外源亚精胺对高温运动小鼠机体保护作用及机制研究.pdf

外源亚精胺对高温运动小鼠机体保护作用及机制研究李艳红1，张姣姣1，李 晨2，李英英2，何恩鹏2*（1.新疆师范大学 生命科学学院，新疆特殊环境物种保护与调控生物学实验室，新疆 乌鲁木齐 830017；2.新疆师范大学 体育学院，运动人体科学重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830054）摘要：文章探讨外源性亚精胺（SPD）对高温运动小鼠机体的保护作用。建立高温运动小鼠模型，采用不同方式进行干预，4周后处死小鼠，采集血清、肝脏、骨骼肌，利用酶联免疫等方法对血清和骨骼肌生化指标进行测试；通过荧光定量PCR和Western Blot技术测定亚精胺合成酶（Spermidine Synthase，SPDS）基因及蛋白在腓肠肌内的表达。SPD可以显著降低高温运动小鼠血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和肝脏中丙二醛（MDA）水平（P0.05）；SPD亦可以显著提高肝组织中超氧化物歧化酶（SOD）水平和腓肠肌中6-磷酸-葡萄糖脱氢酶（G6PDH）活性（P0.05），而对骨骼肌乳酸脱氢酶（LDH）活性无影响（P0.05）；对腓肠肌SPDS基因和蛋白表达的分析发现，SPD可以提高高温运动时骨骼肌SPDS基因的表达，增加SPDS酶的含量，进而提高了内源性SPD含量。外源性SPD可显著提高高温环境小鼠运动能力，保护高温运动小鼠免受氧化应激的损伤，保持细胞膜系统稳定，维持细胞正常生理状态，其作用机理可能是外源性SPD促进亚精胺合成酶的表达，进而促进内源性SPD高效合成，维持细胞内源性SPD平衡。关键词：亚精胺；高温环境；氧化应激中图分类号：Q595文献标识码：A文章编号：1008-9659（2023）03-0059-07运动员在运动训练和比赛中均面临高温环境的困扰1。机体长时间处于高温环境会出现一系列不良反应，如疲劳、反应迟钝、焦躁不安等，高温环境下运动性疲劳的发生发展加速，影响机体运动能力，严重影响机体健康。如不采取有效预防措施应对高温环境下机体产生的应激反应，将导致机体出现不可逆的损伤，甚至出现高温休克，危及生命2-3。研究发现，高温运动时机体活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）会随着环境温度的升高而增加，导致机体处于氧化应激（Oxidative Stress，OS）状态4-6，其表现为氧化与抗氧化系统之间失衡。氧化应激导致机体内膜、内皮细胞、平滑肌细胞、纤维组织损伤，加速运动性疲劳的发生。因此，维持细胞稳态的前提是氧化与抗氧化系统之间的平衡7-8。亚精胺（SPD）是一种广泛存在的天然多胺，大量文献报道SPD具有显著的心脏和神经保护作用，其可以逆转衰老引起的动脉硬化，还可以减少老年小鼠内皮细胞的氧化损伤，另有研究表明SPD减轻了高脂饮食喂养的载脂蛋白E缺陷（ApoE/）小鼠的动脉粥样硬化斑块的形成。补充SPD还可以改善与衰老相关代谢下降、减少的肿瘤发生等9。因此文章通过研究SPD对高温运动小鼠机体的保护作用，以期为研究高温环境下运动健康提供理论指导。1 材料与方法1.1 材料与试剂实验动物：雄性昆明小鼠32只，三周龄时购自新疆医科大学实验动物中心，许可证号：SYXK（新）2018-0003；Vol.42，No.3Sept.2023第42卷 第3期2023年9月新疆师范大学学报（自然科学版）Journal of Xinjiang Normal University（Natural Sciences Edition）收稿日期 2023-03-24 基金项目 新疆维吾尔自治区自然科学基金面上项目（2021D01A120；2022D01A100）；新疆师范大学2022年硕士研究生科研创新项目（XSY202201008）。作者简介 李艳红（1981-），女，山东潍坊人，副教授，主要从事分子生物学方面研究。*通讯作者 何恩鹏（1983-），男，山东临沂人，教授，主要从事运动促进健康方面研究。59新疆师范大学学报（自然科学版）2023年动物房平时温度为2325，实验高温为3537，相对湿度控制在50%60%，8只/笼，小鼠自由饮食并定期称重。