一株Olivibacter jilunii纤维素降解菌株的分离鉴定与降解能力分析.pdf

研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(8):283-290收稿日期：2023-01-09基金项目：国家自然科学基金项目（31800028）作者简介：饶紫环，女，硕士研究生，研究方向：微生物遗传；E-mail:RZH通讯作者：谢志雄，男，博士，教授，博士生导师，研究方向：微生物遗传；E-mail:一株 Olivibacter jilunii 纤维素降解菌株的分离鉴定与降解能力分析饶紫环 谢志雄（武汉大学生命科学学院，武汉 430000）摘 要：为了获得常温新型纤维素降解细菌，在园林堆肥中分离纯化得到一株具有纤维素降解能力的细菌菌株 18B。通过刚果红染色实验和滤纸降解实验验证其纤维素降解能力。通过 16S rRNA 序列比对和全基因组比对确定其属于 Olivibacter 属，且与Olivibacter jilunii 14-2AT最为接近，进一步生理生化特征比较分析发现，其与 O.jilunii 14-2AT在生长温度、氧化酶和糖酵解等方面存在差异。菌株 18B 在 12-48范围内能生长，最适生长温度在 30-37。O.jilunii 14-2AT的生长温度在 4-42；菌株 18B 的氧化酶检测为阳性，糖酵解为阴性，O.jilunii 14-2AT则不具有氧化酶活性同时糖酵解为阳性。结合基因组共线性比对结果可知，菌株 18B 与 O.jilunii 14-2AT存在一定的进化关系。纤维素降解能力检测发现，在 37，200 r/min 培养至第 5 天时，菌株 18B 的纤维素酶活最高可达 82.14+0.99-9.90 U/L，同时在以羧甲基纤维素钠为唯一碳源，仅添加无机氮源的培养条件下可维持酶活不退化。O.jilunii 14-2AT则不具有纤维素降解能力，也无法在羧甲基纤维素钠为唯一有机碳源的培养环境下存活。筛选全基因组测序结果可知菌株18B 基因组上存在纤维素酶系基因。在大肠杆菌中异源表达筛选所得纤维素酶系基因，并检验表达产物的降解能力，结果表明筛选所得纤维素酶系基因确有酶活。综合以上结果，最终确定菌株 18B 属于具有纤维素酶活的 O.jilunii 新生理株。关键词：纤维素降解；Olivibacter jilunii；生理株；分离鉴定；16S rRNA 比对；纤维素酶活；全基因组序列分析DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2023-0014Isolation and Identification of a Cellulose-degrading Strain of Olivibacter jilunii and Analysis of Its DegradabilityRAO Zi-huan XIE Zhi-xiong（College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan 430000）Abstract:In order to obtain the new cellulose-degrading bacteria at normal temperature,a bacterial strain named as 18B with cellulose-degrading ability was isolated and purified from garden compost in this study.Congo red staining experiment and filter paper degradation experiment were conducted to verify its cellulose-degradation ability.16S rRNA sequence alignment and whole genome alignment confirmed that it belonged to the genus Olivibacter,and was the closest to Olivibacter jilunii 14-2AT.Further comparative physiological and biochemical characterization revealed differences with O.jilunii 14-2AT in terms of growth temperature,oxidase and glycolysis.The strain 18B grew in the range of 12-48,and the optimal growth temperature was 30-37.O.jilunii 14-2AT grew at 4-42.Strain 18B was positive for oxidase and negative for glycolysis,while O.jilunii 14-2AT had no oxidase activity and was positive for glycolysis.Combined with the results of the genome-wide covariance alignment,it was known that strain 18B had a certain evolutionary relationship with O.jilunii 14-2AT.The cellulose-degradation ability was found that the cellulase activity of 18B was up to 82.14+0.99-9.90 U/L at 37,200 r/min until the 5th