新型溶瘤病毒HSV-1-ab-VISTA的构建及其抗肿瘤作用.pdf

米粒子生姜囊泡组均对人骨肉瘤HO S细胞具有较大的杀伤力,这是受金纳米粒子光热效应的影响.这些结果验证了该方法用于治疗骨肉瘤的可行性,为后续体内实验奠定了基础.基于生姜囊泡包被金纳米粒子的光热疗法作为一种新型肿瘤治疗方法,在生物医药领域具有巨大的应用前景.该方法的侵入性小、局部治疗、选择性高、疗效好等特点,解决了传统骨肉瘤治疗中创伤大、毒副作用大、疗效差等问题.同时,该方法具有通用性,适用范围广,可用于其他肿瘤的治疗.未来,我们将结合生姜囊泡结构特点,进一步设计合成功能化的生姜囊泡,构建具有靶向功能的治疗方案,以实现靶向治疗的可能.另外,我们也将结合其他治疗方法,构建多模式协同治疗策略,以进一步提高骨肉瘤治疗疗效.参考文献M a nF,M e n gC,L i uY,e t a l T h e s t u d yo f g i n g e r d e r i v e de x t r a c e l l u l a r v e s i c l e s a s an a t u r a l n a n o s c a l e d r u g c a r r i e r a n d t h e i r i n t e s t i n a l a b s o r p t i o ni nr a t sJ AA P SP h a r m S c iT e c h,():王威,毕文志骨肉瘤治疗现状与展望 J解放军医学院学报,():L i n d s e yBA,M a r k e l JE,K l e i n e r m a nES O s t e o s a r c o m aO v e r v i e wJ R h e u m a t o lT h e r,():H a nH,C h o iK A d v a n c e si nn a n o m a t e r i a l m e d i a t e dp h o t o t h e r m a l c a n c e rt h e r a p i e s:t o w a r dc l i n i c a la p p l i c a t i o n sJ B i o m e d i c i n e s,():L iX H,L o v e l l JF,Y o o nJY,e ta l C l i n i c a ld e v e l o p m e n ta n dp o t e n t i a l o fp h o t o t h e r m a la n dp h o t o d y n a m i ct h e r a p i e sf o rc a n c e rJ N a tR e vC l i nO n c o l,():Y a n gY,Z h e n gX,C h e nL,e t a l M u l t i f u n c t i o n a l g o l dn a n o p a r t i c l e s i nc a n c e rd i a g n o s i s a n d t r e a t m e n tJ I n t JN a n o m e d i c i n e,():S h k r y lY,T s y d e n e s h i e v aZ,D e g t y a r e n k oA,e ta l P l a n te x o s o m a l v e s i c l e s:p e r s p e c t i v e i n f o r m a t i o nn a n o c a r r i e r s i nb i o m e d i c i n eJ A p p lS c i,():U r z O,R a i m o n d oS,A l e s s a n d r oR E x t r a c e l l u l a rv e s i c l e s f r o mp l a n t s:c u r r e n t k n o w l e d g e a n do p e nq u e s t i o n sJ I n t JM o l S c i,():基础研究新型溶瘤病毒H S V a b V I S T A的构建及其抗肿瘤作用福建中医药大学附属福州市中医院肿瘤科(福州 )王欣林明星陈全文肖辉煌赵向前基金项目:福州市科技计划社会发展项目医疗项目(A F Z F Z S )福建医科大学附属福州儿童医院新生儿科;福建师范大学南方生物医学研究中心;通信作者,E m a i l:z x q f j n u c o m【摘要】目的探讨携带免疫检查点V I S TA抗体的溶瘤病毒H S V a b V I S TA在小鼠(C B L/J)移植瘤模型中的抗肿瘤效果.方法利用C R I P S R C a s 基因编辑技术制备携带V I S T A分子抗体的H S V a b V I S T A溶瘤病毒;琼脂糖凝胶电泳检测V I S T A抗体的基因组片段大小;蛋白免疫印迹法检测V I S T A抗体表达情况;构建小鼠移植瘤模型,游标卡尺测量溶瘤病毒治疗后瘤体大小的变化,且进行分析.