亚精胺从Sigma公司购入，分子量为145.25；谷草转氨酶（AST）试剂盒、谷丙转氨酶（ALT）试剂盒、丙二醛（MDA）试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒、6-磷酸-葡萄糖脱氢酶（G6PDH）和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒均购自南京建成生物工程有限公司；RNA提取、反转录和荧光定量试剂购自北京天根生化科技有限公司。1.2 实验动物分组、给药以及训练方法小鼠四周龄时，将其随机分为四组，即无运动组（CON，Control），常温运动组（RTExe，Room Temperature Exercise group），高 温 运 动 组（HTExe，High Temperature Exercise group），高 温 运 动+亚 精 胺 干 预 组（HTExe+SPD），每组 8 只。运动组小鼠进行四天跑台适应运动，分别以速度 5m/min 和 5min/d 递增，直至20m/min，坡度为7，训练时间为20mins，训练30d，HTExe+SPD组在训练前30mins以100mg/kg BW灌胃SPD，末次运动后立即取血、心、肝、脾、肾、睾丸、腓肠肌和脂肪组织，用0.9%NaCl冲洗组织，-86保存至备用。1.3 实时荧光定量PCRGAPDH和SPDS引物序列与合成均由上海生工进行，如表1所示。表1 实时荧光定量基因引物序列基因GAPDHSPDS引物名称FRFR引物序列（5-3）5-CAAGGTCATCCATGACAACT-35-GGCCATCCACAGTCTTCTGG-35-TCTGCTGCCAAGGTGACTTGC-35-AGGGATGGTGCAATAGGCGTA-31.4 统计分析所有数据以均数标准差（x s）表示，统计处理用 SPSS23.0 软件进行分析，各组采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，目的基因相对表达量采用Ct法计算，目的基因的相对表达水平用2-Ct表示。蛋白表达量分析采用比较灰度值法进行分析。2 研究结果与分析2.1 小鼠体重变化对小鼠体重进行分析，如图1所示。与HTExe组小鼠相比，其他三组小鼠体重显著升高（P0.05），且HTEx+SPD组小鼠体重接近于正常组。结果表明，SPD可以增加高温运动小鼠的体重。DocouomooentPeresCl:yaMgYwBgkRTExaHTExa HTExa+SPD图1 小鼠体重的变化（-x-s，-n=8）注：相同字母之间没有差异，不同字母之间有差异（P0.05）。2.2 小鼠血清中AST、ALT含量的分析试剂盒测定小鼠血清中AST、ALT含量，如图2所示。与HTExe组相比，CON组和HTExe+SPD组的AST、ALT水平显著性降低（P0.05），但RTExe组AST、ALT水平没有显著性差异（P0.05）。结果表明，SPD可60李艳红，等：外源亚精胺对高温运动小鼠机体保护作用及机制研究以降低高温运动小鼠的AST、ALT水平。DocDccuococcmentPPmrsCl:yaMCgYwBCgYw BCgYwksPDuccDccuococcmentPPcrsCl:yaMCgYwBCgYw BCgYwksPDucc图2 小鼠血清AST、ALT含量的变化（-x s，n=8）注：相同字母之间没有差异，不同字母之间有差异（P0.05）。2.3 小鼠肝脏组织中MDA、SOD含量的分析试剂盒测定肝脏组织MDA和SOD水平，如图3所示。与HTExe组相比，其他三组小鼠的肝脏中MDA含量显著降低（P0.05），而SOD活力显著升高。结果表明，SPD可以降低高温小鼠肝脏中的MDA含量，提高SOD活力减轻高温小鼠肝脏的氧化损伤。DocumentPeresCl:yaM gYwBkxeHBkxe HBkxe+SPCumm15m5mmentPrceStC:uMY gwBkxeHBkxe HBkxe+SPC1mm图3 小鼠肝脏组织MDA、SOD含量的变化（-x s，n=8）注：相同字母之间没有差异，不同字母之间有差异（P0.05）。2.4 G6PDH和LDH酶在腓肠肌组织中的活性试剂盒测定腓肠肌组织G6PDH和LDH的酶活性，如图4所示。