IGY提纯与鉴定.doc

试 验 抗日本血吸虫卵黄抗体的制备与鉴定
材料与方法
1.1主要试剂
正辛酸 天津市弗晨化学试剂厂 批号200101（分析纯）
硫酸铵 天津市四通化工厂（分析纯）
3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB） Amresco批号T2007/10
二甲基亚砜（DMSO） 郑州化学试剂厂 批号20030224
十二烷基磺酸（SDS） 北京鼎国生物技术公司 Sigma进口分装 L5750
丙烯酰胺 沃德赛斯生物技术有限公司Sigma进口分装A8887
羊抗鸡IgY（FITC标记） Promega公司
低分子量标准蛋白质 中科院上海生物化学研究所
DAB Amresco C069
DTT Genview DH116-2
1.2 试剂的配制
1.2.1 提取蛋白用试剂的配制
（1）饱和硫酸铵溶液
(NH4)2SO4 760g，
蒸馏水（50～80℃） 1000mL
搅拌溶解20分钟，趁热过滤冷却后以浓氨水（NH3·H2O）调PH至7.0～7.4，配制好的饱和硫酸铵置4℃处置30 min以上，瓶底应有结晶析出，用时应置室温平衡后再用。
（2）醋酸缓冲液（0.06M,pH4.8）
醋酸钠 4.082g
冰乙酸 1.815g（约1.7 mL ）

1.2.1 ELISA用试剂
（1）包被液（0.05M pH9.6 碳酸钠缓冲液）
无水Na2CO3 1.59g
NaHCO3 2.93g 蒸馏水加至1000 mL
（2）洗涤液（0.01M pH7.4 磷酸盐缓冲液）PBST
NaCL 8.0g
KCL 0.2g
KH2PO4 0.2g
Na2HPO4•12H2O 2.9g
吐温-20 0.5mL 蒸馏水加至1000 mL
（3）封闭液（1% BSA－PBST）
牛血清白蛋白（BSA） 1g
洗涤液 PBST 100mL
（4）底物缓冲液（pH5.0 柠檬酸-磷酸缓冲液）
0.1M柠檬酸 (19.2g/L) 24.3mL
0.2M Na2HPO4 (28.4g/L) 25.7mL
蒸馏水 50mL
（5）TMB底物使用液
TMB储存液（100mg溶于
10mLDMSO,4℃保存） 100µL
底物缓冲液 10mL
30%H2O2 10µL （临用新鲜配制）
（6）终止液（2M H2SO4）
H2SO4（96%） 22.2mL
蒸馏水 177.8mL
1.2.3 SDS-PAGE电泳用试剂
(1)10%（w/v）SDS溶液
十二烷基硫酸钠（SDS） 10g
蒸馏水 100mL （室温保存）
(2)10%（w/v）过硫酸铵（AP）
过硫酸铵 1g
蒸馏水 10mL （临用前新鲜配制, 4℃保存＜1周）
（3）30%丙烯酰胺混合液
丙烯酰胺 29.2g
二甲基双丙烯酰胺 0.8g 蒸馏水定容至100mL，棕色瓶4℃贮存
（4）分离胶缓冲液（1.5M pH8.8Tris-HCl）
Tris 18.2g
少量蒸馏水溶解
HCl（1M） 调pH至8.8 蒸馏水定容至100mL，4℃贮存
（5）浓缩胶缓冲液（1.0M pH6.8Tris-HCl）
Tris 12.1g
少量蒸馏水溶解
HCl（1M） 调pH至6.8 蒸馏水定容至100mL，4℃贮存
（6） 2×LeammLi样品缓冲液
10%SDS 4 mL
甘油 2 mL
1.0M pH6.8Tris-HCl 2.8 mL
（7）电极缓冲液（10×）
Tris 30.3g
甘氨酸 144.2g
十二烷基硫酸钠（SDS） 10g 蒸馏水定容至1000mL，使用时10×稀释
（8）染色液（0.25%（w/v）考马斯亮蓝R-250酸甲醇水染液）
考马斯亮蓝R-250 1.25g
甲醇 227mL
冰醋酸 46mL
蒸馏水 227mL
（9） 脱色液（酸甲醇水脱色液）
甲醇 50mL
冰醋酸 75mL
蒸馏水 875mL
1.3 耗材及主要仪器
自动双重纯水蒸馏器 上海亚荣生化器厂SZ-93型
台式电子天平 北京赛多利斯Acculab
紫外可见分光光度计 UV-2102
倒置显微镜 日本Nikon
超声裂解仪 Cole-Parmer Instrument公司
自动酶联检测仪 Anhos Labtee Instruments Gmbh公司
台式离心机 北京医用离心机厂 LD5-2A型
