小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证.pdf

Vol.43 No.7 Jul.2023上海交通大学学报（医学版）JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证吴其谦，胡燕琴，陈迦勒，李牧辰，赵有淦，伍静文上海交通大学医学院组织胚胎学与遗传发育学系，上海市生殖医学重点实验室，上海 200025摘要 目的构建野生型（wild type，WT）小鼠和miR-34b/c/且miR-449/双敲除（double knockout，dKO）小鼠输卵管上皮类器官的培养体系，并进行表型验证。方法利用酶消化法和差速贴壁法分离纯化WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮细胞，并利用免疫荧光法鉴定得到的输卵管上皮细胞的纯度；通过计数和直径测量比较WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官数量、生长速度和生长大小；利用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，H-E）染色和透射电子显微镜（透射电镜）对输卵管上皮类器官进行形态和结构观察；采用免疫荧光法观察并统计纤毛细胞和分泌细胞在WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官中的比例；采用免疫组织化学法、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western blotting检测分泌细胞、纤毛细胞相关基因在输卵管上皮类器官中的表达。结果分离纯化得到的输卵管上皮细胞纯度较高。与WT小鼠相比，dKO小鼠输卵管上皮类器官生长更快，体积更大，数量也更多；但dKO小鼠输卵管上皮类器官发育较慢，于培养28 d时才出现上皮内陷，而WT小鼠的类器官于培养16 d时已经出现。H-E染色和透射电镜结果显示输卵管上皮类器官呈现出与在体输卵管类似的结构。免疫荧光检测显示dKO小鼠输卵管上皮类器官的纤毛细胞显著减少而分泌细胞显著增多（均P0.05）。免疫组织化学法检测结果显示，dKO小鼠输卵管上皮类器官的分子表达模式与在体输卵管组织基本一致，即纤毛细胞标志物乙酰化微管蛋白（Ac-tubulin）、叉头框J1（forkhead box J1，FOXJ1）表达减少，分泌细胞标志物配对盒8（paired box 8，PAX8）表达增加；RT-qPCR结果显示dKO小鼠输卵管上皮类器官中Foxj1和微管蛋白4A（tubulin class a，Tubb4a）的mRNA水平均降低（均P0.05），而Pax8 mRNA水平升高（P0.05）；Western blotting结果显示，dKO小鼠类器官中FOXJ1的蛋白表达水平显著降低，PAX8表达显著升高（均P0.05）。结论研究成功构建WT小鼠和dKO小鼠的输卵管上皮类器官培养体系，该体系可模拟小鼠在体输卵管的表型。关键词类器官；输卵管；上皮细胞；miR-34；miR-449；基因敲除DOI10.3969/j.issn.1674-8115.2023.07.007 中图分类号R-332；Q492.5 文献标志码AEstablishment and phenotype verification of mouse oviductal epithelial organoidsWU Qiqian,HU Yanqin,CHEN Jiale,LI Muchen,ZHAO Yougan,WU JingwenDepartment of Histoembryology,Genetics and Developmental Biology,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine;Shanghai Key Laboratory of Reproductive Medicine,Shanghai 200025,ChinaAbstract Objective To establish a culture system of oviductal epithelial organoids from wild type(WT)mice and miR-34b/c/and miR-449/double knockout(dKO)mice,and verify the phenotypes.Methods The oviduct epithelial cells of WT mice and dKO mice were isolated and purified by enzyme digestion and differential adhesion method,and the purity of the isolated oviduct epithelial cells was identified by immunofluorescence staining.The numbers,growth rates and sizes of oviductal epithelial organoids between WT mice and dKO mice were compared by counting and diameter measurement.Hematoxylin-eosin(H-E)staining and transmission electron microscope(TEM)were used to observe the morphology and structure of the oviductal epithelial organoids.The proportions of ciliated cells and secretory cells in the oviductal