荧光g-C3N4纳米片的制备及对半胱氨酸的检测.pdf

半胱氨酸是人体内一种重要的含巯基氨基酸，对其快速定量检测可以为某些疾病的诊断提供依据.该研究利用简单的超声剥离及静电自组装方法制备了 C3N4/Ag 荧光传感器.该荧光传感器对含巯基的半胱氨酸具有超灵敏的响应，对其检测极限可以低至 2.510-5mol/L.该研究为新型超灵敏荧光传感器的构建提供了一条新的途径，具有非常重要的理论价值和实践意义.关键词：g-C3N4；纳米片；制备；半胱氨酸；荧光检测中图分类号：R446.1文献标志码：A文章编号：1008-7974（2023）08-0009-06DOI：10.13877/22-1284.2023.08.002生物体内巯基化合物对于维持细胞氧化还原平衡和抵抗氧化应激具有重要的意义.生物体内巯基化合物的检测可以为某些疾病的诊断提供重要依据1.巯基化合物的检测方法主要有高效液相色谱法2、紫外可见光谱法3、电化学法4、毛细管电泳法5、质谱法6和共振散射光谱法7等.尽管这些方法可用于体外巯基化合物的检测，但操作复杂且成本较高，同时也不易于活细胞内目标分子的原位和实时监测.因此，设计合成用于细胞内特异性检测某种巯基化合物的荧光生物传感器，并用于定量检测，具有重要研究价值.石墨相氮化碳（g-C3N4）因其独特的类石墨层状堆积结构和 sp2杂化的-共辄电子能带结构、良好的化学及光学稳定性8-9，现已成为氮化碳材料研究的主流，主要应用于光催化剂10、环境污染控制11-12、能源13-14、生物传感器15等领域.g-C3N4中含有氮杂环结构，从而使其具有荧光性质，紫外光照射下，在 430550 nm 波长范围内会发出荧光16，特别是 g-C3N4细小纳米片或量子点，其荧光强度会更强，主要应用于制作荧光传感器方面.本研究将荧光 g-C3N4细小纳米片与 Ag 纳米颗粒的特性相结合，设计构建荧光探针，用于含巯基的半胱氨酸检测，操作简单且检测极限低.92023 年第 8 期学 报1实验部分1.1材料与试剂AgNO3（国药集团化学试剂有限公司），柠檬酸三钠（国药集团化学试剂有限公司），半胱氨酸（上海化学试剂站中心化工厂），硫脲（上海天莲精细化工有限公司），四氢呋喃（天津博迪化工股份有限公司），浓硫酸（上海博和精细化学品有限公司），酒精（天津博迪化工股份有限公司），实验所用药品均为分析纯.1.2实验仪器SHA-B 水浴恒温振荡器，KQ-250DB 型数控超声波清洗器，BS224S 电子天平，TGL16M型离心机，DHG-9101A 电热恒温鼓风干燥箱，超声波细胞粉碎机，陶瓷坩埚，马弗炉，DHG-9101-OA 电热恒温鼓风干燥箱，量筒（10 mL、100 mL），容量瓶，玻璃棒，磁力搅拌器，磁力搅拌子，瓶塞，一次性手套，标签，烧杯（50 mL）.JSM-7600F场发射扫描电镜（日本），Tu-1950紫外光谱仪，F-4600 荧光分光光度计，X 射线光电子能谱仪（ESCALAB 250Xi，赛默飞）.1.3g-C3N4的制备g-C3N4是在高温条件下缩聚得到，具体制备过程如下步骤：称取四份硫脲（每份 12 g）分别置于 4 个 50 mL 陶瓷坩埚中，加盖；将 4 个坩埚放置于马弗炉中央（炉膛初始温度应低于 60），马弗炉从室温以 10/min 的升温速率升至 550，保持在 550 温度条件下热处理硫脲 3 h；热处理结束后，缓慢打开炉膛，待炉膛温度冷却至 200 以下后，将坩埚取出；将得到的 4 个坩埚内的黄色固体合并到一起，用研钵研成细颗粒，得到样品；称取 1.001 1 g样品放入大烧杯中，加入浓硫酸，把样品覆没即可（此步的目的主要是为了使 g-C3N4的表面部分被氧化产生羧基和氨基，更好地与 Ag纳米颗粒表面的柠檬酸根通过氢键和静电作用力结合制备两者复合物，使得 g-C3N4的蓝色荧光更好地淬灭）；放到 KQ-250DB 型超声波清洗器中超声 4 h；加入 100 mL 去离子水，继续超声 2 h；用 TGL16M 离心机去离子水洗五次，以此把浓硫酸彻底洗净；之后再次转移到干净的大烧杯中，加入四氢呋喃和300400 mL去离子水，用超声波细胞粉碎机超声 1 h 进行剥离，得到片状 g-C3N4；接着用酒精洗三次，再用水洗三次，得到最后的产品 g-C3N4，烘干备用.1.4Ag 溶胶的制备称取 0.016 9 g AgNO3放入装有 100 mL 去离子水的烧杯中，然后移入三口烧瓶中，搭好回流装置，加热直至沸腾.称取 0.113 0 g 柠檬酸三钠置于烧杯中，加入 10 mL 去离子水，使其溶解成溶液.