人类基因组结构变异检测方法及其临床应用.pdf

：综述人类基因组结构变异检测方法及其临床应用鲍芸，权静，肖艳群（上海市临床检验中心，上海）摘要：人类基因组结构变异在人类多样性和疾病发生中起着重要作用，许多遗传病都是由染色体结构变异所致。目前临床上对于结构变异检测主要有染色体核型分析、荧光原位杂交等细胞遗传学方法以及拷贝数变异微阵列芯片和拷贝数变异高通量测序等分子遗传学方法等。该文旨在介绍几种人类基因组结构变异检测方法在临床上的应用进展，分析其局限性，并对未来结构变异的临床检测方向进行了展望。关键词：基因组；结构变异；检测方法；临床应用中图分类号：文献标志码：人类基因组结构变异（，）一般是指长度在 以上的 片段变化，主要包括插入（）、缺失（）、重复（）、重复片段扩增（）、倒位（）、易位（）等多种类型。结构变异能够通过多种方式影响基因功能，在人类多样性和疾病中发挥着重要作用。如发生重复、插入或缺失等变异时，可能会导致基因剂量的改变；编码区域的结构变异亦可能会影响基因的转录，改变翻译产物；非编码区域的结构变异，可能会通过位置效应影响基因表达调控；当发生增强子或者抑制子删除变异时，也可能会影响基因的转录水平。当受到基因组结构变异的影响导致某些性状表现异常时，就会引发各种遗传性疾病。号染色体发生重复，由二倍体变为三倍体是唐氏综合征的主要病因；号染色体长臂（）末端附近区域部分高度重复片段的缺失是诱发面肩肱型肌营养不良症（，）的主要遗传因素；编码 因子的基因片段内部发生倒位能够引起血友病；部分染色体易位是导致白血病的主要原因，如 号和 号染色体长臂 融合基因易位，号和 号染色体长臂 融合基因易位等。目前临床对基因组结构变异的鉴定主要依赖于染色体核型分析（）、荧光原位杂交（，）等细胞遗传学方法。此外，拷贝数变异微阵列芯片（，）和基于下一代测序（，）的基因组拷 贝 数 变 异 测 序（，）等分子遗传学方法也逐渐开始普及。近几年结构变异研究不断出现新的数据分析方法和检测技术，如基于全外显子组（，）或全基因组（，）数据的结构变异分析技术，基于单分子标记的全基因组图谱技术（），第三代长读长测序技术等，这些技术的发展为未来临床检测应用提供了实验依据。由于基因组结构变异的类型和跨度非常大（至整条染色体范围），单一的检测方法很难适用于所有变异类型的检测。每种检测方法都有各自优势和局限性，对于不同类型的结构变异检测能力也并不一致，因此疾病检出率也各不相同，不同检测方法比较见表。细胞遗传学检测方法 染色体核型分析是以细胞分裂中期染色体为研究对象，根据染色体的长度、着丝点位置、长短臂比例、有无随体等特征，通过染色显带技术对染色体进行分析和比较的技术。核型分析是数十年来临床上传统检测染色体数目异常和平衡性易位的常用方法，被广泛应用于血液病、不孕不育、产前诊断等领域中染色体异常的筛查与诊断。羊水穿刺培养后进行核型分析是目前胎儿染色体数目异常和大片段结构异常产前诊断的“金标准”。但临床研究表明，核型分析对遗传病因分析不尽如人意，如对男性不育症的遗传病因诊断率不足，无法识别微小额外标记染色体（，）的来源。究其原因，在于核型分析的分辨率相对较低（临床上通常只能达到 的分辨率）。此外由于部分核型分析检测样本（产前诊断）需要进行细胞培养，操作流程较为复杂，同时高度依赖于技术人员和细胞遗传学者的经验，缺乏标准化培训，导致不同人员和实验室检测水平参差不齐，样本检测质量难以保证。荧光原位杂交（，）技术基本原理是利用荧光标记特异的单链 分子作为探针，与细胞内相应的 或 进行分子杂交，观察荧光临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：上海市卫生健康委员会临床研究专项（）；上海市“医苑新星”青年医学人才培养资助计划（沪卫人事号）。作者简介：鲍芸，年生，女，副主任技师，博士，主要从事临床分子生物学检测及质量控制工作。通信作者：肖艳群，主任技师，：。信号在检测细胞或组织中的特异核苷酸序列的定位或分布。与核型分析相比，检测技术不依赖细胞培养，检测时间更短，是拷贝数变异、微缺失 重复、易位等常见的染色体异常的常规检测方法，临床上广泛应用于血液 实体肿瘤、遗传病诊断、产前诊断等领域。其局限性在于检测范围仅限于靶向区域，且高度依赖探针的设计，无法检测未知的变异。一项临床回顾性研究指出，在产前诊断中 对染色体异常重排存在一定的漏检，建议结合核型分析等其他检测结果进行综合分析判断，不适合单独使用进行胎儿染色体异常检测。