结果成功构建了携带免疫检查点V I S TA抗体的溶瘤病毒H S V a b V I S T A,和野生病毒相比,病毒增殖和裂解癌细胞的能力没有差别,H S V a b V I S T A溶瘤病毒治疗显著缩小了小鼠的肿瘤大小.结论H S V a b V I S T A溶瘤病毒可抑制小鼠结直肠移植瘤的生长.【关键词】V I S TA;溶瘤病毒;H S V ;结直肠癌;C R I P S R C a s【中图分类号】R 【文献标识码】B【文章编号】()结直肠癌在我国的发病率和死亡率一直处于上升趋势,其中免疫抑制型的肿瘤微环境是结直肠癌发生发展的重要因素 .近年来,随着免疫检查点理论的出现,以程序性死亡蛋白及其配体和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白抗体为代表的抗体药物相继被用于肿瘤治疗,使得通过免疫疗法改善肿瘤微环境成为癌症治疗的主要趋势 .T细胞活化V域免疫球蛋白抑制因子(v d o m a i ni mm u n o g l o b u l i ns u p p r e s s o ro fTc e l l a c t i v a t i o n,V I S T A)是B 家族中的一员,近年被证明是一种免疫检查点分子,广泛表达于肿瘤微环境中的免疫细胞胞膜和胞浆中.研究表明,V I S TA分子不仅可以抑制C D 和C D 等淋巴细胞产生I L 和干扰素,还可以诱导原始T淋巴细胞转变成T r e g s而抑制肿瘤浸润淋巴细胞功能.因此,阻断V I S T A信号通路有望通过解除肿瘤局部免疫抑制细胞的功能而增强肿瘤治疗效果.近年来,以H S V 为骨架的溶瘤病毒已成为新兴的肿瘤免疫治疗方向 .溶瘤病毒疗法联合免疫检查点也已成为极具吸引力的肿瘤治疗手段.本研究旨在通过构建携带V I S T A抗体的溶瘤病毒H S V a b V I S TA,探讨其抗肿瘤效果.材料与方法 材 料:结 直 肠 癌 细 胞(MC )、非 洲 绿 猴 肾 细 胞(V e r o)和肾上皮细胞(T)(购自上海中科院细胞库);C B L/J小鼠周龄,雄性,S P F级,购自上海斯莱克实验动物 有限 公 司,实 验动 物 生 产 许 可 证 号S C X K(沪),质量合格证号 ;H I S抗 体(A B c l o n a l公司);P B S溶液,胰蛋白酶溶液(G i b i c o公司);牛血清(生工生物工程股份有限公司);DMEM培养福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o 基(G i b i c o公司);P B S溶液(北京全式金生物技术有限公司);DM S O(S i g m a公司).方法:重组病毒制备:将g的V I S TA抗体同源重组片段稳转到H S V 病毒的I C P 敲除载体 T工具细胞中,h后添加野生型H S V .细胞病变后,挑取绿色噬斑,反复感染V e r o细胞,即可得到重组H S V E G F P和H S V a b V I S T A溶瘤病毒.病毒滴度检测:将病毒上清收集,以倍浓度稀释并感染V e r o细胞,h后荧光显微镜下检测最后一个稀释倍数形成单个荧光噬斑的数量.病毒滴度(P F U/m L)平均荧光噬斑数量/稀释倍数/病毒体积.溶瘤病毒表达量和裂解癌细胞的能力检测:溶瘤病毒感染小鼠结肠癌细胞MC ,h后按照基因组提取试剂盒提 取 细 胞 基 因 组,P C R扩 增,琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 分 离V I S T A片段;细胞培养皿中加入 L含蛋白酶抑制剂的R I P A细胞裂解液,提取蛋白,取 g蛋白样品跑胶、转膜、封闭,加抗H I S一抗 孵育过夜;加荧光二抗室温孵育h;应用O d y s s e y双色红外激光成像仪观察成像;以不同滴度的病毒感染MC 细胞,h后计算细胞增值形况.细胞存活率()溶瘤病毒处理后细胞数量/空白对照细胞数量 .移植瘤小鼠模型建立及分组给药:培养MC 细胞,取对数生长期的MC 细胞,离心、富集,P B S重悬细胞后按 个细胞接种于每只C B L/J小鼠的背部皮下,大约 d后可见约 mm大小的瘤块.小鼠随机分组,对照组及荷瘤小鼠分为组各只小鼠,分别为P B S对照组、H S V E G F P组、H S V a b V I S T A E G F P(H S V a b V I S T A)组.各组分别瘤内注射P B S、H S V E G F P(P F U)、H S V a b V I S T A(P F U),每隔天治疗次.肿瘤大小和小鼠体质量测量:每隔周用游标卡尺测量肿瘤长、宽、高和对小鼠进行称重,以/长宽高计算瘤的体积.统计学方法:实验数据以G r a p h P a dP r i s m统计软件进行处理.计量资料采用均数标准差表示,组间比较采用单因素方差分析,P 为差异有统计学意义.