epithelial organoids from WT mice and dKO mice were observed and counted by immunofluorescence staining.Immunohistochemistry(IHC),real-time quantitative PCR(RT-qPCR)and Western blotting were used to observe the expression levels of marker genes of ciliated cells and secretory cells in the oviductal epithelial organoids.Results The purity of the isolated and purified oviduct epithelial cells was high.Compared with the organoids from WT mice,the oviductal epithelial organoids from dKO mice grew faster and larger,and were more in number.But they developed more slowly than those from WT mice,as the invaginations of the dKO mice organoids appeared on the 28th day of culture,while the WT mice organoids exhibited the same structures on the 16th day.The oviductal epithelial organoids showed similar structures as those of the oviduct in vivo under hematoxylin-eosin(H-E)staining and TEM.Immunofluorescence staining 论著 基础研究基金项目 国家自然科学基金（81671509）。作者简介 吴其谦（1998），男，硕士生；电子信箱：。通信作者 伍静文，电子信箱：。Funding Information National Natural Science Foundation of China(81671509).Corresponding Author WU Jingwen,E-mail:.848吴其谦，等小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）showed that the ciliated cells of oviductal epithelial organoids from dKO mice were significantly reduced and the secretory cells were significantly increased(both P0.05).IHC showed that the molecular expression patterns of the oviductal epithelial organoids were consistent with those of the oviducts in vivo,i.e.the expression levels of ciliated cell markers acetylated-tubulin(Ac-tubulin)and forkhead box J1(FOXJ1)decreased,and the expression level of the secretory cell marker paired box 8(PAX8)increased.RT-qPCR showed that the mRNA levels of Foxj1 and tubulin class a(Tubb4a)decreased(both P0.05),while Pax8 increased in the oviductal epithelial organoids of dKO mice(P0.05).Western blotting results showed that the protein expression level of FOXJ1 in the organoids of dKO mice significantly decreased,while the expression of PAX8 significantly increased(both P0.05).Conclusion The culture system of oviductal epithelial organoids of WT mice and dKO mice are successfully constructed,which can simulate the phenotypes of mouse oviduct in vivo.Key words organoid;oviduct;epithelial cell;miR-34;miR-449;gene knockout输卵管是女性生殖系统中重要的器官，连接卵巢和子宫；自卵巢向子宫方向，小鼠输卵管可分为4个区域，依次为漏斗部（在人体称为伞部）、壶腹部、峡部和输卵管子宫连接处1。输卵管的管壁包括上皮组织、结缔组织和平滑肌。输卵管上皮分泌细胞产生的输卵管液、纤毛细胞的摆动，以及管壁平滑肌的运动为受精、配子和早期胚胎运输、早期胚胎发育提供必要的支持2-3。目前对于输卵管的研究大多利用动物模型、二维细胞培养技术以及气液交界（air-liquid interface，ALI）培养系统4，但均存在较大的局限性。如动物模型周期长，二维细胞培养技术无法模拟在体输卵管各类细胞分化的微环境以及细胞间的相互作用5等。而ALI培养系统最初主要用于体外模拟气道上皮的培养研究，目前也被证明可用于支持其他类型上皮的培养来模拟在体细胞的功能和分化，比如肠道上皮6和女性生殖道上皮7-9。但由于该方法接种培养需要大量的细胞，因此主要应用于大型动物模型输卵管上皮的培养，例如猪10、牛11、猴12等；而小鼠体型小，可获得输卵管上皮细胞数量有限，因此一次培养需要大量小鼠。此外，与体内情况相比，ALI培养系统的细胞在细胞群体组成、细胞周期和增殖，以及免疫能力方面显示出一定的差异13。是否有更符合生理条件的体外培养系统？近年来，类器官培养技术的建立为小鼠及其他动物模型的输卵管结构和功能的研究提供了方便、可靠的途径14。类器官是由来自哺乳动物器官或组织的多能干细胞或成体干细胞产生的具有类似在体显微结构的三维体外培养细胞簇15。类器官是一种三维培养细胞的体系，能够模拟器官组成、功能和发育特征，比二维培养的细胞培养系统更符合生理条件。类器官的一个关键特征是它们比哺乳动物模型更易于实验，这有助于更深入地理解器官发生、疾病机制的探讨、药物的筛选等16-17。目前已经建立了10余种人类组织来源的正常或肿瘤类器官生物样本库，包括结直肠、肾脏、大脑、肝脏、胰腺、胃、视网膜、肺、前列腺、乳腺等18。关于输卵管上皮类器官培养的建立，最早见于KESSLER等19的研究，该研究建立了长期、稳定的三维人输卵管上皮类器官培养体系，表明输卵管上皮成体干细胞在体外可以产生分化的类器官，其中包含纤毛细胞和分泌细胞。随后，XIE等20也建立了小鼠输卵管上皮类器官的培养体系，验证了类器官培养的长期可持续性以及可以模拟小鼠输卵管上皮细胞的增殖和分化。但利用体外输卵管上皮培养的类器官是否能模拟异常或疾病状态下在体输卵管的结构、功能及表型目前未见报道。本实验室21及其他研究团队22的前期研究工作发现 miR-34b/c/和 miR-449a/b/c/双敲除（double knockout，dKO）雌性小鼠不孕，表现为输卵管上皮纤毛细胞显著减少，但排卵及激素水平正常。miR-34b、miR-34c、miR-449a、miR-449b、miR-449c 是miR-34/449家族成员，具有高度种属保守性。其中小鼠 miR-449a/b/c（统称 miR-449），是从 13 号染色体上一段1 642 bp的序列转录加工而来；小鼠miR-34b/c是从9号染色体上一段612 bp的序列转录加工而来。miR-34b/c、miR-449具有共同的种子序列，可结合在相同靶基因mRNA的3 非翻译区（3 UTR），调控靶基因的表达，发挥转录后调控作用，功能之间可以相互代偿，所以需要同时敲除miR-34b/c和miR-449才可观察到异常表型23-24。dKO雌鼠由于输卵管上皮纤毛细胞减少导致拾卵障碍而不孕，这是否与输卵管上皮纤毛细胞分化障碍有关，其中机制值得探讨。但是利用动物模型在体研究关键分子在输卵管上皮细胞分化中的分子机制存在着较大的局限性，而选择类器官培养系统作为工具将为研究带来便利。这首先需要构建野生型（wild type，WT）小鼠与dKO小鼠输卵8492023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)管上皮类器官培养系统，并进行表型验证，从而为进一步研究miR-34b/c和miR-449在输卵管上皮纤毛细胞分化中的机制打下基础。基于此，本研究根据文献报道，结合自身实验条件，成功构建了WT小鼠与dKO小鼠输卵管上皮类器官培养模型，并验证了dKO小鼠输卵管上皮来源的类器官可模拟 dKO 小鼠在体输卵管的表型。因此，本研究不仅可为探讨miR-34b/c和miR-449在输卵管上皮纤毛细胞分化中的作用机制打下基础，也可为研究其他关键分子在输卵管上皮细胞增殖和分化中的作用和机制提供良好的体外研究模型。1材料与方法1.1材料1.1.1实验动物雌性3周龄WT小鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2018-0003。miR-34/449 dKO 小 鼠 由miR-34b/c+/且 miR-449/小鼠交配繁殖而得，miR-34b/c+/且miR-449/小鼠由本实验室培育鉴定并保存。实验小鼠品系均为C57BL/6J，饲养于上海交通大学医学院实验动物科学部，实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2018-0027。所用实验小鼠均为SPF级。1.1.2主要试剂和仪器Matrigel无乳糖脱氢酶增高病毒低生长因子基质胶（Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix，LDEV-Free）购自美国 Corning 公司，胶原蛋白水解酶、DMEM/F12培养基、改进型DMEM/F12培养基、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、谷氨酰胺、B27培养添加剂、青霉素-链霉素、细胞恢复液、0.25%胰蛋白酶-EDTA购自美国Gibco公司，胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国 Hyclone 公司，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、脱氧核酸酶（DNase）、rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（rho-associated coiled-coil forming kinase，ROCK）抑制剂 Y-27632、Triton X-100、抗乙酰化微管蛋白（acetylated-tubulin，Ac-tubulin）抗体（T6793）购自美国 Sigma 公司，人Noggin（hNoggin）重组蛋白、R-脊椎蛋白 1（R-spondin1）重 组 蛋 白 购 自 加 拿 大 StemCell Technologies公司，无翅型MMTV整合位点家族成员3A（wingless-type MMTV integration site family，member 3A，Wnt3a）、小鼠成纤维细胞生长因子 10（mouse fibroblast growth factor 10，mFGF10）、人表皮生长因子（human epidermal growth factor，hEGF）购自美国Peprotech公司，选择性-分泌酶抑制剂二苯并氮（dibenzazepine，DBZ）、转化生长因子受体 1 激酶抑制剂（TGFBR1 kinase inhibitor）购自美国 MedChem Express 公司，2Heiff PCR Master Mix（含染料）、过氧化物酶标记驴抗兔IgG（H+L）（34201ES60）、过氧化物酶标记驴抗小鼠IgG（H+L）（34101ES60）、Alexa Fluor 488 标记山羊抗小鼠 IgG（H+L）（33206ES60）、Alexa Fluor 594标记山羊抗兔IgG（H+L）（33112ES60）购自翌圣生物科技（上海）股 份 有 限 公 司，PrimeScript RT Master Mix、TB Green Premix Ex Taq 购自日本TaKaRa公司，RIPA裂 解 液、蛋 白 酶 抑 制 剂 购 自 美 国 Thermo Fisher Scientific公司，抗配对盒8（paired box 8，PAX8）抗体（10336-1-AP）购自中国Proteintech公司，抗平滑肌肌动蛋白2（smooth muscle actin 2，ACTA2）抗体（ab124964）、抗 波 形 蛋 白（vimentin）抗 体（ab92547）购 自 美 国 Abcam 公 司，抗 叉 头 框 J1（forkhead box J1，FOXJ1）抗体（14-9965-82）购自美 国 Invitrogen 公 司，抗 甘 油 醛-3-磷 酸 脱 氢 酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体（5174）购自美国 CST公司。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。梯 度 PCR 仪（X50s；德 国 Eppendorf），NanoDrop 紫外分光光度计（2000C；美国 Thermo Fisher Scientific），化 学 发 光 凝 胶 成 像 系 统（4000mini；美国 GE），荧光显微镜（BX53；日本Nikon），Applied Biosystems实时荧光定量 PCR系统（7500；美国 ABI），透射电子显微镜（透射电镜）（H-7650；日本日立）。1.2方法1.2.1小鼠基因型鉴定提取小鼠鼠尾 DNA，用PCR 方法检测基因型。PCR 引物序列如下。miR-34bc-KO-F2：5-GCGGCCGCATAACTTCGTAT-3；miR-34bc-Com-L2：5-GAGATTTTCGTGGCGCTTTA-3；miR-34bc-WT-U2：5-GCCTCCTGTGAATCGTCATT-3。PCR 反应体系（20 L）：10 L 2Heiff PCR Master Mix、0.5 L引物miR-34bc-KO-F2、0.5 L引物 miR-34bc-WT-U2、1 L 引 物 miR-34bc-Com-L2，补双蒸水至 20 L。PCR 反应程序为：95 预变性850吴其谦，等小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）2 min；95 变性 30 s，56 退火 30 s，72 延伸30 s，33个循环；72 10 min。配置1.5%琼脂糖凝胶用于PCR产物电泳。1.2.2小鼠输卵管类器官的培养解剖小鼠，取出输卵管，置于磷酸盐缓冲液（PBS，含1%青霉素和链霉素）中，将脂肪剥离干净。用消毒灭菌的剪刀将输卵管在EP管中剪碎成浆糊状后，加入预热的消化液（Hank s 溶液+5 mg/mL 胶原蛋白水解酶+5 U DNase+双抗），并置于 37 金属浴中振荡消化120 min（期间每隔30 min取出将组织吹散）。待消化完全后加入培养基（DMEM/F12+10%FBS+双抗）终止消化，200g离心 5 min，弃去消化液后用培养基重复洗涤2次，重悬于2 mL培养基中。将输卵管细胞悬液加入培养皿中于37，5%CO2的培养箱中培养1 h。然后吸取培养基，200g离心5 min，弃上清液；用培养基重悬细胞并计数，每1104个细胞加入50 L 基 质 胶 于 24 孔 细 胞 培 养 皿 中，在 37 、5%CO2的培养箱中培养30 min后加入500 L输卵管类器官完全培养基。输卵管类器官完全培养基成分：改进型DMEM/F12培养基、谷氨酰胺添加剂2 mmol/L、HEPES 缓冲液 10 mmol/L、双抗 100 U/mL、1B27 添加剂、hEGF 100 ng/mL、mFGF 100 ng/mL、hNoggin 100 ng/mL、R-spondin1 0.6 g/mL、Wnt3a 100 ng/mL、TGFBR1 kinase inhibitor 0.5 mol/L。类器官种植和传代后另外添加Y-27632 10 mol/L。1.2.3输卵管类器官传代将培养孔中的培养基沿管壁吸取干净，避免破坏基质胶；向孔中加入1 mL预冷PBS（无钙镁），轻轻摇晃后吸出。再向孔中加入1 mL预冷细胞恢复液，4 下孵育3060 min。用预先湿润的1 mL枪头在孔中轻轻吹打，然后将类器官转移到15 mL离心管中，4 70g离心5 min，弃上清液；加入预冷的 DMEM/F12培养液 10 mL 重悬沉淀，轻柔吹打洗涤；4 200g离心5 min，弃上清液。然后以1 2传代，即用25 L类器官完全培养基重悬类器官沉淀，加入75 L基质胶，轻轻吹打混匀避免产生气泡，以每孔50 L种在24孔板中，将24孔板放入培养箱中孵育30 min后取出，再向每孔加入500 L类器官完全培养基，置入培养箱中继续培养。1.2.4免疫荧光检测进行类器官传代的同时，回收 部 分 类 器 官 于 1.5 mL EP 试 管 中，250g 离 心5 min，弃去多余的上清液。加入适量 4%多聚甲醛于摇床上固定 1 h。250g 离心 5 min 后，弃去多聚甲醛。用预冷的 PBS 缓冲液洗涤 3 次，每次 5 min。250g 离心 5 min，弃去 PBS。将类器官沉淀吸出加到冰冻切片的包埋模具中，加入冷冻包埋剂（OCT）放入液氮中冷冻。将 WT和 dKO小鼠处死并在体视镜下分离出小鼠输卵管，同样加入 OCT 包埋。将OCT 包埋的组织用冰冻切片机进行切片，厚度为8 m。PBS 洗掉 OCT，滴加 0.5%Triton，室温通透20 min；之后用PBS洗3遍，每遍5 min。5%BSA室温封闭 1 h后加入用 5%BSA稀释的一抗，置于湿盒中 4 孵育过夜。一抗包括抗 PAX8抗体（1 200）、抗 Ac-tubulin 抗 体（1 200）、抗 ACTA2 抗 体（1 200）、抗波形蛋白抗体（1 100）。之后用PBS洗3 遍，每遍 5 min。荧光标记二抗用 PBS 按 1 400 进行稀释，室温避光孵育 1 h。PBS 洗 3 遍，每遍5 min。用含 DAPI的封片剂进行封片并在荧光显微镜下观察。1.2.5RNA 的提取和实时荧光定量 PCR将培养 2个月的 WT 和 dKO 小鼠输卵管上皮类器官回收，TRIzol提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板进行实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）检测。以Gapdh作为内参，2Ct法分析mRNA表达水平。按TB Green Premix EX Taq 说明书配置反应体系。反应条件：95 3 min；95 5 s，60 30 s，40个循环。使用的引物序列见表1。1.2.6Western blotting 检测蛋白表达水平用含蛋白酶抑制剂的 RIPA 裂解液提取 WT 和 dKO 小鼠输卵管上皮类器官蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，表1实时荧光定量PCR引物序列Tab 1Primer sequences in RT-qPCRPrimerFoxj1-FFoxj1-RPax8-FPax8-RTubb4a-FTubb4a-ROvgp1-FOvgp1-RGapdh-FGapdh-RSequence(5 3)AAGGAGGCAGAAATCCGGTGTTGTAGCCTCCCTTGTGCAGCCCTTCGCCATAAAGCAGGAAGCATGGGGAAAGGCATTGAAACCCGGCACCATGGACTCTGTTGCCTGCTCCGGATTGACCAAATATGGACCCCTTTCTTTGTACGTGGACAGCAGTGTTTTCAGCTGGAAAGCTGTGGCGTGATGGGTAGGAACACGGAAGGCNote:Tubb4atubulin class a;Ovgp1oviductal glycoprotein 1.8512023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)加 5上样缓冲液在 95 金属浴中变性 5 min。以每孔蛋白量20 g上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离后转至 PVDF 膜上。5%BSA 室 温 封 闭 1 h，分 别 滴 加 抗 FOXJ1 抗 体（1 1 000）、抗 PAX8 抗体（1 1 000）、抗 GAPDH抗体（1 5 000），4 孵育过夜，洗膜 3 次，加入山羊抗兔或山羊抗鼠二抗（1 5 000），室温孵育1 h。洗膜3次后，进行显影曝光，用ImageJ对条带灰度值分析。1.2.7输卵管及其上皮类器官的苏木精-伊红染色将输卵管上皮类器官回收，500g离心 5 min，弃上清液，加入4%多聚甲醛，室温固定过夜；同时将WT和dKO小鼠处死并分离出输卵管，用4%多聚甲醛室温固定过夜。之后梯度浓度乙醇脱水，二甲苯透明1 h，石蜡（温度500200-50050-200500200-50050-200EFGOrganoid diameter after 16 d/mOrganoid diameter after 8 d/mNote：A.Different genotypes of mice detected by PCR.Triple(miR-34b/c+/and miR-449/),miR-449/,and dKO(miR-34b/c/and miR-449/).B.Primary culture of the oviductal epithelial cells(400,scale bar=50 m).C.Identification of the purity of the isolated oviductal epithelial cells using immunofluorescent staining.Ac-tubulin for showing ciliated cells,PAX8 for showing secretory cells,ACTA2 for showing smooth muscle cells,and vimentin for showing fibroblasts(400,scale bar=50 m).D.Phase contrast images of organoids formation and growth from WT mice and dKO mice(100,scale bar=200 m).E.The numbers of the organoids with different sizes were counted after 8 d.F.The numbers of the organoids with different sizes were counted after 16 d.G.The total numbers of organoids were counted after 8 d and 16 d.P=0.002,P=0.007,P=0.004,P=0.006,P=0.001,P=0.011,P=0.013,compared with the WT group.