表 不同检测方法特点及应用检测方法核型分析特殊 分辨率 偏好性无目标区域某些特殊变异目标区域无无无否否否能能能能平衡易位能能否否否否能重复扩增序列否否否否否能（）能通量低低高高高高中细胞培养需要不需要不需要不需要不需要不需要不需要报告周期 周 周 周 周 周数字化分析否否否是是是是自动化分析平台否否否是否否是临床应用血液病、遗传病、产前诊断各类肿瘤、遗传病、产前诊断几种特殊遗传病，如、发育迟 缓、智力低下等遗传病、产前诊断各类遗传病、产前诊断各类 肿瘤、遗传病、产 前诊断各类肿瘤、遗传病、产前诊断 分子遗传学检测方法 以 扩增为基础的分子检测技术在临床上应用也很普遍。常规 扩增能够有针对性地检测目标区域内单碱基或几个碱基突变和小范围插入 缺失变异。但是遗传病中还有很重要的一部分是由于核苷酸重复序列异常扩增导致的，如脆性 综合征、共济失调、强直性肌营养不良症 型等。其中某些区域重复序列扩增次数常常超过 次，甚至达到 次以上，使用常规 方法很难检测，因此发展出很多基于 的特殊检测方法，包括：长模板 扩增 法检测强直肌性营养不良症（）患者分子诊断，重复引物 技术（）用于大片段动态突变疾病（如 共济失调）的基因检测，多重连接依赖探针扩增（，）技术检测杜氏进行性肌营养不良症（，）基因缺失 重复突变等。然而由于 技术优先扩增较小片段的等位基因，检测大片段重复或插入时易产生假阴性的结果。此外，使用 技术检测无法明确重复序列的长度，并且在检测嵌合型患者样本时会产生无重复序列的短 产物，导致假阴性。因此，基于 的检测方法对样品和实验流程的要求也非常高，过程中的质量控制对检测的成功率和正确率尤为重要。染色体微阵列分析（，）技术能较为准确地发现染色体不平衡的拷贝数变异（，），对于微小缺失、重复等不平衡性重排检测具有突出优势。技术可分为两大类：基于微阵列的比较基因组杂交（，）技术和单核苷酸多态性微阵列（，）技术。前者需要同时检测待测样本与正常对照样本，对二者进行比较分析后获得拷贝数变异结果，而后者则只需将待测样本与参考基因组对照资料进行对比即可获得诊断结果。除 外，还能够检测出大多数的单亲二倍体和三倍体，是目前临床上常用的检测手段。目前 芯片技术在临床上能够达到 的综合诊断率，被国际细胞基因组芯片标准协作组（，）推荐作为不明原因的发育迟缓、智力低下、多种体征畸形等遗传病患者的临床一线检测手段。其局限性在于不能分辨拷贝数变异的方向并且无法检测平衡性的基因组结构变异（如平衡性倒位和易位），并且 检测嵌合比例下限约为 ，无法检测较低比例的嵌合型变异。基于 技术的 与 具有类似的检测原理，区别在于 使用低深度的全基因组测序来代替探针杂交，能够通过测序深度的增加以提高对低比例嵌合型变异地检测，但是仍然无法分析平衡性变异和片段扩增的方向和位置。近十年来随着测序技术的发展，人们希望通过高通量测序作为一体式的基因检测方法可以同时检测核苷酸变异和结构变异来补充或取代细胞遗传学传统工具。虽然理论上是可行的，但同时检测多种复杂类型变异给临床实验室带来巨大的挑战。根据文库构建方法的不同，检测可分为基因组测序、外显子测序、靶向测序（定制）等。全基因组或全外显子组测序能够检测不同类型的结构变异，与靶向测序相比，对 的检测具有更高的特异性和灵敏度。对重复序列，染色体重排等复杂结构变异检测需要借助新的数据分析技术和方法。根据方法所采用的分析依据不同，可分为以下 种类型：（）数据覆盖深度；（）比对不一致的测序数据对（，同一区域的测序数据对，但与参考基因组的比对方向不一致，或与文库平均大小不一致）；（）跨越断点连接的读长（又称分裂读长）。基于深临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，度的分析法主要用于检测非整倍体、大片段、末端缺失等结构变异，其中包括目前最成熟的临床应用胎儿非整倍体无创产前筛查（，号染色体三体筛查）；不一致测序数据比对和分裂读长法主要用于检测易位、倒位等染色体重排异常，对非整倍体、缺失等结构变异检测能力不足。但是基于 的检测方法分析能力很大程度上局限于基因组的非重复区域的结构变异。由于很多结构变异源自重复片段的非等位基因同源重组，而 每个测序读长很短，无法在同源度很高的重复片段区域实现精确匹配，因此除染色体非整倍体检测外，基于 的结构变异检测的临床应用大部分集中在小片段、插入、缺失等。新兴检测技术 近年来，光学基因组图谱技术（，）逐步被应用到临床结构变异检测中。是一种新型超长单分子检测技术，通过对 分子（）上特异性的识别序列 进行标记，结合微流控、高分辨率显微镜和自动图像分析技术，实现对完整 分子上标记信号模式的直接可视化分析。