取出了完整或部分泪腺的大鼠泪腺组织中，发现泪腺类器官形成了相比起单纯体外培养更加清晰的导管结构，形成表达乳铁蛋白的分泌腺细胞，且人乳第 5 期胡乐怡等眼类器官的体内移植及组织工程支架的应用651 铁蛋白和溶菌酶蛋白含量升高，即分别实现了结构和功能的进一步成熟28。综上可知，体内移植后的眼类器官能够加速类器官结构和功能的成熟，更重要的是能与宿主自身结构相融合，甚至实现部分生理功能。单纯从优化眼类器官体内移植体系的角度，研究的切入点可以被总结为以下 4 个方面：（1）选择被移植眼类器官在体外发育的阶段，如哪个培养时间点的眼类器官，是否需要传代扩增、传多少代，是否涉及细胞类型、分子表达或类器官形态的富集和筛选。（2）优化眼类器官植入体内时的状态和数量，是应将眼类器官消化成单类器官悬液或细胞悬液，还是要形成类器官克隆片；得到混悬液中类器官的数量和浓度应为多少才能使被植入的组织修复但不至于结团。（3）需要试验眼类器官植入体内时所需要的培养介质和空间结构，是否需要基质胶等细胞外基质类似物提供支撑供给营养，是否需要利用组织工程技术将类器官搭建在一个特定的支架结构上。（4）植入的动物模型、部位和方式，植入何种类型的动物模型，疾病模型如何构建。同时，为了区分移植入体内的外源性细胞和动物原有的内源性细胞，研究者需要利用荧光嵌入等对外源性细胞进行标记，或通过对不同细胞表面蛋白特异性染色进行区别。眼类器官的体内移植相较于人体其他部位组织的类器官移植具有较大优势：首先，眼位于身体较浅表处，对其进行相关检查或手术操作都更加便捷，对于活体的创伤较小，观察手段也更加多样；再者，眼球相对免疫赦免，无论是血-视网膜屏障还是正常角膜无血管或淋巴管的生理状态，均为移植时的排斥反应提供了屏障。3组织工程支架在眼类器官体内移植中的应用3.1 组织工程支架概述在组织工程学研究中，组织工程支架作为生物组织或细胞增殖生长的载体，并非只是一个被动的三维结构，而是在维持组织体积、提供机械支撑和释放生物因子方面具有重要作用的核心部分。随着材料技术的不断发展和医疗需求的不断提高，组织工程支架也成为医疗领域的重点研究方向之一。一个理想的组织工程支架需具备以下特性：（1）具有良好的生物相容性，不会引起机体的炎症反应，可在植入后一定时间内被机体降解吸收，且在降解过程中不会损害周围组织；（2）有利于细胞和组织定植、增殖、分化及迁移，不具有细胞毒性也不影响细胞活性；（3）具有合适的三维孔隙结构，给附着的组织细胞一定空间，有利于生物因子的作用、营养的运输与代谢及血管化等生物过程的进行；（4）具备适当的机械性能，具体参数则与模拟的体内组织类型及特性相关。3.2 组织工程支架在眼类器官体内移植中的研究现状组织工程支架在眼类器官体内移植中的应用，从细胞移植研究开始已经逐渐受到关注，目前角膜和视网膜移植相关内容占眼部组织工程支架研究的绝大部分。角膜组织工程材料研发进展最快，角膜细胞及角膜缘干细胞移植常见的组织工程支架材料包括羊膜、脱细胞角膜、丝素蛋白和胶原蛋白等天然材料48；视网膜细胞移植常见的组织工程支架材料则包括丝素蛋白、海藻酸盐、透明质酸、细胞外基质分子及聚乳酸（polylacticacid，PLA）、聚乳酸-羟基乙酸（poly(lactic-co-glycolicacid)，PLGA）、聚己内酯（polycaprolactone，PCL）等人工合成聚合物49。相较而言，对于眼类器官体内移植的组织工程支架设计较少，且基本仅涉及视网膜类器官。2017 年 Li 等50将人 iPSC 系诱导成视网膜类器官后，将其神经上皮层诱导成视网膜神经节细胞，消化成单细胞并种植到静电纺丝技术形成的 PLGA 薄膜支架上，植入新西兰兔和猕猴玻璃体切除术后的视网膜；后期该研究团队进一步将视网膜类器官整体置于基质胶包裹的 PLGA 支架上植入猕猴视网膜，得到进一步成熟且向宿主视神经投射的类器官视网膜神经节细胞51。2018 年 Jung 等52设计了一种具有一系列杯形捕获孔且可降解的聚癸二酸甘油酯（poly(glycerolsebacate)，PGS）支架，将诱导得到的视网膜类器官消化后种植其上，有效捕获感光细胞并指导其轴突延伸，实现细胞极化。2021 年该团队在此研究基础上优化了支架的结构，得到了更薄更精密的多层高密度感光细胞支架，并将视网膜类器官消化后种植其上移植入大鼠眼内，发现支架顶部类器官来源感光细胞轴突末端的暴露面积更大，能与宿主的双极细胞实现更好的突触接触53。综上，组织工程支架可以为眼类器官的体内移植提供一个更符合正常生理结构的生态位，将外源性细652器官移植第 14 卷胞或组织集中在宿主体内特定区域，在细胞自组织过程中提供辅助作用，同时更易于实现类器官与宿主神经结构的连接，得到比将眼类器官直接植入体内更完善的结构及更好的功能。4挑战与展望目前眼类器官相关研究方兴未艾，研究成果呈指数扩增。为了将眼类器官植入体内实现组织器官的修复再生，人们近几年来探索了很多方式构建组织工程支架辅助其成熟，并得到了令人兴奋的结果，但是不可否认仍然存在很多瓶颈问题，目前研究结果离临床器官移植替代治疗还有很长一段距离。除了前文已提到的眼类器官诱导成熟及体内移植过程中需要突破的难点，从组织工程支架角度，研究者还需考虑支架的结构设计是否合理，在体内是否会使正常生理结构机械变形；支架如何与眼类器官牢固地组合、如何将这个组合与眼内结构整合；支架材料是否会对移植受者产生损害、表面特性是否能使细胞保持正常活性、支架的降解时间是否足以使眼类器官在体内成为一个具备活性和功能的结构；支架和眼类器官如何量产以达到对待修复眼亚结构的覆盖等问题。作为涉及医学生物科学和组织工程材料科学的一个新兴研究领域，组织工程支架辅助眼类器官体内移植的实现需要干细胞研究者、生物材料工程师和眼科临床医师的充分沟通和通力合作。在社会老龄化、医疗需求激增而供器官短缺的今天，类器官作为一种从人体细胞发育而来的具有极强可塑性的组织器官幼稚形态，极具实现人体修复再生潜能，而与材料工程学的结合使其具有更合适的生长环境及更强的与人体组织整合的能力。我们应该相信随着学科交叉的深入、各学科技术的发展及研究者们的不懈努力，成熟眼类器官借助组织工程支架的移植修复再生最终能够实现在临床上的应用，为患者提供一种全新的眼病治疗方法。致谢：感谢马婧宇给予本文选题灵感。参考文献：LANCASTERMA,KNOBLICHJA.Organogenesisinadish:modelingdevelopmentanddiseaseusingorganoidtechnologiesJ.Science,2014,345(6194):1247125.DOI:10.1126/science.1247125.1李金燕.培养皿中的眼睛:眼组织类器官技术发展与应用J.眼科学报,2022,37(2):100-110.DOI:10.3978/j.issn.1000-4432.2021.07.23.2LIJY.Aneyeinaculturedish:ocularorganoidsandtheir 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