敲低NLRX1可上调线粒体融合蛋白并减轻缺氧心肌细胞凋亡.pdf

基础研究敲低 NLRX1 可上调线粒体融合蛋白并减轻缺氧心肌细胞凋亡王林一1,2，贺广祥1,2，梁郡1,2，史睿2，李慢2，裴建明2，杨彦玲1，李军2（1.延安大学医学院,陕西延安 716000；2.空军军医大学基础医学院生理与病理生理学教研室,陕西西安710032）摘要：目的探究模式识别受体 NOD 样受体家族成员 X1(NLRX1)对心肌细胞缺氧损伤的影响及其分子机制。方法分离培养 SD 大鼠乳鼠原代心肌细胞，转染 NLRX1-siRNA48h 后，给予不同时间的氧糖剥夺模拟心肌缺血。采用 CCK-8 法检测细胞活力，流式细胞术检测细胞凋亡，Westernblot 检测 NLRX1 蛋白和线粒体融合相关蛋白（Opa1、Mfn1、Mfn2）表达水平，激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体形态。结果NLRX1 在心肌细胞中高表达，心肌细胞氧糖剥夺后 NLRX1 总蛋白水平不变，胞浆 NLRX1 上调（P0.01）。与对照组相比，siRNA 沉默NLRX1 可上调线粒体融合蛋白 Mfn2 和 Opa1 的表达水平，促进缺氧心肌细胞线粒体融合，减轻缺氧诱导的心肌细胞凋亡（P0.05）。结论免疫调节分子 NLRX1 可能具有调控线粒体融合蛋白的作用，阻抑 NLRX1 可上调融合分子 Mfn2,Opa1 蛋白表达，减轻缺氧心肌损伤。关键词：NLRX1；线粒体融合；心肌细胞凋亡中图分类号：R56文献标识码：A 文章编号：1009-7236(2023)04-0373-07DOI：10.12125/j.chj.202212052开放科学(资源服务)标识码(OSID):网络出版地址：http:/ knockdown up-regulates expression level of mitochondrialfusion protein and attenuates hypoxia induced cardiomyocyte deathWANG Lin-yi1,2，HE Guang-xiang1,2，LIANG Jun1,2，SHI Rui2，LI Man2，PEI Jian-ming2，YANG Yan-ling1，LI Jun2(1.SchoolofMedicine,YananUniversity,Yanan716000,Shaanxi,China；2.DepartmentofPhysiologyand Pathophysiology,School of Basic Medical Science,Air Force Medical University,Xi an 710032,Shaanxi,China)Abstract:AIMToinvestigatetheeffectsofpatternrecognitionreceptorNLRX1oncardiomyocytesupon hypoxia injury and the underlying molecular mechanisms.METHODS Primary neonatal ratventricularmyocytes(NRVMs)ofSDratswereisolatedandcultured.NRVMsweretransfectedwithNLRX1-siRNAfor48hoursandthensubjectedtohypoxiaandglucosedeprivationfordifferenttimestosimulate myocardial ischemia.Cell viability was determined by CCK-8 kit and cell apoptosis wasanalyzedwithflowcytometry.ProteinexpressionlevelsofNLRX1andmitochondrialfusionrelatedproteins(Opa1,Mfn1,Mfn2)were determined by Western blot and mitochondrial