戊唑醇暴露亲代斑马鱼诱发子代胚胎发育神经毒性的研究.pdf

第 卷湖北师范大学学报(自然科学版)第 期 ()戊唑醇暴露亲代斑马鱼诱发子代胚胎发育神经毒性的研究陆琪琪易 肠侯建军刘细霞邹荣华万 慧邢 达杨 晶李玉婷徐灿灿吴 琴(湖北师范大学 食用野生植物保育与利用湖北省重点实验室湖北 黄石)摘要:为了探究戊唑醇暴露亲代斑马鱼()后对子代胚胎的发育神经毒性的影响检测了子一代胚胎的发育重点指标、游泳行为及神经系统发育相关基因的表达情况结果表明:戊唑醇暴露亲代斑马鱼使 代胚胎的孵化率和存活率降低畸形率升高同时使其游泳距离和速度降低戊唑醇暴露亲代斑马鱼还导致了 代中与神经系统发育相关基因 和 显著下调 显著上调因此戊唑醇可能是通过干扰神经发育相关基因的表达来影响 代斑马鱼胚胎的神经发育关键词:戊唑醇斑马鱼母代传递毒性发育神经毒性中图分类号:.文献标志码:文章编号:():./.引言戊唑醇是一种高效、广谱的 三唑杀菌剂可用于治疗水稻、小麦、花生和蔬菜中的多种真菌感染的疾病 由于使用量大以及难降解的性质戊唑醇广泛残留于环境中 对于水生生物而言戊唑醇被认为是中等毒性物质因此戊唑醇对水生生物的毒性作用得到了广泛关注 据先前的研究发现戊唑醇对水生生物主要有生长发育毒性、生殖毒性、神经毒性以及遗传毒性等 越来越多的证据显示戊唑醇在多种生物中表现出神经毒性的特征但目前对其神经毒性机制研究仍然有限 通过分析戊唑醇暴露后蚯蚓的形态学变化和相关基因表达水平变化发现戊唑醇潜在的神经发育毒性 同样在鱼类中也发现戊唑醇暴露后会引起鱼类脑组织的组织病理学变化 在最近的一项研究中大鼠暴露于 的戊唑醇其胶质瘤细胞凋亡诱导了神经发育毒性 在体外实验中也发现戊唑醇对由多能干细胞诱导形成的神经元细胞具有显著的毒性作用 戊唑醇暴露分化的人 神经母细胞瘤细胞后其细胞线粒体受损从而引起神经毒性 综上所述戊唑醇对生物体具有强烈的神经毒性作用但其引发神经毒性的潜在分子机制仍需进行更全面的研究从而为其生态风险评估提供科学依据本研究以模式生物斑马鱼为研究对象探究戊唑醇暴露亲代斑马鱼后对子一代的神经发育的影响及其分子机制 通过统计亲代暴露后所产 代的基本指标分析戊唑醇对胚胎发育情况的影响同时还检测了子代游泳行为指标来评价戊唑醇对子代神经发育的影响 为进一步探究戊唑醇暴露亲代引发子代发育神经毒性的分子机制本研究还检测了与神经系统发育相关基因的表达水平 本研究得到的实验结果可为戊唑醇的母代传递毒性的分子机制研究提供有价值的科学依据收稿日期:基金项目:湖北省自然科学基金青年项目()湖北省教育厅中青年人才项目()湖北师范大学人才引进项目()湖北省食用野生植物保护与利用重点实验室开放项目()作者简介:陆琪琪()女湖北孝感人在读硕士研究生研究方向为水生态毒理学.通讯作者:吴 琴()女湖北黄冈人博士讲师研究方向为水生态毒理学 :.材料与方法.试验动物野生 型斑马鱼:购自中国科学院水生生物所试验前驯化四周.试验药品与仪器试验药品与仪器详见表、.表 药品信息药品厂家戊唑醇 二甲基亚砜国药集团化学试剂有限公司 试剂 公司(大连中国)试剂盒 公司(大连中国)公司(大连中国)三氯甲烷国药集团化学试剂有限公司异丙醇国药集团化学试剂有限公司乙醇国药集团化学试剂有限公司斑马鱼胚胎培养液南京一树梨花生物科技有限公司表 仪器设备仪器型号厂家斑马鱼养殖系统 托摩根()生物科技有限公司斑马鱼繁殖盒.