d.Meanwhile,the enzyme activity could be maintained without degradation under the incubation conditions with sodium carboxymethyl cellulose as the only carbon source and only inorganic nitrogen source added.O.jilunii 14-2AT had no cellulose degrading ability and could not survive in a culture environment where 生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8284木质纤维素是自然界中含量最丰富的有机物，主要由木质素、纤维素和半纤维素组成。木质纤维素的生物处理一直被认为是解决化石燃料短缺问题的有效方法，也是未来新能源开发的趋势。木质纤维素的生物处理通常使用降解木质纤维素的酶，包括木质素酶、纤维素酶和半纤维素酶。其中纤维素酶主要应用于造纸业、洗涤剂、食品、工业生产酒精等领域1-2，约占全球工业酶需求的 8%3。针对不同的产业和目的，采用的纤维素酶种类也不同。尽管目前关于纤维素酶的研究不断取得进展，酶产品的成本仍然居高不下。筛选新型纤维素酶对相关工业的发展有着至关重要的作用。纤维素酶根据作用位点，可以大致分为外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶等4。外切葡聚糖酶主要作用于纤维素结晶区，终产物可以是葡萄糖或者纤维二糖。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素无定形区，随机切割产生新的末端，产物是一些不定长度的寡糖。-葡萄糖苷酶更倾向作用于非还原端，水解纤维糊精和纤维二糖产生葡萄糖。纤维素酶主要来源于纤维素降解菌株。其中真菌是研究最多的一类纤维素降解微生物。一般认为真菌的纤维素分解能力和酶活性普遍高于细菌，然而真菌的高酶活可能是源于其较强的蛋白分泌能力5，若具体到单酶的活性，细菌产生的酶可能会更适用于工业生产4。同时由于真菌酶系更为复杂，在纯化单酶时面临更多的技术问题。因此近年来相关研究更多集中于得到具有降解能力的细菌1。适应极端环境的细菌，如嗜热、耐碱等方向尤为受到关注。然而日常工农业生产活动更多的是在常温下进行，常温纤维素降解菌株有着更广阔的应用前景。不断筛选鉴定发现新型常温纤维素降解菌株对充实相关微生物资源有着重要意义，也为新型纤维素酶的研发提供了更多的思路。Olivibacter 属最早发现于 2007 年6，模式菌株为 Olivibacter sitiensis AW-6T，因在橄榄油废料中分离得到而得名。该属的典型特征为棒状，革兰氏染色阴性。Olivibacter 属内迄今为止已有 10 个已鉴定的新种，其中 Olivibacter jilunii 14-2AT于 2013 年从DDT 污染土壤中分离得到5。由于纤维素降解菌株主要富集在纤维素丰富的环境中，因此本研究从园林堆肥中选取分离基质，设计筛选培养基，得到常温下的纤维素降解菌株。根据分子鉴定，该菌株属于 Olivibacter 属，为该属内首次报道的具有纤维素降解能力的菌株。1 材料与方法1.1 材料园林堆肥样品：香樟（Cinnamomum camphora）落叶、法国梧桐（Platanus orientalis L.）落叶和杏鲍菇（Pleurotus eryngii）培养物等堆肥。CMC-Na（羧甲基纤维素钠）培养基：氯化钠 6.0 g/L，硫酸铵 2.0 g/L，无水氯化钙 0.1 g/L，七水合硫酸镁 0.1 g/L，磷酸二氢钾 0.5 g/L，磷酸氢二钾 2.0 g/L，CMC-Na 10.0 g/L。纤维素酶底物：10.0 g/L 羧甲基纤维素钠溶于pH 5.0 柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液。1.2 方法1.2.1 菌株的分离纯化及纤维素降解能力检测 从堆肥中取样，按 10 倍梯度稀释涂布于 CMC-Na 平板，每个稀释度进行 3 个平行。37恒温培养 3 d后挑取单菌落。于 CMC-Na 平板上进行平板划线纯化。连续 5 代培养纯化后，挑取单菌落接种于 CMC-Na 液态培养基中，37培养 3 d，取培养上清滴在CMC-Na 平板上，37恒温培养 5 d 后用刚果红染色液初步检测纤维素酶活。同时，取 0.5 cm 2 cm 的滤纸条灭菌烘干后加入 CMC-Na 液态培养基中，接sodium carboxymethylcellulose was the only organic carbon source.The results of whole genome sequencing showed that there were cellulase genes in the genome of strain 18B.The cellulase genes were heterologous expressed in Escherichia coli,and the degradation ability of the expressed products was tested.The results showed that the cellulase genes were active.The above results finally identified strain 18B as a new physiological strain of O.jilunii with cellulase activity.Key words:cellulose degrading;Olivibacter jilunii;physiological strain;isolation and identification;16S rRNA alignment;cellulase activity;genome-wide sequence analysis2023,39(8)285饶紫环等：一株 Olivibacter jilunii 纤维素降解菌株的分离鉴定与降解能力分析入菌液，置于 37培养 10 d 后，根据滤纸降解程度初步确定菌株的降解能力。