morphology wasanalyzed with laser scanning confocal microscopy.RESULTS NLRX1 was highly expressed incardiomyocytes.AlthoughtotalproteinlevelofNLRX1wasnotaltered,cytoplasmicNLRX1wasup-regulatedinNRVMsuponhypoxiaandglucosedeprivation(P0.01).Comparedwiththoseincontrolgroup,NLRX1-siRNAup-regulatedexpressionlevelsofmitochondrialfusionproteinMfn2andOpa1,基金项目：国家自然科学基金项目（82170249，82070051，82071235）通讯作者：李军，副教授，主要从事心血管生理学研究Email：共同通讯作者：杨彦玲，教授，主要从事神经损伤修复研究Email：作者简介：王林一，硕士生Email：心脏杂志（ChinHeartJ）2023，35（4）373promotedmitochondrialfusionofhypoxiccardiomyocytesandreducedhypoxiainducedcardiomyocytedeath(P0.05).CONCLUSIONNLRX1modulatestheexpressionofmitochondrialfusionproteinsMfn2andOpa1,andtheinhibitionofNLRX1up-regulatestheproteinlevelsofMfn2andOpa1,whichcontributestoreducedcardiomyocytesinjuryuponhypoxia.Key words:NLRX1；mitochondrialfusion；cardiomyocytesapoptosis心肌梗死及其并发症发病率高、死亡率高，严重威胁人类健康1。心肌细胞是终末分化细胞，几乎没有再生能力，如何减轻心肌缺血/缺氧损伤是当前心血管研究领域的重要科学问题2。固有免疫系统在心脏功能稳态维持、心血管疾病发生过程中发挥重要作用，心肌细胞表达核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide binding oligomerization domain，NOD）样受体（NLRs）等多种模式识别受体，通过识别感知缺血/缺氧微环境中危险相关模式分子（damage-ass-ociatedmolecularpattern，DAMP）启动免疫应答3,4。NLRs 家族成员 X1（NLRX1）是新近发现的调节性NLRs，在心脏和肌肉组织中高表达5,6。研究表明NLRX1 在宿主抗感染免疫、组织损伤应答过程中发挥重要作用6，但是 NLRX1 在不同病理生理条件下的具体作用具有高度的组织细胞特异性和时空特异性，可能因细胞类型的不同、疾病损伤程度的差异而有所不同7,8。虽然心肌细胞高表达 NLRX1，但是NLRX1 在心脏功能稳态维持、心肌细胞应激损伤中的作用及其机制尚不清楚。线粒体是心肌细胞的重要细胞器，通过氧化磷酸化为心肌细胞电生理活动提供能量9。研究表明线粒体是一种高度动态变化的细胞器，根据细胞外环境变化不断地发生融合与分裂，称之为线粒体动力学10。线粒体融合与分裂动态平衡对于维持细胞正常生理功能至关重要11,12。线粒体融合过程主要受融合分子线粒体外膜融合蛋白1（mitofusins1,Mfn1）、线粒体融合蛋白2（mitofusins2,Mfn2）和视神经萎缩蛋白 1（optic-atrophy1,Opa1）的精密调控，敲除其中任何一个蛋白分子都可导致线粒体融合受抑，引起线粒体分裂增加11。研究表明 Mfn1、Mfn2 对损伤应激条件下心肌细胞生存至关重要，腺病毒过表达上调 Mfn1 或 Mfn2，可显著抑制缺氧诱导的线粒体碎片化，减轻缺氧复氧诱导的心肌细胞死亡13。