线粒体病的分子诊断与疾病标志物.pdf

【通讯作者简介】方合志男教授博士生导师 国家优秀青年科学基金获得者浙江省杰出青年基金获得者浙江省万人计划浙江省高校领军人才培养计划 中国医师协会检验医师分会线粒体疾病检验医学专家委员会委员中华医学会检验医学分会青年教师科研创新联盟成员浙江省医学遗传学分会青年委员会副主任委员 研究方向:细胞代谢与人类疾病(胰腺癌、遗传代谢病、肥胖)线线粒粒体体病病的的分分子子诊诊断断与与疾疾病病标标志志物物董起钰尹筱婕钟 声范双龙方合志王 娅(浙江省医学遗传学重点实验室温州医科大学检验医学院生命科学学院浙江 温州)【摘要】线粒体病是因核基因()和/或线粒体基因()突变引起线粒体功能异常进而导致的一类遗传代谢性疾病其主要特征是氧化磷酸化()功能缺陷 线粒体病疾病亚型众多临床表现多样可累及人体多个脏器这给线粒体病的诊断和治疗带来巨大挑战 分子诊断可在基因水平上揭示线粒体病的病因目前已成为线粒体病确诊的重要依据 本文对线粒体病的遗传特点、分子诊断和疾病标志物等进行综述【关键词】线粒体病分子诊断疾病标志物【中图分类号】【文献标志码】【文章编号】()()【】【】()().().【】线粒体疾病(也称线粒体病)是儿童时期最为常见的一类先天性遗传代谢病目前尚无根本的治疗方法 因此早发现、早诊断对于线粒体病的防治至关重要 由于线粒体病临床表型的多样性和复杂性导致线粒体病诊断尤为困难极易漏诊误诊往往需要结合临床、病理、生化以及分子检测综合进行诊断 其中临床诊断是线粒体病诊断的基础但当临床不能确诊时分子诊断对线粒体病的确诊起到了“一锤定音”的作用 本文主要介绍了线粒体病的分子诊断策略和疾病诊断标志物 线粒体病线粒体病最早发现于 年并被定义为一类存在氧化磷酸化()功能异常的遗传代谢性疾病 随着酶生化技术、细胞学、尤其是基因组学技术的发展线粒体病被进一步定义为:一类线粒体功能异常所导致的疾病其中 功能缺陷是其主要特征 线粒体病临床表现多样可累及人体多个脏器疾病亚型多达 余百种其中常见的线粒体病有线粒体脑肌病伴乳酸酸中毒和卒中样发作综合征()、亚急性坏死性脑病(综合征)、综合征()、慢性进行性眼外肌瘫痪()、肌阵挛性癫痫伴肌肉蓬毛样红纤维综合征()等 虽然单一的线粒体疾 病 亚 型 发 病 率 低 但 总 发 病 率 可 高 达/是儿童时期最为常见的先天性遗传代谢病 已知有 余种蛋白定位于线粒体中其中绝大多数蛋白质由核基因()编码而线粒体基因()仅编码了其中的 种亚基 种 和 种 因此线粒体病的遗传方式可分为 突变介导的孟德尔遗传方式和 突变介导的母系遗传方式 线粒体病的遗传特点线粒体是一个半自主性细胞器能够进行自我复制、转录和翻译 与 相比 具有如下特点:母系遗传这是因为精子在发育成熟后只有很少的线粒体且在受精后自行降解子代中 几乎全部来自于卵细胞而表现为母系遗传 但近年研究也显示在少数情况下父亲可以将 遗传给后代复制分离在细胞分裂过程中 随机分配到子细胞中导致子细胞含不同比例的突变 分子 分裂旺盛的细胞往往会排斥突变型 使细胞中野生型 比例逐渐增加 而在分裂不活跃的细胞中则出现相 实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期反的情况高突变率主要因为 无组蛋白保护缺乏损伤修复系统且与线粒体内膜相连极易被呼吸链代谢产生的氧自由基损伤阈值效应突变型 达到一定水平导致线粒体产能急剧下降组织或器官缺乏能量供应从而表现出临床症状 能量需求越高的组织器官的阈值越低对线粒体功能异常越敏感 线粒体病的分子诊断与疾病标志物.线粒体病分子诊断由于线粒体病临床表现的多样性和复杂性给线粒体病的诊断带来巨大挑战 线粒体病的诊断需结合临床诊断、肌肉病理学检查、生化检测以及分子诊断综合进行分析 临床诊断是线粒体病诊断的基础但当临床不能确诊时分子诊断起到了决定性作用 年等首次发现.是 遗传性视神经病()的致病突变 随后 等在 年发现了第二个线粒体病致病突变(.)过去十几年随着高通量测序在线粒体病分子诊断中的应用至今已发现 余个线粒体致病基因由于线粒体病基因型表型间存在一定关联因此可结合临床表现针对性进行基因检查 见表 表 线粒体病相关基因突变及临床表现线粒体病基因/位点临床表现 综合征、.