经过上述两次初步筛选，选取降解性能优良的菌株进行下一步分析。1.2.2 菌株的 16S rRNA 基因序列比对分析 挑取单菌落利用 PCR7扩增 16S rRNA 基因序列，将PCR 产物送交天一辉远公司测序后获得 16S rRNA基因序列信息，在 NCBI（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/）和 EZBioCloud（https:/ NCBI 的 16S rRNA 基因序列比对结果，下载相近序列后，利用 MEGA-X 用 非 加 权 组 平 均 法（unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA）构建进化 树8-9。利用 PAUP*4.0a16910构建最大简约树（maximum parsimony tree,MP-tree）。1.2.3 菌株基因组比较分析 将分离的菌株送生工生物公司进行全基因组测序。相近种属的基因组序列在 NCBI 上获得。利用 EZBioCloud（https:/ 算 OrthoANIu，在 JSpeciesWS（https:/ ANIb和 ANIm；利用 Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0（https:/ggdc.dsmz.de/ggdc.php）计算 DDH；利用Mauve 进行共线性比对11；用 BRIG 进行 GC 值比 对，并利用 BRIG 的基因位置标注功能特别标注纤维素酶相关基因12。1.2.4 生理生化特征检测 检测菌株 18B 和 O.jilunii 14-2AT的生长温度、生长 pH、NaCl 耐受、糖酵解、硝酸盐还原、氧化酶和-半乳糖苷酶活性等生理生化指标。VP 测试采用 Barritt 法。将菌株平板划线法接种于 MacConkey 平板，37培养 3 d 连续观察菌落形态和颜色13。1.2.5 纤维素酶活的测定 酶活单位：1 min 催化底物羧甲基纤维素钠生成 1 mol 还原糖的酶量即为1 U。葡萄糖标准曲线的制作参照 Miller 的方法14，使用 Cytation3 酶标仪测定 540 nm 吸光度。将菌株按照 0.5%（V/V）的比例接种于 CMC 液体培养基中，37，200 r/min 培养，不同时间取培养液经 0.22 m滤膜过滤得到粗酶液。将粗酶液 100 L 与底物 900 L 混合后，对照组立即沸水浴 5 min，然后冰浴；实验组在 50水浴锅中反应 20 min。随后向对照组和实验组中同时添加 2.0 mL DNS，沸水浴 5 min 后，冷却至室温，吸取反应液 200 L，加入 96 孔酶标板中，使用 Cytation3 酶标仪测定 540 nm 吸光度。将所得吸光度代入公式：?U/L?=kV?V?+V?OD540“?”OD540“?”1 mL1 000 mL/L180 g/mol106 mol/molt（k：葡萄糖标准曲线斜率；t：反应时间）计算酶活。1.2.6 纤维素酶相关基因异源表达及检测 根据全基因组测序的基因注释，结合蛋白结构分析，定位菌株纤维素酶相关基因，并对其中酶活潜力最大的蛋白基因克隆进 pET26b 质粒，将质粒转入Escherichia coli BL21 中。利用 IPTG 进行诱导表达。检测异源表达蛋白纤维素降解活性。2 结果2.1 菌株的筛选及16S rRNA 序列进化分析 在 CMC-Na 平板上共纯化得到纤维素降解细菌17 株，根据滤纸降解能力（图 1-A）和刚果红褪色圈直径（图 1-B）确定编号为 18B 的菌株降解能力最为突出。18B?ABA：滤纸降解；B：刚果红褪色圈检测A:Degradation of filter paper.B:Congo red fading circle图 1 菌株 18B 纤维素降解能力检测Fig.1 Detection of cellulose degradation ability of strain 18B通过 PCR 扩增获得菌株 18B 的 16S rRNA 基因序列（1 387 bp）及 NCBI 和 EZBioCloud 比对发现，与其相似度在 97.00%以上的细菌有 2 株。菌株 18B 的 16S rRNA 基因序列在 NCBI 数据库中比对结果最相近的分别为 O.jilunii 14-2AT（99.35%）和 Olivibacter oleidegradans TBF2/20.2T（99.28%）。生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8286在 EZBiocloud 数据库中比对结果最相近的为 O.oleidegradans TBF2/20.2T（99.42%）和 O.jilunii 14-2AT（99.13%）。利用 MEGA-X 构建进化树，其中UPGMA 进化树见图 2，与菌株 18B 亲缘关系最接近的 是 O.jilunii 14-2AT和 O.oleidegradans TBF2/20.2T两菌株。利用 PAUP 构建的 MP 进化树（图 3），一致性指数（consistency index,CI）值为 0.553，保留指数（retention index,RI）值为 0.689，重缩放一致性指数（rescaled consistency index,RC）值为 0.381，非同源相似性指数（homoplasy index,HI）值为 0.447。