文献报道 NLRX1 主要定位于线粒体14，但在缺血/缺氧等应激损伤条件下，心肌 NLRX1 如何变化，NLRX1 是否参与调控线粒体动力学进而影响心肌细胞生存与死亡，尚不清楚。本研究拟在我们课题组前期工作基础上，明确心肌细胞在缺氧损伤条件下，NLRX1 的变化及其与线粒体融合的关系，为减轻心肌缺血损伤提供全新的分子机制和可能的干预靶点。1材料和方法1.1材料新生（13）dSD 大鼠购自空军军医大学实验动物中心；兔抗 Mfn2 抗体、Mfn1 抗体、Opa1 抗体购自美国 CellSignalingTechnology 公司；小鼠抗-actin 单克隆抗体、小鼠抗-tubulin 单克隆抗体购自中国 ProteinTech 公司；辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）标记的山羊抗小鼠IgG、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 购自中国壮志生物科技有限公司；CellCountingKit-8（CCK-8）检测试剂盒购自美国 APExBIO 公司；一抗稀释液、二辛可宁酸（bicinchoninicacid,BCA）蛋白质浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodiumdodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）凝胶配制试剂盒、5SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液，购自中国雅酶生物技术公司；RIPA 裂解液购自中国碧云天生物技术公司；蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂购自中国 CWBIO 公司；甘氨酸、Tris 碱、十二烷基硫酸钠购自中国索莱宝公司；Westernblot 显色液、聚偏二氟乙烯膜（polyviny-lidenefluoride,PVDF）膜购自美国 Millipore 公司；NLRX1 沉默小干扰 RNA（siRNA）序列由中国上海汉恒生物公司合成；LipofectamineTMRNAiMAX 试剂购自美国 Invitrogen 公司；细胞缺氧研究装置购自美国 Billups-rothenberg 公司；氧气分析仪购自美国Nuvair 公司；2.5g/L 胰蛋白酶购自美国 Corning 公司；胎牛血清、DMEM 高糖细胞培养液、青霉素、链霉素购自美国 Gibco 公司；胞浆蛋白提取试剂盒购自中国贝博试剂公司；MitoTrackerRedCMXRos线粒体红色荧光探针购自中国翌圣生物科技公司；电泳仪、凝胶成像仪购自中国天能公司；细胞培养箱、超净工作台、生物安全柜购自美国 ThermoFisherScientific 公司；高速离心机购自德国 Eppendorf公司；激光扫描共聚焦显微镜购自日本 Olympus公司。1.2方法1.2.1心肌细胞的分离培养及分组取新生（13）d的 SD 大鼠乳鼠 10 只，经过 750ml/L 乙醇浸泡消毒374心脏杂志（ChinHeartJ）2023，35（4）2 次，用无菌眼科剪沿胸骨正中入剪，并用无菌镊子摘取心脏，迅速置于预冷的磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsaline,PBS,pH7.4）中，洗去残留的血液。用眼科剪反复剪心脏组织至肉糜状，用 1g/L 的型胶原酶液消化 4 次，将细胞悬液离心（800r/min，5min）后，收集细胞悬液并接种于 25cm2培养瓶中，放置于 37、50ml/LCO2的培养箱中培养，90min 后通过差速贴壁法去除心肌成纤维细胞，将所得的含原代心肌细胞悬液以 3105个细胞置入 6 孔板培养皿中，在 37、50ml/LCO2的培养箱中进行培养，培养基为 DMEM（含 100ml/L 胎牛血清）。所有实验处理在培养 48h 后细胞达贴壁状态后进行。将新生大鼠心肌细胞（neonatalratventricularmyocytes,NRVMs）分为 4 组：常氧 ScrRNA 组、常氧NLRX1-siRNA 组、缺氧ScrRNA 组、缺氧NLRX1-siRNA 组。