将配制好的柠檬酸三钠溶液慢慢地滴加到已经沸腾的 AgNO3溶液中，待溶液变为酒红色为止.1.5Ag 溶胶对 g-C3N4淬灭效果的检测分别取 8 只 5 mL 离心管，贴上标签，编号为0，1，2，3，4，7.在每个离心管内加入5 mgg-C3N4，0 号离心管加入 3 mL 去离子水，17 号离 心 管 分 别 加 入 3 mL 不 同 浓 度（310-5，610-5，910-5，2.110-4mol/L）的 Ag溶胶溶液，超声分散，静置 4 h，使其充分复合.先检测 0号离心管中样品的最大激发波长，然后在此最大激发波长下检测其淬灭效果.1.6对半胱氨酸（Cys）的检测分别取 11 只 5 mL 离心管，在每只离心管内加入等量的 Ag/g-C3N4复合物，然后再滴加入 相 同 体 积 不 同 浓 度 的 半 胱 氨 酸 溶 液（0，2.510-5，510-5，3.510-4mol/L），超声分散，静置 4 h 后，用荧光分光光度计检测其荧光.10王润霞，等：荧光g-C3N4纳米片的制备及对半胱氨酸的检测1.7表征分析扫描电镜图（SEM）是在加速电压为5.0 kV，利用 JSM-7600F 扫描电镜（日本）扫描所得.用 Tu-1950 紫外光谱仪测定了室温下样品的紫外吸收光谱.荧光光谱是样品在室温下放在日立石英试池（1 mm）采用 F-4600 荧光分光光度计记录所得.利用 Nexus-870 傅里叶红外光谱仪和 KBr 压片获得了红外光谱.用 X 射线光电子能谱仪（ESCALAB 250Xi，赛默飞）测定了样品的 X 射线光电子能谱（XPS）.2结果与讨论2.1g-C3N4、g-C3N4/Ag 溶 胶 复 合 物 的 扫 描电镜图图 1（a）是 g-C3N4的 SEM，图 1（b）为 g-C3N4/Ag 溶胶复合物的 SEM.从图 1（a）中可以看出，g-C3N4呈片状体形貌，厚度大约在 35 nm 左右.从图 1（b）中可以看出，当 g-C3N4复合 Ag溶胶粒子后，片状 g-C3N4表面出现 Ag 溶胶粒子，说明 Ag 溶胶颗粒已经较好地分散于片状g-C3N4表面，尺寸大约在 10 nm 左右.g-C3N4用浓硫酸处理，使其表面有羧基和氨基，而 Ag溶胶是通过柠檬酸三钠制备的，其表面有柠檬酸根离子，因此，g-C3N4与 Ag 溶胶通过氢键和静电作用力结合在一起.（a）g-C3N4（b）g-C3N4/Ag图 1扫描电镜图2.2红外光谱和 XPS图 2（a）为 g-C3N4与 g-C3N4/Ag 溶胶复合物的红外光谱.图中曲线 1 为 C3N4的红外光谱，曲线 2 为 g-C3N4/Ag 溶胶复合物的红外光谱，从图 2 可以看出，曲线 1 出现了 g-C3N4的特征峰，而曲线 2 也出现了 g-C3N4的特征峰，但是峰的强度有所下降，峰的位置有所偏移.这主要是由于Ag溶胶颗粒的引入，导致g-C3N4的振动吸收的偏移和下降，说明 Ag 溶胶颗粒与g-C3N4之间有某种作用力，使其结合在一起，从而导致 g-C3N4的振动吸收偏移和下降，这说明 Ag 溶胶颗粒与 g-C3N4之间有某种作用力将二者结合在一起，从而导致 g-C3N4的振动吸收偏移和下降.柠檬酸根的峰并未出现，可能是在复合物中含量较小造成的.图 2（b）为g-C3N4/Ag的XPS图.XPS图显示出285 eV、400 eV和 375 eV 三大主导峰.这主要是因为 C 1s、N 1s 和 Ag 3d 的存在，说明有 C、N 和 Ag 元素的作用.图 2（a）红外光谱 g-C3N4（1）、g-C3N4/Ag（2），（b）g-C3N4/Ag 的 XPS2.3g-C3N4的紫外光谱和荧光光谱图 3 为 g-C3N4的紫外可见光谱（曲线 1）和荧光光谱图（曲线 2）.从曲线 1 观察到两个紫外-可见吸收特征峰位于 310 nm 和 410 nm.在 112023 年第 8 期学 报310 nm 处的光吸收峰通常为碳核的*跃迁，在 410 nm 处观察到的峰是由n*跃迁和表面基团作用引起的.从曲线 2 可以看出，g-C3N4发射峰在 450 nm 处.插图（左）所示；所制备的 g-C3N4在日光下呈浅白色，插图（右）所示，在 365 nm 紫外光激发下，g-C3N4发射出较亮的蓝色荧光.这说明经过表面功能化和剥离制备的 g-C3N4可发出强的蓝色荧光.图 3g-C3N4的紫外-可见光谱（曲线 1）和荧光光谱（曲线2），插图为 g-C3N4在可见光灯和紫外光灯下的光学照片2.4g-C3N4的荧光光谱图图 4 是不同激发波长下 g-C3N4的荧光光谱图.从图 4 可看出，g-C3N4在不同激发波长下的发射峰位置不发生移动，表明其尺寸和表面较均匀.固定的发射波长还表明，所制备的 g-C3N4仅含有单一的发射波，有利于 g-C3N4在定量测定中的应用.通过图 4 可以看出，不同激发波长下的最大发射波长位置保持在450 nm.激发波长在 260340 nm 之间，荧光强度逐渐增强；激发波长在 340380 nm 之间，荧光强度逐渐减弱.这是由于 g-C3N4吸收特征频率的光子以后，可由基态跃迁至第一或第二电子激发态中各个不同振动能级和各个不同转动能级，降落至第一电子激发态的最低振动能级，然后再由这个最低振动能级以辐射弛豫的形式跃迁到基态中各个不同的振动能级，发出分子荧光.当 g-C3N4在 340 nm 处激发时，其荧光强度最强.所以，本研究在 g-C3N4的最大激发波长 340 nm 下，用 F-4600 荧光分光光度仪对半胱氨酸进行检测.图 4不同激发波长下 g-C3N4的荧光光谱2.5不同浓度的Ag溶胶对g-C3N4的淬灭效果图 5 显示在 C3N4最大激发波长 340 nm 下，相同浓度的 g-C3N4与不同浓度的 Ag 溶胶复合物的荧光光谱图.从图 5 可以看到，随着 Ag 溶胶浓度逐渐增大，波峰逐渐降低，直至强度几乎降为 0，也就是 g-C3N4的荧光强度随着 Ag溶胶浓度的逐渐增大而减弱，直至完全淬灭，说明 Ag 溶胶颗粒表面的柠檬酸根与 g-C3N4表面的羧基通过氢键和静电作用力吸附在g-C3N4的表面，从而使 g-C3N4荧光淬灭.Ag 溶胶的浓度 达 到 2.110-4mol/L 时，就 可 以 很 好 地 使g-C3N4荧光效果完全地淬灭.图 5不同浓度的银溶胶对 g-C3N4荧光的淬灭（Ag 纳米浓度：0，310-5，610-5，910-5，2.110-4mol/L，从上到下浓度依次增大）12王润霞，等：荧光g-C3N4纳米片的制备及对半胱氨酸的检测图6给出了Ag溶胶的紫外吸收谱和g-C3N4的荧光发射光谱，黑色曲线表示的是 Ag 纳米颗粒的紫外吸收曲线，红色曲线表示的是g-C3N4的荧光光谱曲线.从 Ag 溶胶颗粒紫外谱线可以看出，Ag 溶胶的最大吸收波长为 400 nm.从g-C3N4荧光发射光谱可以看出，g-C3N4的最大发射波长为 450 nm.Ag 溶胶的紫外吸收最大吸收波长与 g-C3N4的最大发射波长非常接近.正是由于 Ag 溶胶的吸收波长与 g-C3N4的发射波长发生部分重叠，导致了 g-C3N4的荧光淬灭.图 6Ag 溶胶的紫外光谱和 g-C3N4的荧光光谱2.6半胱氨酸（Cys）的检测图 7 显示对半胱氨酸的检测.从图 7（a）可以看到，g-C3N4被淬灭的荧光随着半胱氨酸浓度的增加而逐渐恢复.这是因为半胱氨酸中的巯基与金属有很强的络合作用，所以半胱氨酸与 Ag 溶胶颗粒通过络合作用使 Ag 溶胶颗粒脱离 g-C3N4的表面，从而使得 g-C3N4的荧光得到恢复.图 7（b）所示，随着半胱氨酸浓度的增加，荧光强度逐渐增强，当半胱氨酸的浓度达到 3.510-4mol/L 时，g-C3N4的荧光强度几乎达到最大，即当半胱氨酸浓度达到 3.510-4mol/L 时可以把 Ag 溶胶完全结合.结果表明，利用 g-C3N4/Ag 复合物溶液可实现对半胱氨酸的灵敏检测，检测限度小于2.510-5mol/L.图 7（a）在不同浓度的半胱氨酸存在下，g-C3N4/Ag 荧光光谱的变化（从下到上：0，2.510-5，510-5，3.510-4mol/L），（b）不同半胱氨酸浓度下相对荧光强度图3讨论与结论（1）通过氧化剂处理、超声波剥离制备了具有荧光性能的 C3N4细小纳米片，再利用静电自组装制备了 g-C3N4/Ag 复合荧光传感器，该传感器制备方法简单.（2）g-C3N4/Ag 复合荧光传感器对半胱氨酸 具 有 超 灵 敏 的 检 测，检 测 极 限 可 以 达 到2.510-5mol/L.（3）本研究为新型荧光探针的构建开辟了新的途径，在生物分子的检测方面具有巨大的应用潜力.参考文献：1ZHANG H，LIU R，JIE L，et al.A minimalistfluorescent probe for differentiating Cys，Hcy and GSH inlive cells J.Chem Sci，2016，7：256-260.2 路露，徐律，张鑫，等.Hg（2+）调控氮磷共掺 132023 年第 8 期学 报杂碳纳米点在半胱氨酸/同型半胱氨酸荧光检测中的应用 J.