MP 进化树与 UPGMA 进化树相似，表明结果可信，提示菌株 18B 属于 Olivibacter 属。Olivibacter ginsengisoli Gsoil 060 Olivibacter composti CC-KYC063 Olivibacter terrae Jip13Olivibacter domesticum DC186 Olivibacter soli Gsoil 03418BOlivibacter jilunii 14-2AOlivibacter oleidegradans TBF2/20.2 Sphingobacterium lactis WCC 4512 Sphingobacterium daejeonense TR6-04 Sphingobacterium cellulitidis LMG 28764 Sphingobacterium mizutaii DSM 11724 Sphingobacterium mizutaii LMG 8340 Sphingobacterium mizutaii NBRC 14946 Parapedobacter lycopersici T16R-256 Parapedobacter luteus 4M29 Parapedobacter koreensis Jip14 Parapedobacter soli DCY14 Pararcticibacter amylolyticus FJ4-8 Pedobacter indicus SM1810 Albibacterium bauzanense BZ4210092100859065100776599975410099905010048图 2 基于 16S rRNA 序列构建的非加权组平均法进化树（以 Albibacterium bauzanense BZ42 为外群）Fig.2 UPGMA-tree based on 16S rRNA(Albibacterium bauzanense BZ42 used as the outgroup)2.2 菌株18B的基因组比较分析 为进一步鉴定菌株 18B，对其进行全基因组测序及比对分析。全基因组测序的结果表明菌株 18B的基因组长度为 5 976 778 bp，利用 EZBiocloud 和JSpeciesWS 的 ANI（average nucleotide identity）计算结果显示 18B 和 O.jilunii 14-2AT的相似度均在 95%以上，不符合新种界定的范围。EZBiocloud 上计算OrthoANIu（orthologous average nucleotide identity），结果显示 18B 与 O.jilunii 14-2AT的 ANI 为 98.42%。在 JSpeciesWS 上，以 O.jilunii 14-2AT的基因组作为参考序列，ANIb 为 97.58%，ANIm 为 98.85%。在Genome-to-Genome Distance Calculator 3.0 计 算 菌 株18B 和 O.jilunii 14-2AT的 DDH（DNA-DNA hybrid-ization），参考结果为 87.60%。根据以上结果，可确定 18B 属于 O.jilunii。对 18B 和 O.jilunii 14-2AT进行进一步的比对分析。图 4 展示的共线性结果可知，18B 与 O.jilunii 14-2AT之间存在着一定的进化关系。图 5 展示的为 BRIG 绘制 Olivibacter 属内的基因组比对结果，参考序列为 18B，由图可知 18B 与该属内的其他菌株之间存在着一定的进化距离，部分小片段上相似度较低。0.510070495610093757410081100619999100Sphingobacterium mizutaii LMG 8340 Sphingobacterium mizutaii DSM 11724 Sphingobacterium mizutaii NBRC 14946 Sphingobacterium cellulitidis LMG 28764 Sphingobacterium lactis WCC 4512 Sphingobacterium daejeonense TR6-04 Parapedobacter koreensis Jip14 Parapedobacter soli DCY14 Parapedobacter luteus 4M29 Parapedobacter lycopersici T16R-256 18BOlivibacter jilunii 14-2AOlivibacter oleidegradans TBF2/20.2 Olivibacter terrae Jip13 Olivibacter composti CC-KYC063Olivibacter ginsengisoli Gsoil 060 Olivibacter domesticum DC186 Olivibacter soli Gsoil 034 Pararcticibacter amylolyticus FJ4-8 Pedobacter indicus SM1810 Albibacterium bauzanense BZ42图 3 基于 16S rRNA 序列构建最大简约树（以 Albibacte-rium bauzanense BZ42 为外群）Fig.3 MP-tree based on 16S rRNA(Albibacterium bauzan-ense BZ42 used as the outgroup)2023,39(8)287饶紫环等：一株 Olivibacter jilunii 纤维素降解菌株的分离鉴定与降解能力分析2.3 生理生化检测分析 对菌株 18B 和 O.jilunii 14-2AT进行常见生理生化特征比较实验，发现菌株 18B 与 O.jilunii 14-2AT在生长温度、氧化酶和糖酵解等方面存在差异（表 1）。