结果 重组溶瘤病毒的构建:本研究采用基因编辑技术对H S V 的I C P 基 因 造 成 基 因 插 入 缺 失,同 时 将 表 达V I S T A抗体序列和表达绿色荧光蛋白E G F P的序列插入该位点.因此,重组病毒会带有绿色荧光(图 A).将携带V I S T A抗体 同 源 重 组 片 段 的a b V I S TA E G F P和 野 生 型H S V 共转I C P 敲除载体 T工具细胞,h后取细胞培养上清液感染V e r o细胞.结果显示,细胞中有明显的绿色荧光出现,且随着每一次的纯化,重组溶瘤病毒的荧光噬斑越来越纯,表明a b V I S TA基因序列成功整合到H S V 病毒基因组中(图 B).溶瘤病毒的分子验证:将构建好的重组溶瘤病毒感染 T细胞,h后提取细胞基因组,进行P C R验证.结果显示,H S V a b V I S T A病毒感染的细胞中存在外源重组a b V I S TA片段,证实外源基因整合到了H S V 病毒基因注:A为溶瘤病毒构建原理图;B为细胞病变后,挑取绿色噬斑,反复感染V e r o细胞次荧光图.图重组溶瘤病毒构建示意图组中(图 A).为了探究H S V a b V I S TA感染宿主细胞后V I S TA抗体的表达,我们检测了细胞中H I S标签抗体的表达.H S V a b V I S T A溶瘤病毒中在V I S T A抗体序列后融合了个H I St a g,以便后续检测.通过W e s t e r nb l o t检测,我们发现H S V a b V I S T A感染宿主细胞后H I S表达,且条带大小与 预期 相符,表 明V I S T A抗 体成 功 表达(图 B).注:A为溶瘤病毒感染细胞,P C R扩增细胞基因组,琼脂糖凝胶观 察a b V I S T A片 段 大 小;B为 溶 瘤 病 毒 感 染 细 胞,W e s t e r nb l o t检测a b V I S T A蛋白表达情况.图重组溶瘤病表达的电泳图谱 溶瘤病毒增值和裂解细胞的能力检测:为了进一步确定H S V a b V I S TA溶瘤病毒的增殖特性,溶瘤病毒感染V e r o和MC 细胞,检测病毒的增殖和细胞的裂解能力.结果表明,溶瘤病毒H S V a b V I S TA和H S V E G F P增殖能力相同(表).接着,我们以不同感染复数(MO I)感染结肠癌MC 细胞,检测H S V a b V I S TA溶瘤病毒对肿瘤细胞裂解的能力,发现其对肿瘤细胞的裂解能力没有明显差异(表).福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n ,V o l ,N o 表重组溶瘤病毒增殖的变化(P F U/m L,xs)组别 h h hH S V E G F P组 H S V a b V I S TA组 表MC 细胞存活率(,xs)组别MO I MO I MO I H S V E G F P组 H S V a b V I S TA组 小鼠肿瘤体积的变化:小鼠背部皮下注射MC 细胞,d后形成肿瘤.经重组溶瘤病毒治疗后肿瘤大小出现明显变化.相对于P B S组,重组溶瘤病毒可以显著抑制小鼠肿瘤的生长(表).此外,治疗后小鼠体质量没有明显变化(表),说明溶瘤病毒治疗后没有明显的毒副作用.表 重组溶瘤病毒对小鼠肿瘤的生长的影响(m m,xs)组别第周第周第周P B S组 H S V E G F P组 H S V a b V I S TA组 注:与对照组比较,P ,P .表重组溶瘤病毒对小鼠体质量的影响(g,xs)组别第周第周第周P B S组 H S V E G F P组 H S V a b V I S TA组 讨论肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗的重要方向.与此同时,V I S T A分子作为免疫检查点分子,既是肿瘤微环境中多种免疫细胞的配体,又是受体,在肿瘤微环境中起着显著的免疫负调控的功能.因此,阻断V I S T A信号通路有望通过解除肿瘤局部免疫抑制细胞的功能而增强肿瘤治疗效果.与此同时,H S V 溶瘤病毒通过选择性感染并杀伤肿瘤细胞及诱导和增强 机体 抗肿 瘤 免疫 双重 功能 可 控制 或清 除 体 内 肿瘤,尤其是不适合手术和放化疗治疗的晚期肿瘤患者.溶瘤病毒疗法联合免疫激活已成为极具吸引力的肿瘤治疗手段.本研究通过C R I S P R C a s 技术,将V I S TA抗体整合到H S V 溶瘤病毒基因组中,制备了重组溶瘤病毒H S V a b V I S TA.细胞水平的研究结果显示,H S V a b V I S T A溶瘤病毒对结直肠癌MC 细胞产生显著的裂解能力,表明外源基因V I S T A抗体的插入不影响溶瘤病毒的增殖.此外,在小鼠结直肠癌模型中,重组溶瘤病毒H S V a b V I S TA不仅可以显著抑制小鼠肿瘤的生长,而且拥有很高的安全性,进一步证实了H S V a b V I S TA溶瘤病毒的抗肿瘤治疗价值.