DB32／T 4677—2024 周丛生物综合调查与分析测试技术规程.pdf

!7,江苏省市场监督管理局发布中 国 标 准 出 版 社出版周丛生物综合调查与分析测试技术规程Technical code of practice for survey，analysis and determination of periphyton2024-02-05 发布2024-03-05 实施CCS Z 06DB32/T 46772024ICS 13.020.01DB32/T 46772024前言1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 采样点位布设24.1 布点原则24.2 布点前期准备24.3 布点要求35 样品采集与保存45.1 材料和器具45.2 样品采集45.3 样品的处理与储存56 物理指标分析测试56.1 覆盖度测定56.2 厚度测定66.3 二维形态表征76.4 三维结构表征77 化学指标分析测试87.1 总有机碳、总无机碳和总碳含量87.2 总氮、氨氮、亚硝态氮和硝态氮含量97.3 磷含量97.4 钾含量107.5 钠含量107.6 钙、镁含量117.7 硫含量117.8 铁含量117.9 锰含量127.10 铜含量127.11 锌含量137.12 钼含量137.13 硅含量137.14 氯含量14目 次DB32/T 467720247.15 硼含量148 生物指标分析测试158.1 微生物组成和多样性158.2 磷脂脂肪酸群落结构158.3 胞外聚合物178.4 生物量188.5 叶绿素含量18附录 A（资料性）周丛生物采样点位信息记录表19附录 B（资料性）周丛生物原位采样器20附录 C（资料性）周丛生物野外采样记录21DB32/T 46772024前言本文件按照 GB/T 1.12020 标准化工作导则第 1 部分：标准化文件的结构和起草规则 的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由全国土壤质量标准化技术委员会提出并归口。本文件起草单位：中国科学院南京土壤研究所、中国环境科学研究院、中国科学院水生生物研究所、河海大学、南京林业大学、中国科学院亚热带农业生态研究所、江苏省农业科学院。本文件主要起草人：吴永红、孙朋飞、徐滢、周蕾、刘俊琢、陆海鹰、李丹、王思楚、陈志浩、王凯、周晴晴、陶静、李庭芳、刘凌佳、韩燕云、吴丽蓉、金泽凡、相棣、李志福、罗华溢、刘苏贤、孙宇婷、卢少勇、吴辰熙、李九玉、夏永秋、佘冬立、沈健林、张松贺、冯彦房。DB32/T 46772024周丛生物综合调查与分析测试技术规程1 范围本文件规定了周丛生物调查点位布设、样品采集与保存以及物理、化学和生物指标分析测试的要求。本文件适用于稻田、沟渠、河流、水库、湖泊等湿地或浅水水体中周丛生物采样点的布设、采集、保存以及物理、化学和生物性质的定量表征或测试分析。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 30988多酚类植物基因组 DNA 提取纯化及测试方法GB/T 30989高通量基因测序技术规程GB/T 33834微束分析扫描电子显微术生物试样扫描电子显微镜分析方法GB/T 35871粮油检验谷物及其制品中钙、钾、镁、钠、铁、磷、锌、铜、锰、硼、钡、钼、钴、铬、锂、锶、镍、硫、钒、硒、铷含量的测定电感耦合等离子体发射光谱法DZ/T 0279.27区域地球化学样品分析方法第 27 部分：有机碳量测定重铬酸钾容量法HJ 634 土壤氨氮、亚硝酸盐氮、硝酸盐氮的测定氯化钾溶液提取分光光度法HJ 897水质叶绿素 a 的测定分光光度法HJ/T 345水质铁的测定邻菲啰啉分光光度法JY/T 0586 激光扫描共聚焦显微镜分析方法通则LY/T 1246森林土壤交换性钾和钠的测定LY/T 1250森林土壤碳酸钙的测定LY/T 1270森林植物与森林枯枝落叶层全硅、铁、铝、钙、镁、钾、钠、磷、硫、锰、铜、锌的测定NY/T 88土壤全磷测定法NY/T 149土壤有效硼测定方法NY/T 1378土壤氯离子含量的测定NY/T 2017植物中氮、磷、钾的测定NY/T 3030棉花中水溶性总糖含量的测定蒽酮比色法SN/T 3926出口乳、蛋、豆类食品中蛋白质含量的测定考马斯亮蓝法3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1 周丛生物 periphyton淹水环境下附着生长于固体基质表面的藻类、细菌、原生动物和后生动物等微生物及其代谢产物和1DB32/T 46772024有机碎屑交织在一起形成的聚合体。