、.、.、.生长发育迟滞或倒退、肌力下降或肌张力异常、眼球震颤、视神经萎缩 综合征.、.、.、.、.、.、.、.、.、癫痫、卒中样发作、头痛 综合征.、.、.、.肌阵挛全身性癫痫共济失调 遗传性视神经萎缩.、.、.视神经萎缩伴随或不伴随其他多系统症状如运动障碍、癫痫、听力障碍等 综合征.、.、.、.进行性眼外肌麻痹和视网膜的色素性病变 综合征又称为亚急性坏死性脑病是由遗传缺陷导致线粒体功能障碍引起的神经退行性病变发病率约为/综合征起病早病程进展迅速预后较差 病因复杂主要由线粒体呼吸链复合体缺陷(、等核基因或、等线粒体基因突变导致)丙酮酸羧化酶或丙酮酸脱氢酶复合物缺陷(、等基因突变导致)辅酶 等辅助因子合成障碍(、突变导致)患者脑干、双侧基底节区、小脑、脊髓等部位对称性局灶性坏死并表现生长发育迟缓、肌力下降或肌张力异常等临床症状 综合征是一种常见的线粒体脑肌病患者临床多表现为癫痫、卒中样发作、头痛等基因检测是确诊 综合征的重要标准 自 等于 年 首 次 报 道.突 变 导 致 的病例更多的 变异位点被发现如.、.、.、.等其中大部分突变位于 的 基因区域 综合征又称肌阵挛癫痫伴破碎红纤维综合征是线粒体脑肌病的一个亚型患者多在儿童期发病 由于突变基因或位点不同患者的临床表型各异以肌阵挛性癫痫发作为主要特征 可伴有智力减退、小脑共济失调等此外还会出现如甲状腺功能减退等其他内分泌系统疾病 线粒体 突变导致线粒体氧化磷酸化功能缺陷是发病的根本原因.、.、.和.是常见的致病性突变其中.是 相关的热点突变 又称 遗传性视神经萎缩该病于 年首次报道以双眼出现无痛性视力下降为首发症状随着病情进展可出现显著的双侧视神经萎缩伴随或不伴随其他多系统症状如运动障碍、癫痫、听力障碍等 约 的 患者由.、.和.这三个点的突变引起 综合征于 年由 和 首次报道是一种以慢性进行性眼外肌麻痹、视网膜色素变性和心脏传导功能障碍三联征为主要特征的线粒体脑肌病 最常见病因是由 的重排导致的线粒体 单个或多个片段缺失常见的致病性突变位点包括.、.、.和.等.线粒体病分子 诊断技术 突变形式有多种包括点突变、重复和缺失等其中主要以点突变为主 突变的检测方法主要包括 和 等 对于、等常 实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期见的线粒体 点突变通常使用 法该方法是通过 扩增一段含有突变位点的然后再使用合适的限制性内切酶酶切 产物经琼脂糖凝胶电泳得到特异性的电泳谱带野生型 所得的 产物会被切成 个片段从而鉴定该位点是否发生突变 该方法较简便特异性高适合同时检测多个样本并且通过扫描野生型及突变型 条带信号强度可以粗略计算突变型 的比例 但此方法耗时结果不稳定限制性内切酶可能消化不完全 此外 法可能无法检测到低百分比()的异质性 为了更有效地诊断线粒体病可使用多重/等位基因特异性寡核苷酸()点印迹杂交方法 患者 样本含有野生型或突变型 将其 产物与相应的核酸探针杂交野生型的 只结合正常探针同质突变型的 只结合突变探针而异质突变型的 将与野生型和突变型 探针杂交 该方法灵敏度高能同时分析多个位点突变 对于低百分比的突变异质性也可以检测 但不能进行定量检测对于大片段缺失可采用 杂交进行检测基本原理是经限制性内切酶酶切后的 片段琼脂糖凝胶电泳及变性后转移至固相支持物上与相应的标记探针进行杂交 使用 杂交时需注意检测样本的选择 由于 缺失的线粒体病患者其不同组织中含有的突变型 比例不同在肌肉和脑等组织中突变型 比例较高但在血液中可能检测不到对于一些尚不清楚的点突变可采用单链构象多态性()、变性高效液相层析()、变性梯度凝胶电泳()及 测序等进行检测 是基于单链 构象的差别来检测突变 相同长度的单链 由于碱基序列不同形成不同的空间构象在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为不同的迁移率区分野生型 和突变型 操作简单能够快速、有效地检测各种类型的突变如点突变、缺失和重复等但如果突变导致空间构象变化微小迁移率相差无几会出现假阴性进而影响检测的灵敏度 