上海海圣生物实验设备有限公司生化培养箱 型上海博讯实业有限公司医疗设备厂体视显微镜(含 显微成像系统)尼康 西安千欣仪器有限公司计时器史努比 揭阳市星华钟表有限公司斑马鱼行为轨迹跟踪系统()诺达思(北京)信息技术有限责任公司荧光定量 仪上海湛仪智能高科技中心 仪 杭州博日科技有限公司微型旋涡混合仪 型上海沪西分 析仪器厂有限公司.实验方法.戊唑醇暴露亲代斑马鱼实验戊唑醇原药用二甲基亚砜()助溶配制成浓度为/的母液 实验前先用移液器分别量取不同体积的戊唑醇母液并使用曝气水稀释配制成./、./和./的戊唑醇暴露液且暴露液中助溶剂 的终浓度不超过.同时设置.的溶剂对照组和空白对照组 戊唑醇暴露浓度是基于先前研究中所测定的 来设定的 随机选择性成熟的斑马鱼分别暴露于戊唑醇实验组(./、./和./)、空白对照组和 组中 每个浓度设置三个平行组每个平行组包含 条雌鱼和 条雄鱼 暴露期间每 更换/暴露溶液以保持溶液浓度的相对恒定.子代斑马鱼胚胎的收集与培养 暴露 后当天晚上从每个浓度组的每个平行组中随机捞取 条雌鱼和 条雄鱼置于产卵盒中并用隔板将雌、雄鱼隔开 第二天灯亮时抽取隔板使雌雄鱼接触 后收集胚胎并用干净的曝气水清洗 从每个浓度组中随机挑选胚胎置于含胚胎培养液的培养皿中培养 每 更换胚胎培养液一次 每个平行组 个胚胎每个培养皿中含有 胚胎培养液.子代斑马鱼基本指标的统计 记录 代斑马鱼存活率、孵化率、心率、畸形率、体长等发育终点指标 具体方法如下:每 统计一次各组 代斑马鱼的孵化率、存活率和畸形率至 ()共统计五次统计 斑马鱼的心率和 斑马鱼的体长 判断形态变化的方法是根据已发表的文章 收取一定数量的仔鱼()()置于冰箱保存用于后续相关实验.子代斑马鱼的运动行为分析 斑马鱼仔鱼的游泳行为分析检测是使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统()并参照先前的实验方法进行 将 仔鱼置于 孔板中适应 后采用光暗转换方法对仔鱼的游泳行为进行检测 以 为一个光/暗周期跟踪仔鱼在 变化周期(暗 亮 暗 亮 暗)内的游动轨迹、游泳速度和游泳距离等并使用相关数据处理软件进行分析.实时荧光定量 每个平行组随机取 尾仔鱼()于无 酶离心管中后加入 试剂在 下进行匀浆 接着 离心 上清液移至新的离心管中加入 的氯仿盖紧离心管用手剧烈摇荡离心管 静置 后 离心 .取 上清液移至新的离心管加入 异丙醇混匀静置 后 离心.弃去上清液加入 的 乙醇 离心 .小心弃去上清液然后室温干燥 加入适量无 酶的去离子水溶解 使用 分光光度计测定 的浓度和纯度 若/在.之间则表明 纯度较高 再将 进行一定浓度稀释后进行反转录以及荧光定量实验具体实验方法参照先前实验 以扩增循环数()值表示达到阈值的循环数 为内参使用 方法来计算各基因的相对表达水平 目的基因引物序列信息如表 所示表 神经发育相关基因的引物序列基因引物序列()基因:.数据处理实验数据使用 .(标准版本.芝加哥美国)进行分析 根据暴露浓度对每个试验组的斑马鱼进行分组收集数据并计算每个测试组数据的平均值和标准偏差测定的所有数据均表示为平均 标准误差()使用 .作图两组或两组以上的统计差异均采用单因素方差分析()以确定对照组和暴露组之间的显著差异.被认为具有统计学意义 检验实验组和对照之间差异显著性时 .为差异显著在图表中用表示(当.时标注当 .时标注)结果.戊唑醇暴露亲代对 代发育的影响如图 所示./实验组的 代斑马鱼存活率与正常值比较存在显著差异(.)