2.4 菌株18B产纤维素酶活分析 在 LB 中转接一代后，菌株 18B 产纤维素酶活有明显的下降，表明菌株 18B 在营养丰富培养基中图中上方为菌株 18B，下方为 O.jilunii 14-2AT It in the upper part of the figure it is strain 18B and in the lower part is O.jilunii 14-2AT图 4 菌株 18B 和 O.jilunii 14-2AT的全基因组共线性比对Fig.4 Genome-wide covariance alignment of strain 18B and O.jilunii 14-2AT从 NCBI 上下载目前 Olivibacter 属内相关菌株全基因组序列信息，与菌株18B一同进行比对。图中sitiens指菌株O.sitiensis AW-6T，domesticus指菌株O.domesticus DC186T，LS_1 指菌株 O.sp.LS-1，jilunii 指菌株 O.jilunii 14-2ATComplete genome sequence information of related strains in Olivibacter genus was downloaded from NCBI and compared with strain 18B.In the figure,sitiens indicates the strain O.sitiensis AW-6T,domesticus indicates O.domesticus DC186T,and LS_1 indicates O.sp.LS-1.jilunii refers to strain O.jilunii 14-2AT图 5 Olivibacter 属内基因组比对Fig.5 Genome alignment within the genus Olivibacter表 1 18B 和 O.jilunii 14-2AT常见生理生化特征比对Table 1 Comparison of common physiological and bioche-mical characteristics between 18B and O.jilunii 14-2AT项目 Item18BO.jilunii 14-2AT生长温度/12-484-42生长 pH6.0-8.06.0-9.0NaCl 耐受/%0-60-5氧化酶+-硝酸盐还原+糖酵解-+VP+-半乳糖苷酶+革兰氏染色-MacConkey agar+（Red）+（Red）培养存在严重的产酶退化现象，但是在仅含羧甲基纤维素钠的培养环境中，菌株 18B 的退化不明显（图6）。同时，未测得 O.jilunii 14-2AT的纤维素酶活。2.5 菌株18B纤维素酶合成相关基因分析 因为该属内的菌株未有关于纤维素降解能力的报道。根据全基因组测序的注释结果，对菌株 18B纤维素酶合成相关基因进行分析，共得到纤维素酶合成相关基因 7 个（图 4），选择其中标记为纤维素内切酶的基因序列，使用 NCBI 蛋白比对功能确定相关基因具有纤维素酶活性位点。最后确定 4 个最优潜力的纤维素酶合成相关基因。这 4 个基因分别编码蛋白为内切葡聚糖酶 D 前体（endoglucanase D precursor,celD），标记为 D；内切葡聚糖酶 Z 前体（endoglucanase Z precursor,celZ），标记为 Z；纤维素酶 M（cellulase M），标记为 M；纯内切葡聚糖酶（putative endoglucanase），标记为 P。图 7 显示异源生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.8288表达后菌液中的基因检测结果，表明诱导表达后的菌液中携带有目的基因。图 8 展示的是蛋白质的检测，表明各基因在该条件下诱导表达成功。D 蛋白和 P 蛋白主要存在于上清中，Z 蛋白和 M 蛋白沉淀中含量更高。同时测得酶活，D 蛋白酶活为 3.17 U/L，Z 蛋白酶活为 2.37 U/L，M 蛋白酶活为 2.57 U/L，P蛋白酶活为 1.98 U/L。Marker 为 Trans2k plusII；D 为内切葡聚糖酶 D 前体基因，长度为 1 812 bp；M 为纤维素酶 M 基因，长度为 1 119 bp；Z 为内切葡聚糖酶 Z 前体基因，长度为 1 542 bp；P 为纯内切葡聚糖酶基因，长度为 1 395 bpMarker is Trans2k plusII.D is the precursor gene of endoglucanase D,the length is 1 812 bp.M is cellulase M gene with length of 1 119 bp.Z is the precursor gene of endoglucanase Z,the length of which is 1 542 bp.P is a pure endoglucanase gene with a length of 1 395 bp图 7 诱导表达后基因检测Fig.7 Gene amplification after induction of expression 3 讨论3.1 菌株18B属于O.jilunii 根据 16S rRNA 基因序列、全基因组序列和生理生化特征比对，确定菌株 18B 属于 O.jilunii。其中，菌株 18B 与 O.jilunii 14-2AT的基因组长度差距较大。同时，通过共线性分析可知，菌株 18B 与 O.jilunii 14-2AT存在大区段的重排和缺失。在生理生化特征上，菌株 18B 和 O.jilunii 14-2AT的主要区别在于生长温度、氧化酶、糖酵解以及纤维素降解。由于堆肥发酵存在高温时期15，菌株 18B 的生长温度和最适温度较 O.jilunii 14-2AT有向高温区段偏移的趋势。