96孔酶标板 江苏海门公司
垂直电泳槽 北京六一仪器厂
电泳仪（DYY-5） 北京六一仪器厂
手动可调式移液枪 大龙医疗设备（上海）有限公司
荧光显微镜 日本OLYMPUS
1.4 方法
1.4.1鸡群的免疫 已做过
1.4.2 检测鸡群卵黄抗体水平的间接 ELISA方法的建立[70][71][72][73]
间接ELISA程序按常规方法在96孔聚丙乙烯微量板上进行。以日本血吸虫可溶性抗原按一定稀释倍数包被板子；0.05%的PBS-Tween20（PBST）液洗涤6次，1min每次；1%的BSA-PBST封闭，洗涤同上；加入待测卵黄液样品，37℃孵育；同上洗涤后加入酶标记兔抗鸡IgG，37℃孵育；洗涤后加入新配制的四甲基联苯胺（TMB）底物溶液，室温显色；2M的H2SO4终止反应，酶标仪上测定各孔450nm处的吸光值（OD450nm）。
1.4.5.1 抗原最适包被稀释度的确定
将抗原用包被液（0.01M，pH9.6碳酸盐缓冲液）作1:50始倍比稀释包被酶标板，采集未免前鸡蛋为阴性卵黄作1:100 1:500 1:1000 1:2000稀释，四免后第15 d收集鸡蛋为阳性卵黄作1:1000 1:2000 1:4000 1:8000稀释，加入最佳工作浓度的酶标二抗，按间接ELISA方法进行，测定各孔OD450nm值 ，方阵法确定抗原最适包被浓度和抗体的最佳稀释度。
1.4.5.2 抗原最适包被时间和温度的确定
将稀释的C.baileyi可溶性抗原以不同的方式包被，分别以4℃过夜（≥10 h），37℃孵育2h、10h后，加入阴阳性血清，按间接ELISA方法测定。
1.4.5.3 特异性试验
阻断试验：将阳性鸡抗血吸虫卵黄液作1:100～1:1600稀释，每个稀释度加入等量稀释度的血吸虫可溶性抗原，37℃孵育阻断30min后，再进行ELISA测定，同时设相应对照，比较结果。
类属反应：对3份阳性鸡贝氏隐孢子虫卵黄样品按前述方法处理后进行ELISA测定，同步设血吸虫阳性卵黄、阴性卵黄作对照。
1.4.5.4 重复性试验
选择5份鸡抗血吸虫卵黄液样品在不同时间、相同条件下重复作ELISA测定，每个样品重复3次，比较试验结果。
1.4.5.5 试验样品的检测试验
分别采集实验组和对照组4免后第15 d卵黄样品各3份，用间接ELISA方法进行效价测定。
1.5 IgY抗体的收集纯化与测定
1.5.1 IgY抗体的分离纯化
1.5.1.1 IgY抗体的粗提
取免疫后所产高效价鸡蛋清洁消毒后，打破蛋壳，弃蛋壳、蛋清及卵黄衣膜，获得卵黄液（约10ｍL/枚）与灭菌单蒸水（D.W）按1：9稀释，充分搅拌混匀，调PH值至5.1～5.4，置4℃，6h以上或过夜，滤纸过滤上清，去除最上层漂浮的卵黄脂质后，离心10min（10,000rmin-1，4℃），弃沉淀，获取上清液，即为粗提的IgY抗体。
1.5.1.2 IgY抗体的体纯
参照相关文献[66][67][68]以酸化水稀释-盐析法，用不同的盐类和浓度收集纯化卵黄中的IgY抗体。卵黄的预处理同IgY抗体的粗体，以粗体的卵黄抗体进一步以盐析法纯化。设置五种盐析法提纯IgY抗体，方法如下：
方案1：水稀释一步硫酸铵盐析法，上述卵黄预处理上清，加入33%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS（0.01M,pH7.4）中，置常规处理过的透析袋中，流水透析过夜，次日以1：1000以上的PBS搅拌透析，3h左右换液一次，透析3d，获抗体蛋白，加入1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案2：水稀释二步硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入50%饱和硫酸铵，搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入33%饱和硫酸铵，同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置超滤管3500rpm离心25min，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案3