3.2 周丛生物覆盖度 periphyton coverage单位面积内附着生长在基质表面的周丛生物面积占总面积之比。注：一般用百分数表示。3.3 周丛生物粗糙度 periphyton roughness周丛生物表面孔隙和空隙占整个体积的比例。3.4 周丛生物多样性 biodiversity of periphyton周丛生物内显著不同的种群之间以及同一种群内的遗传变异，涉及周丛生物中多种多样活的有机体（藻类、细菌、原生动物和后生动物）的种类、数量及其在周丛生物中的分布信息。3.5 周丛生物胞外聚合物 extracellular polymeric substances（EPS)of periphyton在一定环境条件下由周丛生物内细菌、微藻等微生物分泌于细胞外的主要由多糖、蛋白质和核酸等组成的大分子聚合物。3.6 周丛生物生物量 biomass of periphyton某一时间段内单位面积或单位体积内周丛生物实存生活的有机物质（干重）总量。注：通常用 g/cm2或 g/cm3表示。4 采样点位布设4.1 布点原则4.1.1 科学性原则采样点位应具有典型性和代表性，能充分满足调查评估工作的目标要求，能真实反映水域生态系统中周丛生物真实分布情况。4.1.2 系统性原则布设点位宜涵盖调查区域范围内周丛生物可能分布的类型，采样点数量宜满足统计学要求。4.1.3 重点性原则宜把调查区域内水域生态系统及稻田作为调查重点区域。周丛生物生物量、性质、水动力和生境差异较大时，宜提高点位布设密度。4.1.4 持续性原则布设点位确定后宜长期保持固定。4.2 布点前期准备4.2.1 背景调查了解调查区域稻田、沟渠、池塘、河流和水库等水系分布信息及土壤、地形、灌溉、施肥、水文、气候等2DB32/T 46772024背景信息，采样点位信息表详见附录 A。4.2.2 人员组织组织具有相关专业背景的人员，明确任务分工，对人员做好观测方法和野外操作规范的工作培训。加强野外调查安全培训工作，提高相关人员安全意识。4.3 布点要求4.3.1 农田生态系统布点4.3.1.1 稻田布点对于同一调查区域的稻田点位布设，应包含集约农业区、传统自耕区、重要水体上下游及附近的稻田，每类稻田至少布设 3 个采样点。若调查区域的稻田不存在差异化分布，布设点位的稻田应涵盖调查区域的流域范围，东南西北主要方位均有设点。尽量选择具有一定规模的连片稻田，避免将点位布设在6 667 m2（10 亩）以下孤立的小块稻田。稻田面积小于 66 667 m2（100 亩）的设 35 个点位，66 667 m2 666 667 m2（100 亩1 000 亩）的设 46 个点位，666 667 m2（1 000 亩）以上的设 610 个点位。稻田点位避免距离田垄较近的受人为扰动频繁的区域，尽量靠近稻田中心位置等相对稳定的地段。对于多个点位同时布设在同一稻田的情况，主要依据均匀随机布点的原则，根据周丛生物生长情况等进行实地调整，点位相互间距离应大于 5 m。4.3.1.2 沟渠布点沟渠点位应与稻田点位相对应，在每条沟渠中段布设 12 个点位，或布设不超过对应稻田样点数的点位。4.3.2 浅水生态系统布点4.3.2.1 河流布点在河流上、中、下游，干、支流，以及干支流汇合点处均应设置点位。同一干/支流上任意两个相邻点位间的地理距离应大于 5 km，若河流较短，则采样点位应至少设置 3 个，覆盖河流的上、中、下游，宜包括不同生境（如浅滩、深潭、激流区、湍流区、缓流区、回水区、过渡区等）。4.3.2.2 池塘布点将点位布设在池塘的水陆交错带附近，水域面积小于 6 667 m2（10 亩）设 12 个点位，6 667 m220 000 m2（10 亩30 亩）设 23 个点位，大于 20 000 m2（30 亩）设 36 个点位。点位可围绕池塘均匀布设，但应覆盖进水区、出水区和池塘湾区。4.3.2.3 水库布点将点位布设在水库的水陆交错带附近，水域面积小于 10 km2设 35 个点位，10 km250 km2设 46个点位，大于 50 km2设 58 个点位，超过 100 km2设 1020 个点位。点位可围绕水库均匀布设，但应覆盖进水区、出水区和水库中段。4.3.2.4 湖泊布点根据湖泊水体形态特点、水文状况和周丛生物的分布特征以及水体受干扰状况等因素，将湖泊区域划分成相对均质的敞水区、湖滨带，污染区或相对清洁区等，每个小区内设置 13 个有代表性的点位，主3DB32/T 46772024要分布在湖滨带。