1.2.2siRNA 转染敲低 NLRX1 的表达感染前，从80 冰箱取出 siRNA，在冰上融化。吸去细胞原有培养基，加入新鲜培养基，6 孔板上加入 1500L新鲜培养基，6 孔板细胞每孔用 250L 的 Opti-MEM稀释 siRNA（转染细胞的终浓度为 100nmol/L），轻轻吹吸（35）次混匀。轻轻颠倒混匀转染试剂，用250 L 的 Opti-MEM 稀 释 5.0 L LipofectamineTMRNAiMAX，轻轻吹吸（35）次混匀，于室温下静置5min。混合转染试剂和 siRNA 稀释液，轻轻吹吸（35）次混匀，于室温下静置 20min。将转染复合物加入到 6 孔细胞板中，500L/孔，前后轻摇细胞板混合均匀。将细胞板置于 37、50ml/LCO2培养箱中培养，转染 6h 后可换新鲜培养基。转染完成48h 后通过 Westernblot 进行 siRNA 沉默效果检测。1.2.3心肌细胞缺氧处理经 siRNA 转染后的心肌细胞，更换培养基为无糖无血清培养基，放置在缺氧盘中，并注入含 50ml/LCO2、950ml/LN2混合气，O2含量（低于 1ml/L）由氧分析仪监测。在 6h、8h、12h、24h 不同的时间点收获心肌细胞以进行下一步的实验。1.2.4CCK-8 法检测心肌细胞活力提取心肌细胞以 5103个细胞接种于 96 孔板培养皿中培养 48h，再转染 Scr-siRNA 及 NLRX1-siRNA48h 后，分别缺氧处理 6h、8h、12h、24h。处理完毕后，进行细胞活力检测，每孔加入 CCK-8 试剂 10L，孵育 1h，用酶标仪测定 450nm 处的吸光度值。1.2.5激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体形态经处理完毕后的细胞，吸除培养基，加入 37 预热的MitoTrackerRedCMXRos 染色工作液。在 37、50ml/LCO2的培养箱中孵育 10min。染色结束后，吸除染色工作液，更换新鲜培养液，采用 OlympusCorporation 激光共聚焦扫描显微镜进行图像采集。用 Image-ProPlus6.0 软件测定线粒体的数量和大小。1.2.6Westernblot 法检测原代心肌细胞 NLRX1、Mfn2、Mfn1、Opa1 蛋白表达将处理完毕的心肌细胞，弃掉培养基，加入预冷的 PBS 清洗残留培养基。每孔细胞加入 1mL 预冷 PBS，用细胞刮刀收集细胞至 1.5mL 离心管，于 41000r/min 离心 5min并弃掉上清。每管加入 150LRIPA 裂解液，吹悬，手动细胞超声破碎（1520）次并将细胞置于冰上裂解 15min。然后，于 4、12000r/min 离心 20min；收集上清蛋白溶液，BCA 定量后用于检测。蛋白质经 SDS-PAGE 后，转移至 PVDF 膜上。快速封闭液封闭 30min，分别加兔抗 Mfn2 抗体（11000）、兔抗 Mfn1 抗 体（11 000）、兔 抗 Opa1 抗 体（11000）、小鼠抗-tubulin 抗体（15000）,4 孵育过夜，PBST 洗膜 10min3 次。加 HRP 标记的山羊抗兔 IgG（15000）或 HRP 标记的山羊抗小鼠IgG（15000），于室温孵育 1h；用 PBST 洗膜 10min3 次，采用化学发光法显色并用 ImageJ 进行条带灰度值分析。1.2.7细胞浆蛋白的提取将处理完毕的心肌细胞，取 1.5107个细胞，在 4、500g 条件下离心 3min，小心吸取培养基，尽可能吸干，收集细胞。用冷PBS 洗涤细胞 2 次，每次洗涤后尽可能吸干上清。加入 200L 预冷的试剂 A，置冰上 5min。用手动细胞超声器充分匀浆 30 下。然后在 4、500g 条件下离心5min。弃沉淀，留上清。将上清在4、800g条件下离心 5min。弃沉淀，留上清。将上清 4，11000g 条件下离心 15min。收集上清。将上清吸入另一预冷的干净离心管，加入200L 试剂C，充分混匀，在4 振荡10min。在12000r/min 条件下离心5min，取上清，即得胞浆蛋白。将上述蛋白提取物定量后分装于80 冰箱保存备用或直接用于下游实验。1.2.8流式细胞术检测细胞凋亡率将处理完毕的心肌细胞，用 PBS 洗涤细胞 2 次，离心后加入适量Stainingbuffer，重悬细胞，每 100L 细胞悬液加入到流式管，按照 AnnexinV-FITC/PI 细胞凋亡试剂盒分别加入 5L 的 AnnexinV-FITC 和 5L 的 PI，避光孵育 15min，加入 400L 结合缓冲液混匀，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况。x1.3统计学处理采用 MicrosoftOfficeExcel 整理数据，并用 GraphPadPrism8 软件统计分析；数据以s 表示，数据处理两组间采用 t 检验，三组或三组以上数据处理采用单因素方差分析（One-wayANOVA），多组的组间比较采用 TukeysMultiple心脏杂志（ChinHeartJ）2023，35（4）375ComparisonsTest 校正 t 检验，以 P0.05 为差异有统计学意义。2结果2.1缺氧对 NLRX1 在心肌细胞表达的影响心肌细胞缺氧后 NLRX1 总蛋白无变化，胞浆 NLRX1上调。深入挖掘 TheHumanProteinAtlas 数据库，分析 NLRX1 在不同组织细胞类型的表达丰度，发现 NLRX1 在心肌细胞中高表达，见图 1A。NRVMs给予氧糖剥夺不同时间建立体外心肌细胞缺氧损伤模型。与常氧组相比，氧糖剥夺 6h、12h、24h 后心肌细胞 NLRX1 总蛋白表达无显著变化，见图 1B 和1C。与常氧组相比，随着氧糖剥夺时间延长，细胞存活率逐渐降低。缺氧 8h 后细胞存活率约为 40p，后续实验选择氧糖剥夺 8h 为心肌缺氧损伤观察点（P0.01），见图 1D。NRVMs 氧糖剥夺 8h 后提取心肌细胞胞浆蛋白，与常氧组相比，缺氧组胞浆NLRX1 表达显著上调（P0.01），见图 1E 和 1F。NRVMs 氧糖剥夺 8h 后提取心肌细胞胞核蛋白，与常氧组相比，缺氧组胞核 NLRX1 表达显著下调（P0.01），见图 1G 和图 1H。为进一步评估缺氧处理后细胞损伤水平，流式细胞术检测细胞凋亡。与常氧组相比，NRVMs 氧糖剥夺 8h 后细胞凋亡显著增加（P0.05），见图 1I 和图 1J。NLRX114SINGLECELL TYPESiSingle cell typesRNA single cell type specificity:Low cell type specificityGroupExpressionGlandular epithelial cellsSquamous epithelial cellsSpecialized epithelial cellEndocrine cellsNeuronal cellsGlial cellsGerm cellsTrophoblast cellsEndothelial cellsMuscle cellsAdipocytesPigment cellsMesenchymal cellsUndifferentiated cellsBlood&immune cellsAlphabetical121086420-actinNLRX1-actinNLRX1Histone-H3NormoxiaNormoxiaHypoxiaNormoxiaHypoxiaNormoxiaHypoxiaNormoxiaaHypoxiaNormoxiaHypoxiaNormoxiaHypoxiaAnnexin V-FITCOGD+6 hOGD+12 h OGD+24 hNormoxiaNormoxiaOGD+6 hOGD+6 hOGD+12 hOGD+12 hOGD+8 hOGD+24 hOGD+24 h108kd108kd42kd42kd108kd42kdPIABCDEGIJHF1031021011001001011021031031021011002.01.51.00.5NLRX 总蛋白表达水平01.00.80.60.40.2NLRX1 