与HTExe组相比，CON组的LDH酶活性显著降低（P0.05），RTExe、HTExe+SPD 组没有显著性差异（P0.05）。与 HTExe 组相比，其他三组的G6PDH酶活力显著升高（P0.05）。结果表明，SPD可以提高高温运动诱导的小鼠G6PDH酶活性。DocouomooentPrrrsCl:ysa MgeYwBkelwBke lwBke+SPC5DcumoentPrreG6PCl ysa Mg:eYwBkelwBke lwBke+SPC图4 各组小鼠腓肠肌组织G6PDH、LDH活性的变化（-x s，n=8）注：相同字母之间没有差异，不同字母之间有差异（P0.05）。61新疆师范大学学报（自然科学版）2023年2.5 SPDS基因在腓肠肌的转录水平荧光定量PCR检测SPDS基因的表达量，如图5所示。与HTExe组相比，CON、RTExe、HTExe+SPD组腓肠肌组织中SPDS基因mRNA的表达水平显著升高（P0.05）。结果表明，SPD可以提高高温运动诱导的小鼠SPDS基因的表达。DocumentPrPsClm:yCaMCgCaCYwBCkk ogsTEYCHTEYC HTEYC+SPD图5 小鼠腓肠肌SPDS基因mRNA表达量（-x s，n=8）注：相同字母之间没有差异，不同字母之间有差异（P0.05）。2.6 SPDS蛋白在腓肠肌的表达水平Western Blot检测SPDS蛋白的表达量，如图6所示。与HTExe组相比，CON、RTExe、HTExe+SPD组腓肠肌组织中SPDS蛋白的表达水平显著升高（P0.05）。结果表明，SPD可以提高高温运动诱导的小鼠SPDS蛋白的表达。图6 小鼠腓肠肌SPDS蛋白表达量（x s，n=8）注：相同字母之间没有差异，不同字母之间有差异（P0.05）。3 讨论3.1 外源性SPD对高温环境运动小鼠力竭游泳时间和体重的影响研究发现，高温环境下训练、比赛和劳动会加速体液和电解质的丢失，导致机体内环境稳态失衡，出现运动性热应激。当机体处于高温环境时，为保持自身体温的恒定，机体会通过神经（下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴系及交感神经-肾上腺髓质系统的兴奋）、体液进行一系列的反馈调节。这些信息经体温调节中枢整合后引起内分泌腺、皮肤血管等活动的变化，改变机体的散热能力，使体温维持相对稳定状态（科学家通常把32以上的训练环境以及35以上的生活环境称为高温环境10）。机体长期处于运动性热应激状态，机体耗能会增加，导致体重下降。本研究结果显示，在高温环境下随着运动强度的增加体重减负明显，出现运动性热应激状态。外源性SPD干预组体重下降则不明显，力竭运动时间显著增加，提示外源性SPD可以减少机体的运动性热应激伤害，提高机体的调节能力进而提高高温环境下的运动能力。62李艳红，等：外源亚精胺对高温运动小鼠机体保护作用及机制研究3.2 外源性SPD对高温环境运动小鼠血清转氨酶的影响谷草转氨酶（AST）和谷丙转氨酶（ALT）主要分布在肝脏和心肌，其次是骨骼肌和肾脏等组织。正常情况下，血清中的AST和ALT含量较低，当细胞受损时，细胞膜通透性增加，胞浆内的AST和ALT释放入血，使血清AST和ALT浓度升高，常被作为心肌和肝脏细胞损伤的指标因子。有报道指出，高强度运动和高温环境的双重刺激可以显著提高血清AST和ALT含量，提示在高温环境下运动更容易导致心肌、骨骼肌和肝脏损伤，其原因可能与高温环境下高强度运动会使体温升高过度，进而诱发机体ROS水平和内源性抗氧化能力之间氧化还原失衡，从而导致组织损伤11-12。该研究发现 HTExe+SPD 组小鼠补充 SPD后，血清 AST和ALT水平显著降低，且与HTExe组比差异具有显著性，提示补充SPD保护高温环境下运动小鼠免受氧化应激的损伤，维持肝脏、心肌和骨骼肌的正常功能。3.3 外源性SPD对高温环境运动小鼠肝脏MDA、SOD含量的影响丙二醛（MDA）是细胞膜脂质过氧化最重要的产物之一，它能加剧细胞膜的损伤，脂质过氧化的程度与运动强度、运动环境和机体恢复能力等有关，MDA作为其最终产物，是组织损伤的重要标志物13-14，生理代谢物质含量升高则表明机体自由基生成不能及时清除，增加了自由基对机体的损害。