说明在此浓度范围下戊唑醇暴露亲代导致 代胚胎存活率显著下降 与实验前的假设一致亲代斑马鱼暴露于一定浓度的戊唑醇可导致 代胚胎的孵化率显著降低 在图 中与对照组相比./实验组的孵化率存在显著差异(.)由图 可知 代斑马鱼胚胎发育至 时统计的心率显示各组无明显差异表明本实验浓度的戊唑醇暴露亲代对 代的心率无显著影响由图 所示与对照组相比./、./实验组中子代斑马鱼畸形率差异显著(.)由此可见戊唑醇暴露亲代导致子代畸形率显著上升且具有剂量依赖效应 在图 中与 代的心率数据类似实验组和对照组的 代斑马鱼体长无明显差异 表明本实验浓度的戊唑醇暴露亲代对 代的体长无显著影响 图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎存活率的影响 图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎孵化率的影响 图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎心率的影响 图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎畸形率的影响图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎体长的影响.戊唑醇暴露亲代对 代斑马鱼游泳行为的影响使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统()监测记录 代斑马鱼行为后实验结果与绘图及分析如下如图 所示斑马鱼仔鱼在明暗刺激下游泳行为是呈周期性变化即由黑暗时仔鱼的游泳速度明显快于明亮时 与空白对照组相比在戊唑醇暴露亲代后 代仔鱼每分钟的游泳速度显著变慢与对照组相比中高浓度(./和./)组的子代斑马鱼游泳距离显著下降(.)(图)在./戊唑醇组中子代斑马鱼的游泳距离表现为下降趋势但无统计学差异 在黑暗刺激期间(和 )和光照刺激期间()中高浓度戊唑醇的子代斑马鱼 平均游泳速度与对照组相比显著降低(.)在第二个光照刺激期间()实验组子代斑马鱼的平均游泳速度对比于对照组具有降低趋势但无统计学差异 以上数据表明亲代斑马鱼暴露于一定浓度的戊唑醇可导致子代斑马鱼行为异常图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎每分钟的平均游泳速度的影响 图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎的游泳距离的影响 图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎的平均游泳速度的影响.戊唑醇暴露亲代后对 代 仔鱼神经发育相关基因表达的影响为了弄清戊唑醇对斑马鱼的神经发育的影响我们检测了 代 仔鱼中与神经发育相关基因的表达水平 如图 与对照组相比所有戊唑醇浓度组中髓鞘碱性蛋白基因、神经元特异性 结合蛋白基因 和神经生长素基因 表达量显著性降低(.)./实验组中神经元轴突再生和发育相关的基因 显著性上调(.)./实验组中刺激轴突生长的 基因显著性下调(.)