对于均质化程度较高的湖泊，可按照水库布点方法均匀设置点位。4.3.2.5 湿地布点对于非均一地面的湿地，每类设置 13 个点位。对于均一地面的湿地，点位布设应在区域内进行简单随机抽样代替整体分布，面积小于 1 km2设 35 个点位，面积 1 km210 km2设 58 个点位，面积大于10 km2可按照水库布点方法均匀设置点位。5 样品采集与保存5.1 材料和器具5.1.1 主要材料蒸馏水或同等纯度的水、冰袋和液氮等。5.1.2 主要器具金属刮刀、镊子、短尺、样品袋或样品瓶、聚乙烯样品袋或螺纹盖玻璃瓶、一次性无菌手套、GPS 定位仪、温度计和便携 pH 计等。5.2 样品采集5.2.1 采样计划制定要点5.2.1.1 确定采样基质根据生境类型或沟渠、河流底质，确定周丛生物附着的基质。池塘、水库、湖泊以近水岸的无机基质（如石头等）和有机基质（如水生植物等）作为周丛生物附着基质，稻田以表层土壤作为周丛生物附着基质。不同基质上的样品分开收集保存。5.2.1.2 确定样品数每份样品保证取至少 3 个平行样品。5.2.2 采样时间和采样频率5.2.2.1 农田生态系统采样时间和频率水稻移栽后每月采集样品一次，移栽后第一个月可半月采集一次。农田沟渠周丛生物采样时间和频率与稻田采样相对应。5.2.2.2 浅水生态系统采样时间和频率河流、池塘、湖泊、水库、湿地等生境的周丛生物宜按季节或丰、平、枯水期开展采样。采样时间间隔宜相同，选择一天中的同一时段。5.2.3 样品采集方法5.2.3.1 确定采样容积每个样点采集的周丛生物容积应保持一致。混合采样应根据混合点数量确定每点采集量。4DB32/T 467720245.2.3.2 采样顺序需采集周丛生物上覆水或下层土壤样品时，应先采集水样后再采集周丛生物和土壤样品。5.2.3.3 样品刮取使用镊子或刮刀等工具从水下浸没的介质，包括稻田土壤、水生植物、石块表面剥离周丛生物，并移至聚乙烯采样袋内。5.2.3.4 原位厚度检测利用原位采样器对周丛生物进行原位厚度检测和固定，原位采样器可参考附录 B。5.2.3.5 器具清洗应及时清洗所有接触过样品的采样器具，使用前使用 0.1 mol/L 盐酸溶液消毒。5.2.4 样品标识和记录5.2.4.1 样品标识在样品袋或样品瓶外侧标注样品编号、采样日期、水体名称、采样点位、采样人姓名。5.2.4.2 样品记录采样现场应记录样品经纬度、生境情况等信息，记录表格可参考附录 C。5.3 样品的处理与储存5.3.1 样品储存容器5.3.1.1 常规样品保存周丛生物一般常用聚乙烯袋存储。5.3.1.2 特殊样品保存有机物污染的周丛生物宜采用带有螺纹盖的玻璃瓶。5.3.2 样品运输和储存5.3.2.1 从田间采样到进行分析之前宜储存在 0 4 的保温箱中。5.3.2.2 运输中应仔细存放样品，以确保样品无破损、样品之间无污染。避免强光照射及强烈震动。5.3.2.3 周丛生物样品运至实验室后，分析物理指标的样品应风干或储存于 4，分析化学指标的样品应进行液氮处理并储存于-20，分析生物指标的样品应进行液氮处理并储存于-80。6 物理指标分析测试6.1 覆盖度测定6.1.1 被测点选定在拟开展调查的生境内，随机选定观测点，点与点之间间距为 15 m30 m。观测点数参照第 4 章5DB32/T 46772024执行。6.1.2 针刺法测定覆盖度覆盖度应在采样现场测定。将 1 m2的被测点方框以间隔网格线方式划分为 10 cm10 cm，15 cm15 cm，20 cm20 cm 三种不同格网密度，并重复该过程 5 次10 次，取均值作为该被测点的最终结果。6.1.3 覆盖度计算测量每个随机被测点的覆盖面积，求取平均值，然后乘以总的稻田面积得到所测稻田的周丛生物面积。覆盖度为周丛生物面积占稻田总面积之比，一般用百分数表示。覆盖度（PBC）计算见公式（1）：PBC=SAveragecoverage STotalareaSTotalarea 100（1）式中：SAveragecoverage被测点（1 m2）内覆盖面积的平均值，单位为平方米（m2）；STotalarea所研究稻田区域的总面积，单位为平方米（m2）。6.2 厚度测定6.2.1 材料与设备6.2.1.1 主要试剂：蒸馏水或同等纯度的水、二甲基亚砜溶液、绿色荧光核酸染料、0.9%氯化钠溶液（生理盐水）和抗荧光淬灭封片剂等。6.2.1.2 主要材料：载玻片、盖玻片、培养皿、吸水纸、离心管和锡箔纸等。6.2.1.3 主要设备：激光扫描共聚焦显微镜等。6.2.2 测定步骤6.2.2.1 样品制备6.2.2.1.1 用镊子取小块新鲜的周丛生物于洁净载玻片，并放置于洁净的培养皿中，用 0.9%氯化钠溶液（生理盐水）轻柔洗去表面残余培养液和杂质。6.2.2.1.2 染料的配制：取洁净离心管，用锡箔纸包紧，向其中加 1 mL 二甲基亚砜溶液，取 1.5 L 绿色荧光核酸染料加入二甲基亚砜溶液中，振荡混匀，待用。6.2.2.1.3 加 200 L 染料于载玻片上，确保整个片子被染料液覆盖，用锡箔纸包起放有载玻片的培养皿，染色 20 min30 min 后，取出载玻片，并将其边缘液体吸干，加 10 L 抗荧光淬灭封片剂到洁净的盖玻片上，将盖玻片放置于周丛生物上压紧，并排除气泡，确保视野清晰不流动。将制备好的片子用锡箔纸包好，用激光扫描共聚焦显微镜观察。6.2.2.2 激光扫描共聚焦显微镜成像激光共聚焦扫描显微镜对染色周丛生物进行显微观察和图像采集，用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描限制在周丛生物样品的一个平面内。调焦深度不一样时，可以获得周丛生物不同深度层次的图像。激光扫描共聚焦显微镜分析方法应按照 JY/T 0586 要求分析。6.2.2.3 最大厚度测定对周丛生物样本由内（周丛生物与玻片相贴面）向外（周丛生物游离面）沿三维坐标系 Z 轴逐层水平扫描，步距 14 m，当出现 2 个连续的水平层面，Z 轴距离较小的水平层面上能够观察到周丛生物结构，Z轴距离较大的水平层面上不能够观察到周丛生物结构，则后一水平层面的 Z 轴距离为周丛生物最大厚6DB32/T 46772024度（单位为 m）。6.3 二维形态表征6.3.1 材料与设备6.3.1.1 主要试剂：蒸馏水或同等纯度的水、2.5%戊二醛溶液、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=7.4）和1%锇酸固定液等。6.3.1.2 主要材料：盖玻片、滤膜、吸水纸和离心管等。6.3.1.3 主要设备：冷冻干燥机和扫描电子显微镜等。6.3.2 测定步骤6.3.2.1 样品制备6.3.2.1.1 取适量周丛生物展片于盖玻片或滤膜上，用 2.5%戊二醛溶液固定 2 h，0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=7.4）漂洗三次，每次 10 min，再用 1%锇酸固定液固定 1 h2 h，固定结束再重复磷酸盐缓冲液漂洗过程。6.3.2.1.2 将固定好的周丛生物样品冷冻干燥处理，以接近于物质的自然状态直接放到扫描电镜中进行观察。6.3.2.1.3 若观察割裂面结构，应根据需求从不同角度切割周丛生物样品。6.3.2.1.4 若试样导电性弱时，一般选择镀膜处理。通常情况选择镀金（Au）膜，如果对分辨率有较高的要求，可以选择镀铂（Pt）、铬（Cr）、铱（Ir）。如果要对样品进行严格的化学定量分析，则不能镀金属膜，因为金属膜对 X 射线有较强的吸收，对定量有较大影响，可选用蒸镀碳膜。6.3.2.2 扫描电子显微镜成像应按照 GB/T 33834 要求进行扫描电子显微镜成像。6.4 三维结构表征6.4.1 材料与设备6.4.1.1 主要试剂：蒸馏水或同等纯度的水、0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=7.4）等。6.4.1.2 主要材料：载玻片、滤膜和吸水纸等。6.4.1.3 主要设备：激光扫描共聚焦显微镜。6.4.2 测定步骤6.4.2.1 样品制备取小片新鲜周丛生物或直接剪切至所需大小置于洁净载玻片上，用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液（pH=7.4）漂洗三次，每次 10 min，以除去杂质。6.4.2.2 三维结构成像激光扫描共聚焦显微镜观察周丛生物样品并采集不同层面图像，构建三维图像。激光扫描共聚焦显微镜分析方法参照 JY/T 0586。7DB32/T 467720246.4.3 注意事项6.4.3.1 扫描过程耗时较长，而且只能扫描不动的微生物，许多活动的大型微生物，例如周丛生物中原生动物等，因运动比较剧烈而会对成像造成一定的影响。6.4.3.2 某些环境杂质可能会对某些活体细胞的活性造成一定的负面影响。在样品制备中尽可能清洗干净，同时适当地调整激光的光强，用最弱的光对样品进行照射扫描。