综上所述,重组溶瘤病毒H S V a b V I S T A治疗小鼠结直肠癌是一种非常有效的治疗手段,为临床中晚期癌症患者的治疗提供了一种新的思路.参考文献J o h d iN A,S u k o rNF C o l o r e c t a lc a n c e r i mm u n o t h e r a p y:o p t i o n sa n ds t r a t e g i e sJ F r o n t I mm u n o l,:B i l l e rL H,S c h r a gD D i a g n o s i sa n dt r e a t m e n to fm e t a s t a t i cc o l o r e c t a lc a n c e r:ar e v i e wJ J AMA,():K i mJW,L e e I J E x p l o r i n g t h em y t h i c a l a b s c o p a l e f f e c t:r a d i a t i o n a n d P D b l o c k a d ef o r h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m aJC l i n i c a l a n dM o l e c u l a rH e p a t o l o g y,():K o n d oY,O h n oT,N i s h i iN,e ta l D i f f e r e n t i a l c o n t r i b u t i o no ft h r e e i mm u n ec h e c k p o i n t(V I S T A,C T L A ,P D )p a t h w a y st oa n t i t u m o rr e s p o n s e sa g a i n s ts q u a m o u sc e l lc a r c i n o m aJO r a lO n c o l o g y,:L o u i s eL,E i r i n i P,J u s t i nM,e t a l V I S T Ai s a n i mm u n e c h e c k p o i n tm o l e c u l e f o rh u m a nTc e l l sJ C a n c e rr e s e a r c h,():T a t s u k u n iO,C h e n y a n gZ,Y u t aK,e ta l T h e i mm u n ec h e c k p o i n tm o l e c u l eV I S T Ar e g u l a t e sa l l e r g e n s p e c i f i cT h m e d i a t e di mm u n er e s p o n s e sJ I n t e r n a t i o n a lI mm u n o l o g y,():M a c e d oN,M i l l e rD M,H a qR,e t a l C l i n i c a l l a n d s c a p eo fo n c o l y t i cv i r u sr e s e a r c hi n J J o u r n a l f o rI mm u n o t h e r a p yo fC a n c e r,():e K a u f m a nHL,K o h l h a p pFJ,Z l o z aA O n c o l y t i c v i r u s e s:an e wc l a s so fi mm u n o t h e r a p y d r u g sJN a t R e v D r u g D i s c o v,():L a w l e rSE,S p e r a n z aMC,C h oCF,e t a l O n c o l y t i c v i r u s e s i nc a n c e r t r e a t m e n t:a r e v i e wJ J AMAo n c o l o g y,():N o w a kEC,L i n e sJL,V a r nFS,e ta l I mm u n o r e g u l a t o r yf u n c t i o n so f V I S T AJ I mm u n o l R e v,():T i a nY,X i eD,Y a n gL E n g i n e e r i n gs t r a t e g i e s t oe n h a n c eo n c o l y t i cv i r u s e si nc a n c e ri mm u n o t h e r a p yJ S i g n a lT r a n s d u c tT a r g e tT h e r,():福建医药杂志 年月第 卷第期F u j i a nM e dJ,J u n e ,V o l ,N o