图1WT小鼠和dKO小鼠输卵管上皮类器官形态学比较Fig 1Morphological comparison of oviductal epithelial organoids from WT mice and dKO mice8532023,43（7）上海交通大学学报（医学版）Vol.43 No.7 Jul.2023JOURNAL OF SHANGHAI JIAO TONG UNIVERSITY(MEDICAL SCIENCE)2.3输卵管上皮类器官的结构及细胞构成通过H-E染色，我们发现大多数类器官由单层细胞组成，同时一些类器官表现出复杂的内部折叠结构，类似在体输卵管皱襞的表现（图3）。利用透射电镜观察，我们发现WT小鼠输卵管上皮类器官的纤毛细胞游离面有排列整齐的纤毛，而dKO小鼠输卵管上皮类器官纤毛细胞中基粒排列紊乱且无伸长的纤毛（图4A），这与在体的输卵管表型一致22。同时，在WT小鼠和dKO小鼠输卵管类器官中都可见分泌细胞通过胞吐释放的分泌颗粒（图4B）。为进一步明确构成输卵管上皮类器官的细胞类型，利用分泌细胞分子标志物 PAX8和纤毛细胞分子标志物 Ac-tubulin对培养的类器官（图5A）和输卵管组织（图5B）进行免疫荧光鉴定。免疫荧光结果显示，输卵管组织和类器官中2种细胞特异性分子标志物均为阳性，提示培养的类器官主要由分泌细胞和纤毛细胞构成。与WT 相 比，dKO 小 鼠 输 卵 管 上 皮 类 器 官 中 Ac-tubulin+的纤毛细胞显著减少（图 5C），而 PAX8+的分泌细胞显著增多（图5D），这与在体dKO小鼠输卵管纤毛细胞显著减少的表型一致21-22。OrganoidOviductWTdKONote：Comparison of the histology structure of the oviducts and the oviductal epithelial organoids from WT mice and dKO mice after 2 months of culture(scale bar=50 m).图3光学显微镜下输卵管上皮类器官的结构(H-E染色,400)Fig 3Structure of the oviductal epithelial organoids under light microscopy(H-E staining,400)ABCWTdKOWTdKO16 d16 d28 d28 d1 week(P1)1 month(P4)2 months(P8)3 months(P12)4 months(P17)Note：A/B.Representative mature organoids with epithelial invaginations and foldings(arrows)after 16 d of WT mice(A)and after 28 d of dKO mice(B)(100,scale bar=200 m).C.Oviductal epithelial organoids culture of WT mice and dKO mice could be maintainted at least for 4 months and 17 passages(P17)(100,scale bar=200 m).图2输卵管上皮类器官的长期培养及传代Fig 2Long-term culture and passage of oviductal epithelial organoids854吴其谦，等小鼠输卵管上皮类器官的构建及表型验证http:/上海交通大学学报（医学版），2023，43（7）dKOWTdKOWT10 00025 00010 00025 000BANote：A.Transmission electron microscopic images of the ciliated cells of oviductal epithelial organoids of WT mice and dKO mice after 2 months of culture(10 000,scale bar=1 m).The images on the right are the magnification ones in the dotted box on the left(25 000,scale bar=500 nm).The white line showing the arrangement of the basal bodies,and the white arrows showing multiple disorganized centrioles.B.Transmission electron microscopic images of the secretory cells of oviductal epithelial organoids of WT mice and dKO mice after 2 months of culture(10 000,scale bar=1 m).The images on the right are the magnification ones in the dotted box on the left(25 000,scale bar=500 nm).The white arrows showing