7 化学指标分析测试7.1 总有机碳、总无机碳和总碳含量7.1.1 测定方法7.1.1.1 应按照 DZ/T 0279.27 要求测定总有机碳含量。7.1.1.2 应按照 LY/T 1250 中的气量法要求测定总无机碳含量。7.1.1.3 总碳的含量为总有机碳和总无机碳的含量之和。7.1.2 样品预处理7.1.2.1 总有机碳：新鲜周丛生物样品采集后，用去离子水洗净，再用普通滤纸滤干水后，60 条件下，烘干 8 h，得到周丛生物干样。再将周丛生物干样经研磨后，经过 60 目（0.25 mm）筛孔筛分后，精确称取0.5 g（精准到 0.1 mg），用长条硫酸纸将样品置于干燥的硬质玻璃试管内，并加入 0.1 g 粉末状硫酸银。用移液管加入 5 mL 重铬酸钾标准溶液，然后用移液管注入 5.0 mL 浓硫酸，摇匀，待测。7.1.2.2 总无机碳：称取通过 60 目（0.25 mm）筛孔的周丛生物干样 0.5 g10 g 于 250 mL 锥形瓶中。用蒸馏水润湿样品、瓶口和瓶壁，并向弯曲小试管中注入约 10 mL 3 mol/L 的盐酸溶液，再将其放入锥形瓶中，塞紧。7.1.3 注意事项7.1.3.1 总有机碳7.1.3.1.1 测定周丛生物有机质应采用风干样品，若未风干样品含有较多的 Fe2+、Mn2+及其他还原性物质消耗重铬酸钾，可使结果偏高。试验前将样品磨细铺开，在室内通风处风干约 10 d。7.1.3.1.2 本方法不适用于含氯较高的样品，若样品含有少量的氯则可以加少量 Ag2SO4（约 0.1 g），使氯离子沉淀以去除其测试干扰。7.1.3.1.3 加热时产生的二氧化碳气泡不是真正的沸腾，待溶液表面沸腾开始计时煮沸 5 min。7.1.3.1.4 转移试管溶液时，应用少量蒸馏水进行冲洗，勿损失溶液。7.1.3.1.5 滴定亚硫酸铁消耗量若小于空白试验的 1/3 时，有未完全氧化的可能，应舍去重做。7.1.3.2 总无机碳7.1.3.2.1 周丛生物中的碳酸盐主要以碳酸钙为主，但也有的碳酸盐以碳酸钙-碳酸镁和碳酸氢盐等存在，不过都表示为 CaCO3或者 CaCO3CO2（g kg-1）。7.1.3.2.2 为防止误差较大，试验前应检测气密性。7.1.3.2.3 可用蒸馏水湿润样品和锥形瓶瓶壁，以缓解碳酸盐和盐酸反应产热的影响，也有助于瓶内的水气压平衡。7.1.3.2.4 操作过程中避免用手直接触碰反应器，防止因手的热量使气体膨胀，产生误差。8DB32/T 467720247.1.3.2.5 测量过程中要随时调整量气管的液面与水准器的液面相平，勿相差太大。7.2 总氮、氨氮、亚硝态氮和硝态氮含量7.2.1 测定方法7.2.1.1 按照 NY/T 2017 中的凯氏消煮法要求测定总氮含量。7.2.1.2 按照 HJ 634 中的氯化钾溶液提取分光光度法要求测定氨氮、亚硝态氮和硝态氮含量。7.2.2 样品预处理7.2.2.1 样品采集无菌硅胶刮刀将周丛生物从附着的载体上轻轻剥离，样品采集后用冰袋保存，保持 4 运输保存，并在 3 d 内完成分析，否则需要储存于-20 和-80 冰箱中保存。新鲜样品清洗后，用吸水纸吸干表面水分，留存备测。7.2.2.2 样品消解称取周丛生物干样品 0.100 g0.500 g（精确到 0.001 g）于 100 mL 消煮管中，加入 3 mL 浓硫酸，再加入 1.1 g 催化剂，加盖回流漏斗，置于消煮炉加热，待没有泡沫时，适当提高温度，微微煮沸，使得固体完全消失成为溶液，最终消煮液澄清透亮，呈现灰白色。消煮液冷却后待用。7.2.2.3 样品破碎称取新鲜周丛生物干样品 0.100 g0.500 g（精确到 0.001g）于 100 mL 消化管，加入 3 mL 氯化钾溶液，然后在冰浴中进行超声破碎处理，超声强度 200 W，超声时间 3 s，间隔 10 s，重复 30 次。破碎后，将其转入 50 mL 聚乙烯离心管中，在 3 000 r/min 条件下，离心 10 min，将上清液保存至比色管中，待测。7.2.3 注意事项7.2.3.1 在重复性条件下获得的三次独立测试结果的绝对误差不应超过算术平均值的 7%。7.2.3.2 每批样品应测定 10%的加标样品。氨氮加标回收率应在 80%120%之间；亚硝酸盐氮加标回收率应在 70%120%之间；硝酸盐氮加标回收率应在 80%120%之间。7.2.3.3 还原柱中的镉粉在使用前需要检验其还原性。7.3 磷含量7.3.1 测定方法应按照 NY/T 88 中的氢氧化钠熔融钼锑抗比色法要求测定总磷含量。