其基本技术原理与染色体核型分析类似，但 标记信号更多，因此检测分辨率更高（），可一次性检出多种不同类型的染色体畸变。一项欧洲多国学者联合研究通过对 份临床样本中的 个染色体结构异常（包括非整倍体、缺失、重复、易位、倒位、插入、复杂重排等）的对比分析，表明 技术能够检出所有类型的染色体畸变。另一项研究通过对 例染色体核型检测异常的临床样本进行回顾性分析，结果表明 能够检出 例样本的结构变异，结构与核型、一致，并能精细化断裂位置，确定重复或插入片段的方向，但无法检测位于着丝粒或者异染色质区域的易位。国内学者利用 技术对有异常妊娠史，但核型分析正常的夫妇进行 检测，在全部入组检测的 对夫妇中均发现了不同程度的隐匿性平衡易位，此项研究指出该技术提高了临床对染色体平衡易位的检出率，并对复杂染色体重排检测具有一定优势。此外，通过对 例血液肿瘤患者样本使用 和常规检测方法检测的对比分析，表明 检测结果与常规方法检测基本一致，并且能够分析出更复杂的结构变异。以上多项对比研究揭示 的检测结果与核型分析、检测、芯片等其他技术检测结果符合率达到。作为一种新型分子检测技术，不仅能够发现拷贝数变异等非平衡性结构变异以及易位、倒位等平衡性结构变异，更重要的是能够精细化断裂点位置以及确定重复或插入片段的方向，有助于遗传病的诊断。的局限性在于对于缺乏参考序列和标记的区域（如着丝粒，端粒，异染色质区域）无法进行检测，可能会对某些变异类型（如罗伯逊易位等）产生漏检。长读长测序又称三代测序技术，能够检测长度为 或更长的核酸片段，主要以单分子实时测序（，）和纳米孔单分子测序（）技术为主。研究表明，利用长读长测序技术能够提高结构变异和其他复杂变异地检测成功率。年人类基因组结构变异联盟（，）利用长读长测序技术顺利完成了 个人类基因组分析，并检测到多达十万个结构变异，其中 的结构变异没有被 检测出。虽然长读长测序技术有望成为同时检测核苷酸变异和结构变异的工具，但目前仍受测序通量、成本、缺乏完整的分析流程等因素影响，尚不能在临床检测中广泛应用。小结及展望 由于基因组结构变异的类型多样，且涉及染色体长度范围跨度较大，单一的检测方法很难适用于所有变异类型的检测。每种检测方法对于不同类型的结构变异检测能力并不一致，对于疾病检出率也各不相同。现阶段临床应用中，经常需要综合多种技术连续或同时对一些复杂病例进行综合分析。未来随着长读长测序技术的不断发展，有望进一步提高测序准确率，不断优化相应分析流程，降低测序成本，成为今后人类基因组结构变异分析的常用检测方法。参考文献杨建滨，尚世强 分子生物学技术在出生缺陷三级预防中的临床应用及思考 中华预防医学杂志，（）：，（）：，：，（）：郝娜，周京，李萌萌，等 光学基因组图谱技术在染色体结构变异检出的效能及初步应用评估 中华预防医学杂志，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，（）：余志良，谢惠君，赵晓萍，等 强直性肌营养不良的分子诊断技术的临床应用研究 中华神经医学杂志，（）：陈晟，吴志英 重复引物 技术在超大片段动态突变疾病基因检测中的应用 遗传，（）：梅燕，严提珍，王远流，等 假肥大型肌营养不良症 例家系的基因检测及产前诊断 中国优生与遗传杂志，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（）：，：（），（）：，（）：郝娜，周京，李萌萌，等 光学基因组图谱技术在染色体结构变异检出的效能及初步应用评估 中华预防医学杂志，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：（收稿日期：）（本文编辑：许晓蒙）读者作者编者临床检验杂志网站及远程稿件处理系统开通为方便读者投稿、专家审稿并加快杂志出版周期及提升办刊质量，本刊开通网站和远程稿件处理系统。系统包括作者远程投稿系统、专家远程审稿系统、编辑在线办公系统、网上期刊发行系统及读者订阅系统等。为方便作者、读者和审稿专家熟悉使用本系统，现将有关注意事项告知如下：第一次使用本系统的作者登录本刊网站（）后点击用户登录菜单下的作者投稿进行注册，注册时请按要求逐项填写完整，所填内容必须真实。注册完成后即可在线投稿，系统在作者投稿成功后自动将相关信息发至作者指定邮箱。一次注册，长期有效。请务必注意不要重复注册。投稿后，作者以注册时设定的用户名（）和密码登录投稿系统，可随时了解稿件的编审进程。编委和审稿专家可以用同一用户名登录审稿系统或以作者身份投稿。在使用过程中如遇问题或有好建议请和我们联系，联系电话：；：或 。临床检验杂志编辑部临床检验杂志 年 月第 卷第 期 ，