胞核蛋白表达水平01.00.80.60.40.2NLRX1 胞浆蛋白表达水平01.5bbbbbb1.00.5细胞活力(%)040302010细胞凋亡率(%)0图1缺氧时大鼠乳鼠心肌细胞 NLRX1 蛋白表达变化及细胞凋亡情况A：NLRX1 在不同组织细胞类型的表达丰度图；B：Westernblot 典型图示大鼠乳鼠心肌细胞（NRVMs）在常氧和氧糖剥夺不同时间点NLRX1 总蛋白表达情况；C：NRVMs 氧糖剥夺不同时间点 NLRX1 总蛋白表达与常氧组相比均无统计学差异；D：CCK-8 检测显示随着氧糖剥夺时间增加，NRVMs 细胞活力逐渐降低；E：Westernblot 典型图示 NRVMs 氧糖剥夺 8h 后胞浆蛋白表达水平；F：与常氧组相比，NRVMs 氧糖剥夺 8h 后胞浆 NLRX1 蛋白表达显著上调；G：Westernblot 典型图示 NRVMs 氧糖剥夺 8h 后胞核蛋白表达水平；H：与常氧组相比，NRVMs 氧糖剥夺 8h 后胞核 NLRX1 蛋白表达显著下调；I：流式细胞术检测 NRVMs 细胞凋亡；J：与常氧组相比，NRVMs 氧糖剥夺 8h后细胞凋亡显著增加。n=3。与 Normoxia 组比较，aP0.05,bP0.01376心脏杂志（ChinHeartJ）2023，35（4）2.2NLRX1 敲低对氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡的影响为了明确 NLRX1 是否参与调节缺氧诱导的心肌细胞损伤，NRVMs 转染 NLRX1-siRNA 或对照 siRNA（ScrRNA）48h 后给予氧糖剥夺处理。Westernblot 结果显示，与 ScrRNA 组相比，NLRX1-siRNA 转染组心肌细胞 NLRX1 蛋白表达显著降低（P0.01），见图 2A 和 2B；流式分析表明，与常氧组相比，NRVMs 氧糖剥夺后细胞凋亡显著增加，与Scr-siRNA 相比，NLRX1-siRNA 组细胞凋亡显著降低。（P0.01），见图 2C 和 2D。NLRX1-tubulinABCD108kd55kdNLRX1 蛋白相对水平细胞凋亡率(%)1.510080PI1031021011001001234Annexin V-FITC1011021031001011021031001011021031001011021031031021011001031021011001031021011006040201.0123412341234bbdff0.50图2NLRX1 敲低可减轻氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡A：Westernblot 典型图示 NRVMs 转染 NLRX1-siRNA 或对照 siRNA（ScrRNA）48h 后 NLRX1 蛋白表达水平；B：NLRX1-siRNA 可显著降低NLRX1 蛋白表达水平；C：NRVMs 转染 NLRX1-siRNA 或对照 siRNA（ScrRNA）48h 后给予氧糖剥夺刺激，流式细胞术检测细胞凋亡；D：NLRX1-siRNA 可显著降低氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡。1：NormoxiaScrRNA；2：NormoxiaNLRX1-siRNA；3：HypoxiaScrRNA；4：HypoxiaNLRX1-siRNA。n=6。与 NormoxiaScrRNA 组比较，bP0.01；与 NormoxiaNLRX1-siRNA 组比较，dP0.01；与 HypoxiaScrRNA 组比较，fP0.012.3NLRX1 敲低可上调线粒体融合蛋白水平，减轻心肌细胞损伤结果图 3A 所示，常氧 ScrRNA组及常氧 NLRX1-siRNA 组心肌细胞线粒体呈细长的小管状，网络高度互联。氧糖剥夺条件下，ScrRNA组心肌细胞线粒体形态碎片化，呈球形、短棒状。与常氧组相比，ScrRNA 组缺氧损伤后线粒体面积减少（P0.05），线粒体数量增加（P0.01）。