图 戊唑醇暴露亲代后对 代胚胎神经发育相关基因的影响 讨论斑马鱼胚胎在发育初期对有毒物质非常敏感鱼胚胎毒性数据和传统的鱼类急性毒性间存在良好的相关性因此斑马鱼胚胎作为毒理学动物模型的应用越来越广泛 本研究发现暴露亲代斑马鱼可导致 胚胎出现明显发育迟缓和畸形 存活率、孵化率和畸形率等是评价斑马鱼胚胎发育的终点指标是检验外源污染物对胚胎发育毒性效应的重要评价指标 与本研究结果类似 等发现戊唑醇暴露斑马鱼成鱼后可在 代胚胎中检测到戊唑醇的蓄积且戊唑醇的蓄积可影响 代斑马鱼胚胎的发育 表明亲代暴露戊唑醇可以引起 代的发育异常 综上所述戊唑醇母代传递毒性的风险不容忽视戊唑醇暴露亲代后 代幼鱼运动行为受到影响表明戊唑醇暴露亲代可能导致 斑马鱼的神经毒性 神经行为变化是斑马鱼中最常见的神经毒性终点 运动行为已被广泛用于探究斑马鱼体内有毒物质的神经行为效应的指标 多溴二苯醚、微囊藻毒素、双酚以及氯化镉等物质暴露后斑马鱼胚胎的运动行为均受到了影响 本研究中使用的光 暗转换实验方法也是常用于斑马鱼对有毒有害物质的行为反应研究中 先前的研究已证明戊唑醇能影响斑马鱼成鱼或幼鱼的行为 本研究结果显示戊唑醇暴露亲代斑马鱼可影响 代仔鱼的游泳行为造成 代的游泳速度显著变慢 表明戊唑醇对运动行为的影响具有母代传递效应 游泳速度的降低反映着生物对外界刺激的适应也是毒性物质引发神经系统功能缺陷的标志 如胚胎暴露于纳米二氧化钛后检测到斑马鱼幼鱼行为异常 综上所述戊唑醇暴露亲代可引发 代胚胎的发育神经毒性中枢神经系统发育的异常是导致斑马鱼神经行为活动改变的重要原因 为了探究戊唑醇诱导的发育神经毒性的母代传递效应的潜在机制本研究还检测了与中枢神经系统发育相关的基因表达的变化 这些基因分别有 、和 其中本研究发现、和 基因在戊唑醇暴露亲代后在 代中显著下调然而 基因显著上调 基因编码的 蛋白是一种 结合蛋白它在神经元发育和个体行为方面起着重要的作用 由 基因是一种在神经前体细胞中表达控制神经前体细胞发育成神经细胞广泛参与了神经和肌肉的形成 基因的下调说明了戊唑醇的母代传递会引起 代神经细胞的形成受阻 基因可表达产生一种具有维持神经前体细胞正常形态的作用增加神经细胞的弹性和伸缩性的中间丝蛋白 在本实验中 代中 基因表达下调说明戊唑醇的母代传递影响了 代神经细胞的形成 基因编码的蛋白属于微管细胞骨架是斑马鱼幼体发育阶段特别是神经系统形成阶段所必须的 基因表达上调可能是对子代中基因的下调的补偿性反馈 然而 基因表达异常则说明亲代暴露于戊唑醇会影响 代胚胎中神经轴突髓鞘的形成 以上基因在神经细胞发育以及在维持细胞骨架形态中均发挥着重要作用 从以上研究结果可知戊唑醇可能是通过影响子代神经细胞骨架和轴突发育干扰神经元的形成进而诱发 代的神经发育毒性本研究发现亲代斑马鱼暴露于环境相关浓度的戊唑醇后 代胚胎的发育受到严重抑制且 代的游泳行为受到显著影响表明戊唑醇暴露亲代会引起 代发育神经毒性 通过对 代中与神经发育相关的基因表达的检测后发现戊唑醇的母代传递可能是通过干扰 代胚胎中与神经发育相关的基因表达诱发子代神经发育毒性 本研究可为其它三唑类农药的毒性评估以及使用提供科学依据参考文献:.:.():.().():.().:.:.().:.().:.:.:.().():.():.:.():.().:.():.彭 涛王思思任琳等.磷酸三苯酯对斑马鱼早期生命阶段的神经毒性研究.生态毒理学报():.:.():.:.().():.():.().().:.():.张巧梅谢亚宁王强.基因家族对疾病治疗前景的研究进展.中华神经外科疾病研究杂志():.郝永楠赵伟佳.的研究进展.广西医科大学学报():.():.():().: