一种桔皮低成本培养细菌纤维素的研究.pdf

五邑大学学报（自然科学版）JOURNAL OF WUYI UNIVERSITY （Natural Science Edition）第 37 卷 第 3 期 2023 年 8 月 Vol.37 No.3 Aug.2023 文章编号：1006-7302（2023）03-0001-07 一种桔皮低成本培养细菌纤维素的研究 刘兴菲，林轶超，张宇萍，李小芳，梁丽华，曾牡玲，CASALS MERCADAL Eudald（五邑大学 生物科技与大健康学院，广东 江门 529020）摘要：细菌纤维素（bacterial cellulose，简称 BC）是由木醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus）生产的一种具有高纯度、高持水能力、高机械强度、高结晶度和弹性的生物聚合物.本研究以木醋杆菌为菌株，在静态条件下培养3 d，Hestrin-Schramm（HS）培养基中气-液界面产生干重为0.188 g/20 mL的 BC 薄膜；分别使用桔皮培养基、桔皮和 HS 混合培养基、HS 培养基培养 BC 薄膜，用 SEM、TEM 进行表征，结果表明，采用不同培养基培养的 BC 的形貌结构不会发生变化.除此之外，本研究还发现采用桔皮、甘蔗皮、杂草等废料作为培养基均可以产生BC，虽在相同的时间内，其产量低于 HS 培养基的产量，但不会改变 BC 的形貌结构.采用废果皮制备 BC 生产的培养基，可以实现废弃果皮的再利用、降低 BC 的生产成本、提高 BC 的实用性，在大规模生产中具有潜在价值.关键词：细菌纤维素；木醋杆菌；HS 培养基；桔皮；甘蔗；杂草 中图分类号：Q815 文献标志码：A A Study of Low-cost Culturing of Bacterial Cellulose from Orange Peels LIU Xing-fei,LIN Yi-chao,ZHANG Yu-ping,LI Xiao-fang,LIANG Li-hua,ZENG Mu-ling,Eudald CASALS MERCADAL(School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University,Jiangmen 529020,China)AbstractAbstract:Bacterial cellulose(BC)is a biopolymer with high purity,high water holding capacity,good mechanical strength,elasticity and high crystallinity produced by Acetobacter xylinus.In this study,Acetobacter xylosus was used as the strain.Under static conditions,BC films with dry weight were generated on the air-liquid interface of Hestrin-Schramm(HS)medium after 3 days of culture under static conditions using Gluconacetobacter xylinus as the strain.The BC films were cultured with orange peel medium,mixed orange peel and HS medium,and HS medium,and were characterized by SEM and TEM.The results show that the morphology and structure of BC cultured with different medium do not change.In addition,this study also found that the use of orange peels,sugarcane skins,weeds and other wastes as media could also produce BC,and its yield was lower than produced by the HS medium in the same duration,but it did not change the morphological structure of BC.Therefore,the use of waste peels to prepare BC production medium can realize the reuse of waste peels,reduce the production cost of BC,improve its practicality,and have potential value in large-scale 收稿日期：2023-03-10 作者简介：刘兴菲（1998），女，江苏连云港人，在读硕士生，主要研究方向为纳米复合材料的制备及其应用；CASALS MERCADAL Eudald，副教授，博士，硕士生导师，通信作者，主要研究方向纳米颗粒、复合材料的研发.五邑大学学报（自然科学版）2023 年 2 production.Key words:Key words:Bacterial cellulose;Gluconacetobacter xylinus;HS media;Orange peels;Sugarcane;Weeds 细菌纤维素（Bacterial cellulose，简称 BC）是细菌合成的胞外多糖，它是由葡萄糖单体分子以-1,4-糖苷键聚合而成的高分子聚合物.与植物纤维相比，BC 不含木质素、果胶、半纤维等杂质，除了具有优良的生物相容性和生物降解性外，还具有纳米网状结构、高纯度、高抗张强度以及高持水性等独特性质.基于此，BC 已广泛应用于生物医学、造纸、化妆品、环境污染治理以及食品制造等领域.细菌纤维素的合成主要是细菌内的纤维素合成酶等催化酶通过一系列的酶促反应将培养基中存在的葡萄糖转化为-1,4-葡萄糖苷链，该葡萄糖苷链在菌体外不断聚合结晶，最终形成 BC 纳米纤维1.该合成过程需要在有氧环境下进行2.由于 BC 在动态培养条件下易形成细胞突变体，因此 BC培养一直在静态条件下进行3-4.根据培养条件、使用的添加剂和总细胞数量的不同，可以有效控制BC 孔隙结构及厚度，根据培养容器的不同可以产生各种不同形状的 BC 膜，在实验室和工业中，各种尺寸的罐子、培养皿、水平托盘以及 24 孔、12 孔、6 孔板已被用于培养 BC5.BC 的培养一般需要214 d，大部分生产都发生在对数阶段和固定阶段.BC 的培养经常使用复合培养基，如 Hestrin-Schramm 培养基6，其中葡萄糖作为碳源、蛋白胨和酵母提取物作为氮源、柠檬酸盐和磷酸盐作为缓冲液维持培养基的 pH 值（pH 值随着葡萄糖酸的产生而降低）.目前，用 HS培养基培养 BC 成本太高，无法使细菌纤维素成为具有商业吸引力的生物材料，因此，大部分研究都是为了降低 BC 的生产成本.使 BC 生产在经济上可行的方法之一就是降低培养基的成本，研究表明，使用工业废物或副产品7-9、粗秸秆10-11等作为 BC 培养基的碳源是可行的.还有研究表明，可从含有丰富碳水化合物的各种废物中培养 BC12-15.本研究拟采用桔皮、甘蔗皮、杂草等废弃物制备BC 产生的培养基，旨在降低 BC 生产成本，并研究不同培养基对 BC 产量与形貌结构的影响等.1 实验材料与方法 1.1 实验材料和仪器 葡萄糖醋杆菌（Gluconacetobacter xylinus，原 Anisopodus xylinus）：北欧生物科技，保存于80 C冰箱中；用于细菌纤维素培养的试剂葡萄糖、酵母浸粉、酵母蛋白胨、无水柠檬酸、242Na HPO12H O和琼脂：上海阿拉丁生化科技股份有限公司.冷冻干燥机：埃朗科技国际贸易（上海）有限公司；超净工作台：苏州安泰空气技术有限公司；高压蒸汽灭菌器：苏州瑞诺德生物科技有限公司；培养摇床：伊孚森生物技术（中国）有限公司.1.2 实验方法 1.2.1 培养基的制备 HS 培养基的制备：分别称取20 g葡萄糖、5 g酵母浸粉、5 g酵母蛋白胨、1.15 g无水柠檬酸、2426.8 g Na HPO12H O和15 g琼脂（仅用于固体培养基）混匀后加入1000 mL超纯水，加入磁子置于磁力搅拌器上搅拌10 min，直至培养基充分溶解，放置于高压灭菌锅中121 C、30 min进行灭菌.桔皮培养基的制备：桔皮称量255 g，用搅拌机搅碎，与200 mL超纯水混合.然后，用滤布过滤桔皮渣，将桔皮汁分离.使用高压灭菌锅灭菌121 C、30 min进行灭菌.甘蔗皮培养基和杂草培养基第 37 卷 第 3 期 3 刘兴菲等：一种桔皮低成本培养细菌纤维素的研究 的制备方法与桔皮培养基制备方法一致.混合培养基的制备：桔皮称量255 g，用搅拌机搅碎，与200 mL超纯水混合.用滤布过滤桔皮渣，将桔皮汁分离，取100 mL桔皮汁与100 mL HS培养基混合，最后使用高压灭菌锅灭菌121 C、30 min进行灭菌.1.2.2 琼脂培养板的制备 用 75%酒精擦拭琼脂培养基的瓶身，随后放置在超净工作台上进行倒平板实验，培养皿的盖子倾斜60，加入约 1/3 的培养基，按照该方法将培养基全部倒入培养皿中放置在工作台上，待培养基凝固后将板子收入灭菌袋中，4 C保存.1.2.3 菌种活化 将保存于80 C冰箱中的冻存木醋杆菌菌液移置20 C、4 C冰箱中进行解冻，随后用 75%酒精消毒后放置在超净工作台上，用移液器取150 L菌液于琼脂培养板上，用涂布器将菌液铺满整个琼脂板，倒置于27 C培养箱中静置培养3 d.1.2.4 BC 的培养 在15 mL离心管中添加3 mL液体培养基，用一次性接种环从培养板上挑取单个菌落到3 mL液体培养基中，重复上述操作，将琼脂板上的菌株全部转移到液体培养基中，在27 C培养箱中静置培养3 d.3 d后，在超净工作台上，用无菌夹子将气液界面产生的 BC 夹出，浸泡于 75%酒精溶液中，随后分别在50 mL离心管中添加40 mL液体培养基，加入3 mL菌液在27 C培养箱中静置培养3 d.3 d后，分别在20 mL培养基（HS、混合培养基、桔皮培养基）中添加2 mL菌悬液，在27 C培养箱中静置培养14 d.在3 mL培养基（桔皮、甘蔗皮和杂草）中分别加入1 mL菌悬液，在27 C培养箱中静置培养7 d.1.2.5 BC 的清洗 将从培养基中取出的 BC 浸泡于 75%酒精中，随后转移到超纯水中，在磁力加热搅拌器上98 C加热搅拌20 min，去除 BC 中含有的菌液和培养基，随后用0.5%NaOH溶液，90 C、20 min清洗 34 次，直至 BC 膜呈现透明色，最后在超纯水中95 C清洗数次，直至溶液 pH 值呈中性即可.清洗后的 BC 保存于超纯水中，常温放置.1.2.6 BC 的干燥 主要采用两种方式对 BC 膜进行干燥，一种是室温干燥法，一种是冷冻干燥法.室温干燥法是将BC 膜平铺于吸水纸上，随后放置在通风橱中，812 h 后从吸水纸上取下干燥的 BC 膜即可；冷冻干燥法是将 BC 膜平铺于培养皿等容器中，贴上封口膜并在封口膜上扎洞，在20 C冰箱中冻存812 h 后，放置于20 C的冷冻干燥机中干燥24 h后取出即可.1.3 BC 的表征 将不同培养基培养的 BC 膜，采用室温干燥法进行干燥，随后通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）对 BC 进行表征.使用 Oxford Quorum SC7620 溅射镀膜仪喷金45 s，随后使用 TESCAN MIRA LMS 扫描电子显微镜拍摄样品形貌，从而获得 BC 的 SEM 图像.使用配备 Orius（Gatan）CCD 相机的80 keV透射电子显微镜 JEOL1010，将样品放在涂有聚醋酸甲基乙烯脂的超薄200 目铜网上，从而获得 BC 的 TEM 图像.最后，收集 BC 的 SEM 和 TEM 图像并进行分析.五邑大学学报（自然科学版）2023 年 4 2 结果与讨论 2.1 不同培养基合成 BC 的表征 分别采用 HS 培养基、混合培养基以及桔皮培养基来培养木醋杆菌合成 BC 膜，如图 1 所示：在相同时间内，不同培养基培养的 BC 膜在外观上没有特殊区别.其 SEM 表征结果如图 2 所示：可以清晰看出 BC 由纤维束组成，3 种不同培养基产生的 BC 的 SEM 相貌结构一致；由各个单纤维交错无序排列形成多孔网络结构，该结构赋予 BC 高吸水性、持水性以及机械强度.图 3 显示了不同尺寸下，不同培养基产生的 BC 通过透射电子显微镜拍摄的图像：HS 培养基产生的 BC，其单根纤维比桔皮培养基产生的 BC 的单根纤维粗，在高倍镜下，该现象也较为明显.综上，采用混合培养基、桔皮培养基培养的 BC 在形貌结构上与 HS 培养基培养的 BC 一致.a.桔皮培养基 b.混合培养基 c.HS 培养基 图 1 不同培养基合成 BC 膜 a.桔皮培养基 b.混合培养基 c.HS 培养基 图 2 不同培养基合成 BC 的 SEM 表征图 200 nm 200 nm 200 nm 2m 2m 2m 第 37 卷 第 3 期 5 刘兴菲等：一种桔皮低成本培养细菌纤维素的研究 a.桔皮培养基 b.混合培养基 c.HS 培养基 图 3 不同培养基合成 BC 在2 m和50 nm尺寸下的 TEM 表征图 2.2 不同培养基合成 BC 的产量 由图 4 可知：1）随着培养周期的递增，3 种培养基发酵产生而得的纤维素的厚度和产量也会随之增加，即在同一培养条件下，纤维素的产量与培养天数呈正相关.2）关于 BC 产量有 HS 培养基混合培养基桔皮培养基，HS 培养基发酵 2 天所得纤维素的产量，单用桔皮水需发酵5 d，用混合培养基约需发酵4 d；桔皮培养基14 d的 BC 产量约为 HS 培养基产量的一半，因此，使用桔皮培养基可以培养 BC，且培养基成本低廉，符合工业大规模生产需求.2.3 废弃果皮培养基合成 BC 及其产量 研究表明利用各种农工资源均可培养细菌纤维素，Moon 等16在30 L生物反应器中，采用糖化食品垃圾培养木醋杆菌菌株，其 BC 产量是18 g/L.目前利 用 水 果 发 酵 培 养 基 培 养 BC 的 研 究 报 道 较 少，Kurosumi 等17研究橙子、菠萝、苹果、日本梨和葡萄的果汁作为培养细菌纤维素的发酵原料，橙汁在培养 14天后显示出最高的细菌纤维素产量 5.9 g/L.Castro 等18采用葡萄糖乙酰杆菌（Gluconacetobacter swingsiisp）研究 在菠 萝 皮 汁 和 甘蔗 汁 上 培 养 细菌 纤 维 素 的 能 力.Adebayo-Tayo 等19采用木瓜汁培养细菌纤维素，其 BC产量约为 7.7 g/L.本文用从桔皮、甘蔗、杂草中提取的汁水作为培养基来培养木醋杆菌，27 C静态培养17 d，其产量如图 5 所示，用 0.5%氢氧化钠溶液将 BC清洗干净（如图 6 所示），随后进行冷冻干燥，用天平称量各 BC 的干重，即为不同培养基产 BC 的量.由图 5可 知：不 同 培 养 基 BC 产 量 最 多 的 是 桔 皮 培 养 基（2.06 mg/3mL），其次是甘蔗皮培养基（1.88 mg/3mL），产量最少的是杂草培养基（1.7 mg/3mL）.