7.3.2 样品预处理精准称取 0.250 0 g 通过 60 目（0.25 mm）筛的烘干（一般为 60 左右）的周丛生物干样，轻轻放置于镍或银坩埚底部，避免将样品沾在坩埚壁上，加入几滴无水乙醇稍微湿润样品，加 2.0 g（为样品的 8 倍）固体氢氧化钠在样品表面铺平整，放置在干燥器中，以防吸湿潮解。将坩埚放入高温电炉中，由室温升到300，保温 30 min，再升温至 750，保温 15 min，后冷却坩埚，在坩埚中加 10 mL 蒸馏水，放在电炉上加热至 80 左右，熔块溶解后再煮沸 5 min，然后将坩埚内的溶液转入 50 mL 容量瓶中，用热蒸馏水及2 mL 硫酸多次洗涤坩埚并倒入容量瓶内，尽量不要使总体积超过 40 mL。然后往容量瓶中加 5 滴 1 1盐酸溶液及 5 mL 硫酸溶液，轻轻振荡，静置冷却至室温，加蒸馏水定容至 50 mL，摇匀后静置至澄清或9DB32/T 46772024用无磷滤纸过滤，滤液贮于 50 mL 三角瓶中，待测。同时做至少两个空白试验。7.3.3 注意事项7.3.3.1 在用氢氧化钠熔融样品时，为防止溅跳现象，一般从低温开始，逐渐脱水后，再高温加热。7.3.3.2 若使用银坩埚进行试验，需注意控制温度，银坩埚在 960 时会融化。7.3.3.3 熔融完全的熔块冷却后会凝结，并呈现出淡蓝色或蓝绿色，如熔块呈棕黑色则表示还没有熔融完全，应再按熔融的步骤再熔一次。7.3.3.4 钼锑抗法要求显色液中硫酸浓度为 c（1/2H2SO4）=0.55 mol L-1。如果酸度小于 c（1/2H2SO4)=0.45 mol L-1，显色时间缩短，但稳定时间变得较短；如果酸度大于 c（1/2H2SO4)=0.65 mol L-1，显色时间延长。如果不确定待测液中的原有酸度，要先中和处置。7.3.3.5 钼锑抗法显色温度在 15 60，如室温未达到 15，可放置在 30 40 烘箱中保温30 min，冷却后比色。7.4 钾含量7.4.1 方法原理、主要仪器、试剂、测试步骤应按照 NY/T 2017 中的电感耦合等离子体质谱法要求测定钾含量。7.4.2 样品预处理用无菌硅胶刮刀将周丛生物从附着的载体上轻轻剥离，样品采集后用冰袋保存，保持 4 运输保存，并在 3 d 内完成测试分析，否则需要储存于-20 和-80 冰箱保存。将待测的周丛生物样品干燥后研磨，过 60 目（0.25 mm）筛，称取均匀干样 0.1 g0.5 g（精确到 0.000 1 g）于 100 mL 试管内待测。7.4.3 注意事项7.4.3.1 本方法的检出限为 70 g kg-1。7.4.3.2 在重复性条件下，获得的两次独立测定结果的绝对值不应超过算术平均值的 15%。7.5 钠含量7.5.1 测定方法按照 LY/T 1246 中的火焰原子吸收光谱法要求测定钠含量。7.5.2 样品预处理首先，将铝盒 60 下烘干至恒重，称重。然后准确称取 2 g3 g 新鲜周丛生物，用普通滤纸滤干后，置于坩埚中，100 下烘干（8 h）。冷却至室温，称重，计算周丛生物含水率。取适量干周丛生物样品碾碎混匀，并过 60 目（0.25 mm）筛后放入封口袋中，备用。7.5.3 注意事项7.5.3.1 仪器校准：在进行火焰光度测定前，需要对光度计进行校准，以确保测定结果的准确性。通常，会使用标准溶液进行校准。7.5.3.2 激发条件：火焰温度要适当，温度过低灵敏度下降，温度太高则碱金属电离严重，影响测量的线性关系。10DB32/T 467720247.6 钙、镁含量7.6.1 测定方法按照 GB/T 35871 要求测定钙、镁含量。7.6.2 样品预处理准确称取通过 60 目（0.25 mm）孔径筛的周丛生物干样 0.2 g，加入 10 mL 浓硫酸，并在通风橱中加热消煮，等瓶内硫酸开始冒白烟后，继续加热 5 min，然后静置冷却。等管内温度冷却至 70 左右，再逐滴滴加 10 滴过氧化氢溶液，滴加时应缓慢滴加，避免容器气压过高。利用强酸的氧化性与酸性，使周丛生物中的有机物质完全分解、氧化，呈气态逸出，分析物质及共存离子转化为无机物状态，以稳定的化学形式存在于澄清溶液中。7.6.3 注意事项7.6.3.1 单一的氧化性酸不易将样品分解完全，且在操作中容易产生危险，因此在日常工作中多将两种或两种以上的强酸或氧化剂联合使用，使有机物质能快速而又平稳地消解。7.6.3.2 元素含量小于 0.1 g g-1时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 20%。