：水稀释二步硫酸钠盐析法，上述预处理上清，加入19%硫酸钠（W/V），搅拌均匀，4℃作用2h以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，以适量体积的PBS溶解沉淀，加入14%硫酸钠（W/V），同上离心，获取沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案4：水稀释一步硫酸钠盐析法，上述预处理上清，加入19%硫酸钠（W/V），45℃水浴，充分搅拌2h左右，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
方案5：水稀释辛酸硫酸铵盐析法，上述预处理上清，加入3倍体积（0.06M,pH4.8）醋酸缓冲液，并调pH 值至4.5，上述处理的样品搅拌下缓慢加入正辛酸，30µL /ｍL样品，继续搅拌30 min以上，置4℃充分作用2h左右，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃沉淀，收集上清，10份上清加入1份PBS（0.02M,pH7.4），调pH 值至7.4，搅拌下加入33%饱和度的饱和硫酸铵溶液，继续搅拌30 min以上，离心（10,000rmin-1，4℃10min），弃上清，沉淀溶于原卵黄液体积的PBS中，置透析袋中，同上透析，获抗体蛋白，加1000U/ｍL的双抗，-20℃冷藏备用。
1.5.2 IgY抗体的纯度测定
用SDS-PAGE方法，比较不同盐析方法纯化抗体所达到的纯度。参照文献[61][69]分别配制8%分离胶，5%浓缩胶，装入电泳仪，浓缩胶电压40V，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到80V，染料前沿到达距分离胶底部1cm时关闭电源，置考马氏亮兰R-250染色液，室温染色4h或过夜，转至脱色液中脱色，至凝胶背底透明，蛋白条带清晰，判读结果并拍照后，置保存液4℃保存。
1.5.3 纯化IgY抗体的蛋白质浓度测定
紫外分光光度计测所提取IgY抗体的蛋白含量，计算各种提纯方法提取的蛋白含量。
1.6 IgY抗体的鉴定
1.6.1 IgY抗体的效价测定
收集卵黄从1：1000开始作倍比稀释，按建立的ELISA方法测定免疫不同时间的卵黄抗体效价。
1.6.2 IgY的SDS-PAGE分析
参照相关文献[61][69]进行，配制5%的浓缩胶，8%分离胶，装入电泳设备，加入不同方法提纯的IgY抗体样品、未提纯前样品、低分子标准蛋白样品以及鸡血清IgG作对照，起始压为80V，待样品前沿至分离胶时调电压为130V，电泳样品距胶底lcm处停止电泳，置室温下考马斯亮蓝R-250染色液，染色4 h或过夜，脱色液充分脱色，至呈现出清晰蛋白条带，判读结果并拍照后，置保存液4℃保存。

2. 结果与分析
2.1
2.3 ELISA检测方法
2.3.1 抗原、抗体最适包被稀释度
经反复冻融和超声波破碎获得的C.baileyi可溶性抗原，以紫外分光光度计测得蛋白质浓度为18.6mg..mL-1，

2.3.2 抗原最适包被温度和时间
37℃孵育2h、10h，加入底物系统后显色较差，结果判定不明显。4℃（≥10h）包被过夜后，阴性吸光值较低，可降低本底显色，减少假阳性率，结果显示更为准确、灵敏。因而选择4℃（≥10 h）包被过夜为最佳包被条件。

表4. 最适包被抗原、抗体的工作浓度选择
Tab.4 . The selection of coating dilution in ELISA
鸡卵黄液稀释度
dilution of yolk
抗原包被浓度（dilution of antigen）
1：50 1：100 1：200 1：400
1:100(－)
0.509
0.393
0.287
0.244
1:1000(＋)
1.010
0.963
0.917
0.897
1:500(－)
0.213
0.178
0.124
0.113
1:2000(＋)
0.942
0.885
0.830
0.802
1:1000(－)
0.159
0.129
0.098
0.079
1:4000(＋)
0.926
0.824
0.712
0.658
1:2000(－)
0.108
0.092
0.082
0.066
1:8000(＋)
0.822
0.701
0.602
0.497
表5. ELISA最佳包被时间的确定
Tab.5 . The selection of coating time in ELISA
稀释倍数(dilution of positive yolk)
1:500 1:1000 1:2000 1:16000 1:64000 1:512000
阴性对照1:500
Negative yolk(1:500)
4℃过夜
1.848
1.804
1.070
0.704
0.489
0.167
0.106
37℃孵育2h
0.770
0.542
0.437
0.418
0.411
0.432
0.387
37℃孵育10h
0.863
0.622
0.493
0.445
0.413
0.405
0.362
表6 卵黄不同处理方法的样品检测OD值
Table6. The OD value of the different processing to yolk sample
稀释倍数
1:500
1:1000
1:4000
1:16000
1:64000
1:512000
阴性(1:500)
PBS法
1.765
2.036
1.952
1.903
1.784
0.813
0.434
BSA-PBST法
1.681
1.963
1.926
1.749
1.421
0.674
0.105
D W 法
1.760
1.796
1.908
1.787
1.671
0.850
0.411
2.3.3 不同卵黄前处理对ELISA检测的影响
同一份收集的卵黄液样品，分别以PBS处理法、1% BSA-PBST处理法和D.W处理法，进行逐级倍比稀释，按ELISA方法测定OD450nm值。由表6可见PBS法、BSA-PBST与D.W法抗体检测结果没有明显的差异，但BSA-PBST法检测结果显色效果好，梯度明显，阴性吸光值较低。由于BSA-PBST法简单、省时，无须进行卵黄稀释4℃沉降，因此，在检测卵黄抗体水平时采用1% BSA-PBST溶液直接稀释待检卵黄液进行ELISA测定。
2.3.4 特异性试验测定结果
血吸虫可溶性抗原与将阳性卵黄液进行阻断试验时，各稀释度的阳性卵黄抗体效价明显降低，其OD值与阴性对照接近（见图7）；对3份阳性鸡法氏囊卵黄样品和3份鸡新城疫-传染性支气管炎卵黄样品ELISA检测结果均为阴性，表明该检测方法具特异性。

2.3.5 重复性试验
5份阳性鸡抗C.baileyi卵黄液样品在不同时间、相同条件下重复作ELISA测定结果见表7，由表可知批内变异系数为1.85%～10.49%，批间变异系数为3.22%～12.61%，说明本方法有良好的重复性。
2.3.6 试验样品的检测结果
用建立的间接ELISA方法分别检测实验组和对照组的卵黄样品抗体效价
2.4 鸡群的免疫效果（抗体曲线）
2.4.1免疫组卵黄抗体水平结果
从一免第15d开始采集各免疫组鸡只的血清和鸡蛋，每间隔15d采样一次，直至四免，以后间隔一周采样，应用间接ELISA方法检测免疫组的卵黄抗体水平。制表或图：卵黄抗体消长规律
2.5 卵黄抗体（IgY）抗体的鉴定
2.5.1 IgY抗体的纯化效果与回收率
以水稀释-盐析法纯化卵黄中的IgY抗体。SDS-PAGE进行分析纯化结果见图9①②。紫外分光光度计测定不同的方案提取IgY的浓度，方案1 8.21mg/mL卵黄液，方案2为9.44mg/mL，方案3为5.90mg/mL，方案4为4.78mg/mL，方案5为6.75mg/mL。
2.4.2 IgY抗体的SDS-PAGE分析结果
禽类的IgY与哺乳动物的IgG在分子结构上相似，IgY分子量约为180 kDa，由2条重链和2条轻链组成,其中重链(ν)为67～70kDa，轻链(h)为22～30kDa。本次实验获得的IgY抗体，经SDS-PAGE分离后，未提纯时呈现12条以上清晰蛋白条带，主要的有136KDa、74KDa、62KDa、49KDa和33KDa蛋白条带，应用5个方案提纯，均能获得较纯的抗体，经方案1、2、3、5提纯后的IgY抗体，主要有2条蛋白条带，即62KDa左右的重链，33KDa左右的轻链；经方案4提纯后的IgY抗体，2条蛋白条带则为62KDa左右的重链和26KDa左右的轻链。