虽然本文采用桔皮、甘蔗皮以及杂草培养基培养细菌纤维素的产量较低，但实证了该培养基可以进行细菌纤维素的培养，降低了其的工业生产成本.50 nm 50 nm 50 nm 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 产量/（g/20 mL）0 2 4 6 8 10 12 14 时间/d 图 4 不同培养基合成 BC 的产量变化 HS培养 混合培养基 桔皮培养基 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 产量/（mg/3 mL）0 1 2 3 4 5 6 7 时间/d 图 5 不同废弃果皮合成 BC 的产量变化 桔皮培养基 甘蔗皮培养基 杂草培养基 五邑大学学报（自然科学版）2023 年 6 a.甘蔗 b.杂草 c.桔皮 d.HS 图 6 不同废弃果皮制备的 BC 膜 2.4 培养基成本核算 在不考虑运输成本、保存成本的情况下，以500 mL为例，HS 培养基、桔皮培养基、甘蔗皮培养基和杂草培养基成本如表 1 所示.不同培养基对 BC 的产量有影响，但从表征结果可知其培养的BC 形貌结构与 HS 培养的一致，但成本却低得多，因此选择废弃果皮制备培养基能有效降低 BC 的培养成本，使得低成本 BC 产量化生产切实可行.表 1 不同培养基成本表 种类 HS 培养基 桔皮培养基 甘蔗皮培养基 杂草培养基 成本/元 3.250 0.191 0.255 0 3 结论 本研究通过采用一种易于获得的培养基（即产生附加值的水果加工废料）培养 BC.这种培养基降低 BC 的生产成本，使其可以大量应用于工业.近年来，生物医学领域对细菌纤维素需求量大，目前可用的医用植入物主要是进口的，相关费用非常高.因此，降低 BC 生产成本以及大规模生产BC 至关重要，果皮在加工果汁时通常会被丢弃，但果皮含有丰富的糖，如葡萄糖、果糖和蔗糖，这些糖可以转化为有价值的最终产品，在本研究中使用低成本培养基培养 BC，实现了整体工艺经济，并符合工业应用所需的生产标准.参考文献 1 MONIRI M,AMIN B M,AZIZI S,et al.Production and status of bacterial cellulose in biomedical engineering J.Nanomaterials,2017,7(9):257.2 RMLING U.Molecular biology of cellulose production in bacteria J.Research in microbiology,2002,153(4):205-212.3 KRYSTYNOWICZ A,CZAJA W,WIKTOROWSKA-JEZIERSKA A,et al.Factors affecting the yield and properties of bacterial cellulose J.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2002,29(4):189-195.4 VALLA S,KJOSBAKKEN J.Cellulose-negative mutants of acetobacter xylinum J.Microbiology,1982,128(7):1401-1408.5 KRALISCH D,HESSLER N,KLEMM D,et al.White biotechnology for cellulose manufacturingthe HoLiR concept J.Biotechnology and bioengineering,2010,105(4):740-747.6 HESTRIN S,SCHRAMM M.Synthesis of cellulose by acetobacter xylinum 2:Preparation of freeze-dried cells capable of polymerizing glucose to cellulose J.Biochemical Journal,1954,58(2):345.第 37 卷 第 3 期 7 刘兴菲等：一种桔皮低成本培养细菌纤维素的研究 7 KESHK S M A S,RAZEK T M A,SAMESHIMA K.Bacterial cellulose production from beet molasses J.African Journal of Biotechnology,2006,5(17):1519-1523.8 EL-SAIED H,EL-DIWANY A I,BASTA A H,et al.Production and characterization of economical bacterial cellulose J.Bioresources,2008,3(4):1196-1217.9 HONG F,QIU K Y.An alternative carbon source from konjac powder for enhancing production of bacterial cellulose in static