7.6.3.3 元素含量在 0.1 g g-11 g g-1时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 15%。7.6.3.4 元素含量大于 l g g-1时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 10%。7.7 硫含量7.7.1 测定方法按照 LY/T 1270 要求测定硫含量。7.7.2 样品预处理用无菌硅胶刮刀将周丛生物从附着的载体上轻轻剥离，样品采集后用冰袋保存，保持 4 运输保存，并在 3 d 内完成分析，否则需要储存于-20 和-80 冰箱保存。将待测的周丛生物样品干燥后研磨，称取约 0.2 g0.5 g（精确到 0.000 1 g），加入 150 mL 高型锥形瓶中待测。7.7.3 注意事项在重复性条件下，任意两次独立测定结果的绝对差值需小于或等于算术平均值的 10%。7.8 铁含量7.8.1 测定方法应按照 HJ/T 345 的要求测定总铁和亚铁（二价铁离子）含量。三价铁离子的浓度为总铁的浓度减去二价铁离子的浓度。7.8.2 样品预处理7.8.2.1 亚铁（二价铁离子）：准确称取 5.0 g 干重的周丛生物（提前测定含水量）于锥形瓶中，加入浸提剂11DB32/T 46772024100 mL，摇匀振荡（5 min，120 r/min），离心（5 min，8 000 r/min）获得上清液。7.8.2.2 总铁：称取干重为 5 g 的新鲜周丛生物样品，60 烘干 8 h，将烘干的周丛生物样品在瓷研钵中碾磨过 60 目（0.25 mm）筛，称取适量过筛后周丛生物样品置于石英坩埚中，在电炉上加热使其碳化，再移入高温电炉，在 500 下继续加热 2 h3 h，灰化完成，待其冷却后，加入 5 mL 稀硝酸溶液（1 1）溶解灰分，将溶液全部转移入 50 mL 容量瓶中，加入蒸馏水定容至刻度线，最后再用 0.45 m 滤纸过滤，得到澄清滤液，进行下一步总铁含量的测定。7.8.3 注意事项新鲜周丛生物从培养基取出后，应尽快测量，没有用完的样品勿放回培养基，以免造成污染。7.9 锰含量7.9.1 测定方法应按照 GB/T 35871 要求测定锰含量。7.9.2 样品预处理准确称取 5 g 的周丛生物干样，置于 150 mL 锥形瓶中，加入 30 mL HNO3HClO4酸混合溶液（HNO3与 HClO4的体积比为 5 1），不要晃动锥形瓶，可在锥形瓶上方放一个漏斗，在漏斗中放一颗稍大于漏斗口径的玻璃珠，以减少静置过程中溶液的挥发以及消煮过程中溶液的蒸发，将加完酸的溶液静置于通风橱中过夜。在通风橱中，把静置一夜后的锥形瓶置于调温板或调温炉上加热消煮 5 h 左右（温度应控制在能让消煮液微沸），消煮过程中会产生棕色二氧化氮气体（戴带上护具，注意防护），当不再产生棕色气体时，逐渐升温，将溶液加热至几乎被蒸干。冷却过后，将溶液及不溶性颗粒物全部转移至 50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容后，再用 0.45 m 滤纸过滤，得到澄清滤液，待测。7.9.3 注意事项单一的氧化性酸不易将样品分解完全，且在操作中容易产生危险，因此，在日常工作中多将两种或两种以上的强酸或氧化剂联合使用，使有机物质能快速而又平稳地消解。7.10 铜含量7.10.1 测定方法应按照 GB/T 35871 要求测定铜含量。7.10.2 样品预处理在锥形瓶中加入周丛生物干样 0.500 g1.000 g（精确到 0.000 1 g），然后加入 30 mL 提前制备的混合酸，盖上表面皿，以减少沸腾过程中的蒸发。调节电热板温度以保持锥形瓶中的液体沸腾，锥形瓶中会出现大量 NO2棕色气体。当不再释放 NO2气体时升高温度，至消化液澄清透明（无色或微黄色）。如果消化液变成深棕色，滴入少量硝酸，此时消化液释放白色烟，消化液的颜色进一步转变为无色透明，抑或是转变成微黄色时，将消化液静置至冷却，待测。7.10.3 注意事项7.10.3.1 单一的氧化性酸不易将样品分解完全，且在操作中容易产生危险，因此，在日常工作中多将两种或两种以上的强酸或氧化剂联合使用，使有机物质能快速而又平稳地消解。12DB32/T 467720247.10.3.2 在重复性条件下对周丛生物中的铜含量进行两次独立的测定，计算两次测定的周丛生物中的铜含量的绝对差值和算术平均值，绝对差值不能超过算术平均值的 20%。7.10.3.3 此方法中所使用的试剂的纯度均为优级纯（GR）。