与 ScrRNA缺氧组相比，NLRX1-siRNA 缺氧损伤后心肌细胞线粒体碎片化减轻，部分恢复至条索状，线粒体面积增加，线粒体数量减少（均 P0.05），见图 3A3C，提示 NLRX1 沉默可促进细胞线粒体融合，进而减轻缺氧诱导的细胞损伤。我们进一步研究分析缺氧损伤条件下心肌细胞线粒体融合蛋白 Mfn1、Mfn2、Opa1的表达情况。与常氧组相比，缺氧刺激诱导线粒体融合蛋白 Mfn1、Mfn2、Opa1 显著下调，NLRX1-siRNA 可有效抑制缺氧诱导的 Mfn2、Opa1 蛋白下调趋势，与 ScrRNA 缺氧组相比有统计学差异（P0.05），见图 3D3G。缺氧条件下，Mfn1 在两组的下调趋势无统计学差异。1MitoTracker Red20 m20 m20 m20 m5 m5 m5 m5 mMfn2Mfn1Opa1-tubulin234200150100线粒体面积500200150100线粒体数量/细胞500Mfn2 蛋白相对水平123aebffabcea41234Opa1 蛋白相对水平Mfn1 蛋白相对水平ABCDEFG心脏杂志（ChinHeartJ）2023，35（4）377MitoTracker Red20 m20 m20 m20 m5 m5 m5 m5 mMfn280 kd84 kd92 kd86 kd55 kdMfn1Opa1-tubulin1234线粒体面积线粒体数量/细胞1.51.00.5Mfn2 蛋白相对水平012341234aebffabcead12341.00.80.60.40.2Opa1 蛋白相对水平00.60.40.2Mfn1 蛋白相对水平0ABCDEFG图3NLRX1 敲低促进心肌细胞线粒体融合，减轻缺氧损伤A：MitoTracker 染色图示常氧和氧糖剥夺条件下线粒体形态学特征，放大倍数（600）；与常氧组相比，氧糖剥夺 8h 后心肌细胞线粒体多呈点状、短棒状，提示缺氧诱导线粒体分裂增加，NLRX1-siRNA 可显著抑制氧糖剥夺诱导的线粒体碎片化，使线粒体保持条索状，提示线粒体融合增加；B：NLRX1 沉默可显著抑制氧糖剥夺诱导的线粒体面积减小；C：NLRX1 沉默可显著抑制氧糖剥夺诱导的单个细胞线粒体数量增加；D：Westernblot 典型图示线粒体融合蛋白 Mfn2、Mfn1 及 Opa1 的表达；EG：心肌细胞氧糖剥夺导致 Mfn2、Mfn2、Opa1 蛋白表达显著下调，NLRX1-siRNA 可显著上调 Mfn2、Opa1 蛋白表达。1：NormoxiaScrRNA；2：NormoxiaNLRX1-siRNA；3：HypoxiaScrRNA；4：HypoxiaNLRX1-siRNA。n=6。与 NormoxiaScrRNA 组比较，aP0.05，bP0.01；与 NormoxiaNLRX1-siRNA 组比较，cP0.05，dP0.01；与 HypoxiaScrRNA 组比较，eP0.05，fP0.013讨论本研究发现 NLRX1 在心肌细胞高表达，心肌细胞缺氧后 NLRX1 总蛋白不变，胞浆 NLRX1 上调，胞核 NLRX1 下调。siRNA 沉默 NLRX1 可上调Mfn2、Opa1 表达水平，促进缺氧心肌细胞线粒体融合，进而减轻缺氧诱导的心肌细胞凋亡。NLRX1 调节炎症信号级联反应，调节线粒体相关功能，并调控细胞代谢、自噬和细胞死亡5。研究表明 NLRX1 调控抗感染免疫反应，调节线粒体活性和细胞凋亡参与肾小管缺血-再灌注（ischemicreperfusion,I/R）损伤15,16，调控线粒体氧化磷酸化和糖酵解参与肝细胞代谢平衡17，诱导活性氧（reactiveoxygenspecies,ROS）产生增强 NF-B 和 JNK 信号5。上述研究表明 NLRX1 在宿主抗感染免疫、组织损伤等过程中发挥重要作用，但是 NLRX1 在不同病理生理条件下的具体作用具有高度的组织细胞特异性和时空特异性，可能因细胞类型的不同、疾病损伤程度的差异而有所不同7,8。虽然心肌细胞高表达 NLRX1，但是NLRX1 在心脏功能稳态维持、以及心肌细胞应激损伤中的作用及其机制尚不清楚。