方法可以筛查未知单核苷酸多态性和突变具有高通量、自动化、特异性高、快速等优点是分析异质性突变首选的检测方法 该方法主要通过 扩增得到相同长度的 片段突变型 片段和野生型 片段只有一个位点的差异退火后可形成同源双链和异源双链两者在层析柱中的移动速度不同异源双链因有错配区的存在而更易变性在色谱柱中的保留时间短于同源双链故先被洗脱下来野生型和突变型得以区分由此达到检测基因突变的目的目前也有许多研究将 变性高效液相层析技术用于检测 突变 因不受其他筛选方法敏感性和特异性的限制 测序技术是进行突变分析最直接和最准确的方法已成为检测基因突变的金标准 测序技术主要包括第一代测序技术(测序)、第二代测序技术()和第三代测序技术 近年来 被广泛用于研究 缺陷主要适用于检测 大片段缺失和异质率已成为 遗传分析的首选方法 主要包括全基因组测序()和全外显子测序()其中 是对生物体整个基因组序列进行测序可以获得完整的基因组信息能够鉴定出基因组上任何类型的突变覆盖内含子和外显子区域能同时分析线粒体基因组项目以及动态突变项目 不同于 关注基因组的外显子区域即蛋白质编码区域是目前更适用于临床的高深度测序技术 虽然外显子组只占基因组的 却包含约 的致病突变 与全基因组测序相比全外显子测序检测目标区域明确更加经济高效对研究、等具有较大的优势可以凭借高深度测序鉴定到全基因组测序所没有鉴定到的突变但不能检测大片段缺失 测序技术促进了突变鉴定速度的提高以及新致病基因的发现助力了线粒体病快速诊断 总之这些技术推动了线粒体病分子诊断的迅速发展为临床快速确诊提供了更精准的信息.线粒体 疾病标志物与线粒体功能障碍相关的多种生化物质统称为线粒体疾病标志物包括脑脊液乳酸、丙酮酸、血氨基酸、尿有机酸等上述标志物水平的检测对线粒体病诊断具有重要意义乳酸/丙酮酸比值 线粒体病患者安静时脑脊液、血清和尿液中的乳酸水平通常升高导致乳酸与丙酮酸比值随之变化一般认为安静时乳酸与丙酮酸比值大于 提示患者线粒体呼吸链复合体功能缺陷和丙酮酸代谢受损 但值得注意的是运动和抽血应激会导致患者血乳酸水平急剧上升因此测定乳酸水平时需排除该干扰因素血浆氨基酸及尿有机酸 血浆氨基酸及尿有机酸检测一定程度上也可帮助鉴别线粒体病 目前在临床上多采用串联质谱法进行血浆氨基酸和尿有机酸检测 患者血浆中丙氨酸水平异常升高提示线粒体功能障碍 临床上一般将丙氨酸与酪氨酸等必需氨基酸进行比较以明确丙氨酸水平的相对值是否升高 综合征患者的血浆瓜氨酸水平降低部分丙酮酸脱氢酶缺陷患者的缬氨酸等支链氨基酸水平升高 有机酸作为机体代谢 实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期的副产物在线粒体病患者尿液中的水平会出现异常改变如 综合征患者尿液中 甲基葡聚糖酸水平明显升高 缺乏征患者甲基丙二酸水平明显升高()综合征患者 甲基戊烯二酸水平升高此外有报道线粒体患者体内成纤维细胞生长因子()和生长分化因子()水平升高但也有文章指出 和 在肝脏受损的非线粒体病患者体内也会异常升高二者在继发性线粒体病诊断过程中的灵敏度较以往报道低因此并不能将二者作为线粒体病的特异性指标仅可作为辅助诊断依据 小结目前线粒体病的诊断需结合临床诊断、病理检查、生化检测以及分子诊断综合进行分析 在临床疑诊时分子诊断对线粒体病的确诊起到了关键性作用 此外检测线粒体疾病标志物水平也有助于线粒体病的及时诊断 随着分子生物学和高通量测序技术的发展和应用相信未来会发现更多线粒体病致病新基因和新突变也会有更加方便和精准的技术用于线粒体病的生化检测并通过大量的临床研究发现更多可靠的线粒体疾病标志物从而提高线粒体病的诊断效率【参考文献】.:.():.:.():.():.:.():.():.():.():.():.().:.:.北京医学会罕见病分会北京医学会神经内科分会神经肌肉病学组中国线粒体病协作组.中国线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作的诊治专家共识.中华神经科杂志 ():./.:./:.:.():.:.():.:.():.:.():.:.():.:.():.():.():.:.(收稿日期:修回日期:)(本文编辑:林 赟)实用医院临床杂志 年 月第 卷第 期