发光学报，2022，43（3）：440-452.3 SHANG Z X，PIRUTHIVI S，FANNING Z，et al.TRPC channel activation by extracellular thioredoxinJ.Nature，2008，451（1）：69-72.4 NEKRASSOVA O，LAWRENCE N S，COMPTONR G.Analytical determination of homocysteine：a reviewJ.Talanta，2003，60（3）：1085-1095.5 INOUE T，KIRCHHOFF J R.Determination of thiols by capillary electrophoresis with amperometric detection at a coenzyme pyrroloquinoline quinone modified electrode J.Anal Chem，2002，74（6）：1349-1354.6KASAI S，YOKOTA A，ZHOU H，et al.Immunoassay of the MRSA-related toxic protein，leukocidin，withscanning electrochemical microscopy J.Anal Chem，2000，72（23）：5761-5765.7SHAO N，JIN J Y，CHEUNG S M，et al.ASpiropyran-basedensembleforvisualrecognitionandquantification of cysteine and homocysteine at physiological levelsJ.Angew Chem Int Edit，2006，45（30）：4944-4948.8 TETER D M，HEMLEY R J.Low-compressibilitycarbon nitrides J.Science，1996，271（5245）：53-55.9MAEDA K，WANG X，NISHIHARA Y，et al.Photocatalytic activities of graphitic Carbon Nitride powderfor water reduction and oxidation under visible LightJ.JPhys Chem C，2009，113（12）：4940-4947.10WANG X C，MAEDA K，THOMAS A，et al.Ametal-free polymeric photocatalyst for hydrogen productionfrom water under visible light 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Medical College，Hefei 230601，China；2.Anhui Key Laboratory of Advanced Building Materials，Anhui Jianzhu University，Hefei 230601，China）Abstract：Cysteine is an important sulfhydryl amino acid in human body，and it is of great significancefor its rapid quantitative detection.In this study，C3N4/Ag fluorescence sensor was fabricated by simpleultrasonic stripping and electrostatic self-mounting.The fluorescence sensor has a super sensitive response to cysteine containing sulfhydryl，and the detection limit can be as low as 2.510-5mol/L.Thisstudy provides a new way for the construction of a new ultra-sensitive fluorescence sensor，which has veryimportant theoretical and practical significance.Keywords：g-C3N4；nanosheets；synthesis；Cysteine；fluorescence detect 14