这是一种环境适应性的表现。综合以上证据，可以54.4382.1479.1775.2116.8225.7323.7517.8101020304050607080903579CMC?LB?Culture time/d?Enzyme activity/(UL-1)灰线为 CMC-Na 培养环境中转接后的菌株纤维素酶活，红线为从 CMC-Na 培养环境转接至 LB 中培养一代后的菌株纤维素酶活；O.jilunii 14-2AT的酶活未测得The gray line is the cellulase activity of the strain after transfer from CMC-Na culture environment,and the red line is the cellulase activity of the strain after transfer from CMC-Na culture environment to LB culture for one generation.The enzyme activity of O.jilunii 14-2AT was not detected图 6 18B 纤维素酶活随培养时间变化Fig.6 Variation of 18B cellulase activity with incubation time0：Maker；1：D 蛋白表达后破细胞全液；2：D 蛋白表达后破细胞上清；3：D 蛋白表达后破细胞沉淀；4：Z 蛋白表达后破细胞全液；5：Z 蛋白表达后破细胞上清；6：Z 蛋白表达后破细胞沉淀；7：空载诱导表达后破细胞全液；8：空载诱导表达后破细胞上清；9：空载诱导表达后破细胞沉淀；10：marker；11：M 蛋白表达后破细胞全液；12：M 蛋白表达后破细胞上清；13：M 蛋白表达后破细胞沉淀；14：P 蛋白表达后破细胞全液；15：P 蛋白表达后破细胞上清；16：P 蛋白表达后破细胞沉淀；17：空载诱导表达后破细胞全液；18：空载诱导表达后破细胞上清；19：空载诱导表达后破细胞沉淀。红框圈出的为目的蛋白区段0:Maker.1:The whole solution broken after D protein expression;2:the supernatant broken after D protein expression;3:the precipitation broken after D protein expression;4:the whole fluid broken after Z protein expression;5:the supernatant broken after Z protein expression;6:the precipitation broken after Z protein expression;7:the whole solution of cell breaking after no-load induction expression;8:the supernatant of cell breaking after no-load induction expression;9:the precipitation of cell breaking after no-load induction expression;10:marker;11:the whole solution broken after M protein expression;12:the supernatant broken after M protein expression;13:the precipitation broken after M protein expression;14:the whole fluid broken after P protein expression;15:the supernatant broken after P protein expression;16:the precipitation broken after P protein expression;17:the whole solution of cell breaking after no-load induction expression;18:the supernatant of cell breaking after no-load induction expression;19:the precipitation of cell breaking after no-load induction expression.The red box marked the target protein region图 8 纤维素酶基因诱导表达蛋白检测Fig.8 Protein assay of cellulase gene induced expression2023,39(8)289饶紫环等：一株 Olivibacter jilunii 纤维素降解菌株的分离鉴定与降解能力分析判断菌株 18B 与 O.jilunii 的模式菌株存在一定差别，可定为新的生理株，补充了国内该属的种质资源。3.2 菌株18B的纤维素降解能力 菌株 18B 的主要纤维素酶系为内切葡聚糖酶和-葡萄糖苷酶，根据几个相关基因的异源表达结果，可知这些基因具有一定的活性。但是相比于全菌的纤维素酶活性，相关基因的纤维素酶活性较低。可能是由以下两个原因导致。其一，异源表达载体采用 T7 启动子，非强启动子，蛋白表达量有限。其二，菌株 18B 具有调节纤维素酶基因和运送相关蛋白酶的通路，可增强相关基因的表达并将蛋白酶高效运输出细胞，以提高培养环境中羧甲基纤维素的利用效率。在内切葡聚糖酶 D 前体的上游，有外膜蛋白组装因子 BAMB 前体（outer membrane protein assemb