7.10.3.4 此方法中所用的水为去离子水或重蒸馏水。7.11 锌含量7.11.1 测定方法按照 LY/T 1270 要求测定锌含量。7.11.2 样品预处理称取过 60 目（0.25 mm）筛的烘干周丛生物样品 1.000g 于 50 mL 三角瓶中，以少量水润湿，加入8 mL 浓硫酸，振荡或放置过夜（优选）后，滴加 10 滴高氯酸，摇匀，瓶口放一小漏斗，置于电炉上加热消煮至瓶内液体开始转白后，继续消煮 20 min，全部消煮时间为 45 min60 min，将冷却后的消煮液用去离子水洗入 100 mL 容量瓶中，冲洗时用水应少量多次，轻轻摇动容量瓶，蒸馏水定容，用干燥漏斗和滤纸滤入干燥的 100 mL 三角瓶中。7.12 钼含量7.12.1 方法原理、主要仪器、试剂、测试步骤应按照 GB/T 35871 要求测定钼含量。7.12.2 样品预处理称取过 60 目（0.25 mm）筛的烘干周丛生物样品 1.000g 于塑料瓶中待用。7.12.3 注意事项7.1.2.3.1 钼含量小于 0.1 mg/kg 时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 20%。7.12.3.2 钼含量在 0.1 mg/kg1 mg/kg 时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 15%。7.12.3.3 钼含量大于 1 mg/kg 时，在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不应超过算术平均值的 10%。7.13 硅含量7.13.1 测定方法应按照 LY/T 1270 要求测定硅含量。7.13.2 样品预处理称取过 60 目（0.25 mm）筛的烘干周丛生物样品 1.000 g（精确至 0.000 1 g）于 50 mL 锥形瓶中待用。7.13.3 注意事项7.13.3.1 如周丛生物样品含铁较多，可先用 100 g L-1盐酸洗涤沉淀，以免滤液体积过大。7.13.3.2 整个二氧化硅分离过程要连续操作，不可加热煮沸，要保持漏斗处于温热状态，并防止滤纸13DB32/T 46772024穿孔。7.13.3.3 检查 Fe3+表示已洗净：在白瓷比色板凹槽中，接一滴滤液，加一滴 100 g L-1硫氰化钾，溶液呈红色表示有 Fe3+存在，无色表示已洗净。7.13.3.4 高氯酸应稀释到 60%后再使用，过浓易引起爆炸。7.13.3.5 消化时高氯酸已分解完毕，但残留物仍呈黑色或棕色时，说明由于硝酸不足或温度过高，硝酸分解过快，氧化不完全。发现这种情况应立即将样品取下，冷却后再加 3mL4 mL 硝酸和 1 mL 高氯酸，继续消化直到消化液完全呈白色为止。若小漏斗上有黑色物质，应使用少量浓硝酸冲洗，再重新消化。7.13.3.6 因为钾可沉淀为高氯酸钾，故应把过多的高氯酸排除，不至在消化液中形成高氯酸钾沉淀，因此，消化终了时，要求出现硫酸回流即可。7.13.3.7 为避免已脱水的二氧化硅再次水化溶解，当以盐酸作溶剂时，同时要考虑盐酸的浓度，以阻止二氧化硅再度水化为宜。7.14 氯含量7.14.1 测定方法应按照 NY/T 1378 要求测定氯含量。7.14.2 样品预处理称取过 60 目（0.25 mm）筛的烘干周丛生物样品 5.000 g（精确至 0.000 1 g）于 250 mL 塑料瓶中，准确加入 50 mL 纯水，用橡皮塞塞紧后超声 30 min。7.14.3 注意事项7.14.3.1 所有玻璃器皿均需在使用前用 5%的硝酸浸泡 4 h，然后用去离子水浸泡并反复冲洗 3 次5 次，晾干备用。7.14.3.2 在重复性条件下获得两次独立测定结果的绝对差值，氯离子含量小于 100 mg kg-1时，不应超过算术平均值的 5%，氯离子含量大于或等于 100 mg kg-1时，不应超过算术平均值的 3%。7.15 硼含量7.15.1 测定方法应按照 NY/T 149 要求测定硼含量。7.15.2 样品预处理准确称取 0.5 g 过筛周丛生物干品（精确到 0.000 1 g），加 1 mL2 mL 饱和氢氧化钙溶液混匀，低温蒸干，并加热炭化至无烟。随即将其移入马弗炉中，升温至 400 并保持 30 min，然后升温至 500 并保持 1.5 h 进行灰化。冷却取出后加入 10 mL 硫酸溶液溶解灰分，静置 1 h。将溶解液全部转移至 50 mL容量瓶中并定容至标度。用干滤纸过滤，滤液储存于聚乙烯试剂瓶中供测硼用