高温环境会造成机体急性缺氧并释放大量的氧自由基，肝脏内MDA含量上升，引起肝脏内细胞膜受损。该研究结果显示，HTExe组MDA水平高于其他组，表明高温运动小鼠肝组织活性氧（ROS）增加，肝细胞膜生物大分子受到ROS攻击引起肝细胞损伤，而补充SPD可以显著降低HTExe+SPD组MDA水平，这证明补充SPD减少自由基生成，保护肝细胞膜免受氧化应激损害。超氧化物歧化酶（SOD）是一种广泛存在于生物体内的抗氧化酶，能够歧化细胞新陈代谢产生的超氧自由基，使之转化成水和氧气，降低自由基对机体的损害，从而保护细胞结构、功能的完整性，能够发挥极其重要的抗氧化作用 15。研究发现，高温环境会引起机体自由基生成量增加，氧自由基增多使机体内SOD大量消耗，造成了氧自由基和SOD水平的不均衡。有报道指出，高温可降低抗氧化酶活性，亦有研究表明，补充SPD可提高SOD的活性16。该研究结果表明补充SPD后HTExe+SPD组SOD水平显著升高，说明SPD可通过增加肝脏SOD活性，保护小鼠肝脏，减少高温应激的损伤。3.4 外源性SPD对高温环境运动小鼠腓肠肌G6PDH活性及SPDS表达量的影响6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）作为磷酸戊糖通路上的第一个酶，磷酸戊糖途径除能够为生物体提供能量外，还为脂肪酸、胆固醇的生物合成提供还原型辅酶（NADPH），为核苷酸辅酶、核苷酸的合成提供5-磷酸核糖。磷酸戊糖途径氧化阶段的脱氢反应在生理条件下是不可逆的，因此作为磷酸戊糖途径的第一个脱氢酶，G6PDH成为葡萄糖氧化分解的重要限速酶。同时，G6PDH在氧化损伤的防御机制中扮演重要角色，G6PDH活性高低反应机体抗氧化能力17。该实验表明HTExe+SPD组G6PDH酶活性较HTExe组升高，一方面，说明SPD可以通过增加G6PDH酶活性提高葡萄糖氧化分解的速度，为机体提供更多能量，从而抑制高温应激损伤，对机体起到保护作用；另一方面，说明 SPD 亦可以通过增加 G6PDH 酶活性提高磷酸戊糖途径代谢，为脂肪酸的合成提供更多NADPH，提高细胞膜的氧化损伤修复能力，维持细胞的正常生理功能。SPD是多胺的一种，大量研究显示外源性SPD的补充有抗衰老、抗癌、保护心血管、增强免疫、神经调节和神经保护及阻止老年痴呆和改善代谢性疾病的作用。机体SPD含量主要由细胞合成速度和细胞外摄入量决定，其中外源性补充可以通过肠道吸收且不被降解，并迅速进入全身器官组织。SPD的细胞合成速度随年龄而变化，有研究者分别对3、10和26周龄小鼠组织器官的SPD浓度进行测量，结果显示胰、脑和子宫中SPD含量基本保持恒定，在小肠中年龄越大SPD含量越低，而在胸腺、脾脏、卵巢、肝脏、胃、肺、肾脏、心脏和肌肉中SPD含量显著降低18。通过上述分析发现，外源性SPD可以显著提高高温运动小鼠的运动能力，减少高温运动引起的氧化应激损害。为了验证细胞内源性SPD合成在抵抗高温引起的氧化应激中的作用，测定了各组腓肠肌亚精胺合63新疆师范大学学报（自然科学版）2023年成酶（SPDS）基因mRNA的转录水平以及SPDS蛋白表达量。结果表明运动可以促进亚精胺合成酶的表达，当运动环境温度过高时机体氧化应激加剧，细胞生理功能受损，内源性SPD合成减少，而补充外源性SPD的高温运动组亚精胺合成酶含量增加，提示外源性SPD可以通过上调SPDS基因mRNA的表达增加亚精胺合成酶含量来实现内源性SPD合成，保护机体免受氧化应激的损害，这可能与SPD可以促进蛋白质的合成或阻止它们的降解有关。4 结论外源性SPD可显著提高高温环境运动小鼠运动能力，保护高温运动小鼠免受氧化应激的损伤，保持细胞膜系统稳定，维持细胞正常生理状态，其作用机理可能与外源性SPD促进亚精胺合成酶的表达，进而促进内源性SPD高效合成状态，维持细胞内源性SPD平衡有关。参考文献：1 李焕春，许小刚，肖国强.热处理对大鼠骨骼肌内质网应激的影响及对骨骼肌适应性的保护作用 J.体育学刊，2013，20（03）：130-133.2 赵杰修，冯连世.高温高湿环境与运动性疲劳 J.中国运动医学杂志，2008，27（02）：238-242.3 王桐生，龙子江，黄金玲，等.夏季养生颗粒对高温条件下心脏的保护作用 J.