cultures by a model strain Acetobacter aceti subsp.xylinus ATCC 23770 J.Carbohydrate Polymers,2008,72(3):545-549.10 HONG F,YING X Z,YANG G,et al.Wheat straw acid hydrolysate as a potential cost-effective feedstock for production of bacterial cellulose J.Journal of chemical technology&biotechnology,2011,86(5):675-680.11 LIN C,FENG H,YANG X X,et al.Biotransformation of wheat straw to bacterial cellulose and its mechanism J.Bioresource technology,2013,135:464-468.12 HE F Q,YANG H M,ZENG L L,et al.Production and characterization of bacterial cellulose obtained by Gluconacetobacter xylinus utilizing the by-products from Baijiu production J.Bioprocess and Biosystems Engineering,2020,43(1):927-936.13 DUBEY S,SINGH J,SINGH R P.Biotransformation of sweet lime pulp waste into high-quality nanocellulose with an excellent productivity using Komagataeibacter europaeus SGP37 under static intermittent fed-batch cultivation J.Bioresource technology,2018,247:73-80.14 WU M,CHEN W,HU J,et al.Valorizing kitchen waste through bacterial cellulose production towards a more sustainable biorefinery J.The Science of the Total Environment,2019.DOI:10.101b/j.scitotenv.2019.133898.15 YE J B,ZHENG S S,ZHANG Z,et al.Bacterial cellulose production by Acetobacter xylinum ATCC 23767 using tobacco waste extract as culture medium J.Bioresource technology,2019,274:518-524.16 MOON S H,PARK J M,CHUN H Y,et al.Comparisons of physical properties of bacterial celluloses produced in different culture conditions using saccharified food wastes J.Biotechnology and Bioprocess Engineering,2006,11(1):26-31.17 KUROSUMI A,SASAKI C,YAMASHITA Y,et al.Utilization of various fruit juices as carbon source for production of bacterial cellulose by Acetobacter xylinum NBRC 13693 J.Carbohydrate Polymers,2009,76(2):333-335.18 CASTRO C,ZULUAGA R,PUTAUX J L,et al.Structural characterization of bacterial cellulose produced by Gluconacetobacter swingsii sp.from Colombian agroindustrial wastes J.Carbohydrate Polymers,2011,84(1):96-102.19 ADEBAYO-TAYO B,AKINTUNDE M,SANUSI J.Effect of different fruit juice media on bacterial cellulose production by acinetobacter sp.BAN1 and acetobacter pasteurianus PW1 J.J Adv Biol Biotechnol,2017,14(3):1-9.责任编辑：熊玉涛