本研究发现心肌细胞缺氧后 NLRX1 总蛋白不变，但是胞浆 NLRX1 上调，胞核 NLRX1 下调，提示在心肌细胞缺氧条件下NLRX1 从细胞核转位至胞浆，但核内 NLRX1 转位至胞浆的具体分子机制仍不清楚，需要进一步研究。通过 siRNA 干扰沉默 NLRX1 可减轻氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡，这与前期文献报道一致，线粒体 NLRX1 参与 ROS 产生，敲低 NLRX1 可减轻 ROS产生及肾小管上皮细胞损伤5,15。线粒体动力学在细胞代谢中起关键作用18。线粒体网可以通过动态分裂和融合事件快速重塑，以响应生理或病理性刺激，维持细胞的正常功能并保护其免受过多的 Ca2+流入、氧化损伤等19。线粒体融合依赖于线粒体跨膜GTP酶，包括介导线粒体外膜融合的 Mfn1 和 Mfn2，以及介导线粒体内膜融合的 Opa120。研究表明，缺氧损伤条件下心肌细胞线粒体融合减少；在心脏 I/R 损伤小鼠模型中发现心肌细胞线粒体网络结构明显断裂，线粒体数量增加，体积减小21。另外有研究发现I/R 时Mfn2表达大幅下降，线粒体融合显著减少。这些发现表明Mfn的异常表达可能与心肌缺血损伤后线粒体融合减少有关22。另一方面，上调 Mfn 表达可促进线粒体融合，减轻心肌缺血损伤，有助于维持心脏功能。I/R损伤后，Opa1 表达降低，线粒体融合受到显著抑制。研究发现在心肌I/R损伤中，线粒体钙单向转运体（MCU）表达上调促进钙内流，导致线粒体钙过载。这导致钙依赖性蛋白酶的激活以抑制 Opa1表达并最终导致线粒体融合减少23。总而言之，Mfn1、Mfn2 和 Opa1 的表达异常和功能障碍在 I/R 损伤中起重要作用。因此，通过促进 Mfn2 或 Opa1的表达，促进线粒体融合是减轻心肌缺血损伤的潜在治378心脏杂志（ChinHeartJ）2023，35（4）疗靶点。同时我们课题组前期研究表明，糖尿病心肌线粒体分裂增加，通过激动剂干预或过表达 Mfn2可促进线粒体融合、抑制线粒体凋亡途径，减轻心肌纤维化，改善心脏收缩与舒张功能24,25。本研究首次发现 siRNA 沉默 NLRX1 可上调 Mfn2、Opa1 表达水平，促进缺氧心肌细胞线粒体融合，进而减轻氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡，但 NLRX1 调控线粒体融合蛋白 Mfn2、Opa1 表达的分子机制尚不清楚。以往文献报道 NLRX1 定位于线粒体、胞浆等细胞部位，我们的实验结果表明 NLRX1亦定位分布于细胞核，其可能作为转录因子直接调控 Mfn2、Opa1 表达水平，亦或通过其它信号分子间接调控 Mfn2、Opa1 表达，仍需进一步研究明确。综上所述，本研究发现心肌细胞缺氧损伤后胞浆 NLRX1 上调，胞核 NLRX1 下调；首次发现 siRNA干扰沉默 NLRX1 可上调 Mfn2，Opa1 表达水平，促进线粒体融合，进而减轻氧糖剥夺诱导的心肌细胞凋亡。本研究结果提示免疫调节分子 NLRX1 与线粒体融合动力学有密切联系，干预 NLRX1 表达及其功能有望改善缺血/缺氧条件下心肌细胞线粒体动力学，为减轻心肌缺血损伤提供了全新的机制见解和可能的干预靶点。参考文献：Sun X,Han Y,Dong C,et al.Daming capsule protects againstmyocardialinfarctionbypromotingmitophagyviatheSIRT1/AMPKsignalingpathwayJ.Biomed Pharmacother,2022,151:113162.1HaqueZK,WangDZ.HowcardiomyocytessensepathophysiologicalstressesforcardiacremodelingJ.Cell Mol LifeSci,2017,74(6):9831000.2NahrendorfM.MyeloidcellcontributionstocardiovascularhealthanddiseaseJ.Nat 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