中成药，2013，35（02）：392-394.4 LEEUWENBURGH C，HEINECKE J W.Oxidative 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Spermidine（SPD）on mice with high temperature exercise.A mouse model of high temperature exercise was established，different methods were used to intervene，mice were sacrificed after 4 weeks，serum，liver，skeletal muscle were collected，and serum and skeletal muscle biochemical indexes were tested by enzyme-linked immunization and other methods.The expression of Spermidine Synthase（SPDS）genes and proteins in the gastrocnemius muscle was determined by real-time PCR and Western Blot.SPD can significantly reduce the serum levels of Aspartate aminotransferase（AST），Alanine aminotransferase（ALT）and Malondialdehyde（MDA）in liver（P0.05）in mice with high temperature exercise，and SPD can also significantly increase the level of Superoxide Dismutase（SOD）in liver tissue and the activity of 6-phosphate-glu-cose dehydrogenase（G6PDH）in gastrocnemius muscle tissue（P0.05），but has no effect on Lactate Dehydrogenase（LDH）activity in skeletal muscle（P0.05）；Analysis of the expression of SPDS gene and protein in gastrocnemius muscle showed that SPD could increase the expression of SPDS gene in skeletal muscle during high temperature exercise，increase the content of SPDS enzyme，and then increase the content of endogenous SPD.Exogenous SPD can significantly improve the exercise ability of high-temperature exercise mice，protect high-temperature exercise mice from oxidative stress，maintain the stability of cell membrane system，maintain the normal physiological state of cells，and its mechanism of action may be related to exogenous SPD promoting the expression of spermidine synthetase，thereby promoting the efficient synthesis of endogenous SPD and maintaining the balance of endogenous SPD.Keywords：Spermidine；High temperature environment；Oxidative stress65