日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究.pdf

四川动物 Sichuan Journal of Zoology 2023，42（4）：390-399日本三角涡虫 hsp60 基因的分子克隆和功能研究陆琼1，3，李睿2，宋鸽鸽2，马克学1，3*（1.漯河医学高等专科学校基础医学部，河南漯河462002；2.河南师范大学生命科学学院，河南新乡453007；3.河南省营养与健康工程研究中心，河南漯河462002）摘要：以日本三角涡虫Dugesia japonica为研究对象，通过cDNA末端快速扩增技术首次获得涡虫hsp60基因，cDNA全长1 851 bp，编码575个氨基酸的蛋白质，命名为DjHSP60。生物信息学分析表明，DjHSP60含有HSP60家族的标签序列和末端重复序列GGM，亚细胞定位分析显示该蛋白定位于线粒体，属于线粒体HSP60家族。整体原位杂交和双荧光原位杂交显示，Djhsp60阳性细胞主要分布在实质组织中，具有干细胞的特征。涡虫切割后再生1 d，Djhsp60在伤口处的组织中表达显著增强，但随着再生进行，表达量逐渐降低。采用RNAi技术敲除Djhsp60导致涡虫头部逐渐退化，失去再生能力。原位杂交和qPCR研究结果证明，RNAi-Djhsp60下调干细胞相关基因的表达。上述结果揭示Djhsp60在涡虫再生中可能发挥重要作用，为进一步研究Djhsp60调控涡虫干细胞增殖的分子机制奠定了良好基础。关键词：日本三角涡虫；hsp60基因；分子克隆；RNA干扰；再生中图分类号：Q959.151；Q254 文献标志码：A 文章编号：1000-7083（2023）04-0390-10Molecular Cloning and Functional Analysis of hsp60 Genein Planaria Dugesia japonicaLU Qiong1，3，LI Rui2，SONG Gege2，MA Kexue1，3*（1.Department of Basic Medicine，Luohe Medical College，Luohe，Henan Province 462002，China；2.College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang，Henan Province 453007，China；3.Henan Province Engineering Research Center of Nutrition and Health，Luohe，Henan Province 462002，China）Abstract:In this study，the full-length cDNA of hsp60 gene was cloned from planarian Dugesia japonica using the rapid amplification cDNA end technique.The hsp60 gene is 1 851 bp in-length，encoding a protein with 575 amino acids，designated as DjHSP60.Bioinformatics analysis revealed that DjHSP60 contains classical HSP60 family signatures and typical GGM repeat motif at the C terminus，and the subcellular localization of which is mainly in mitochondrion.Therefore，DjHSP60 belongs to the mitochondrial HSP60 family.Whole-mount in situ hybridization and double fluorescent in situ hybridization revealed that Djhsp60-positive cells are mainly distributed in parenchymal tissues with a characteristic of stem cells.The expression of Djhsp60 increased significantly at the cutting site after 1 day of amputation，whereas decreased gradually with the progression of regeneration.Knockdown of Djhsp60 by RNAi caused head regression and loss of regenerDOI：10.11984/j.issn.1000-7083.20220338收稿日期：2022-09-24 接受日期：2023-05-16基金项目：国家自然科学基金项目（31572267）；漯河医学高等专科学校博士启动基金项目（2021-DF-01）；漯河医学高等专科学校科技创新项目（2022KJZD21）；河南省自然科学基金项目（232300420031）作者简介：陆琼，硕士，讲师，研究方向：动物生理与免疫，E-mail：*通信作者Corresponding author，教授，硕士生导师，E-mail：390陆琼等：日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究ating abilities.Both the results of whole mount in situ hybridization and qPCR suggested that RNAi-Djhsp60 down-regulated the expression of stem cell-related genes.In conclusion，this study reveals that Djhsp60 may play an essential role in planarian regeneration，and lays a basis for further investigating the molecular mechanism of Djhsp60 in the regulation of stem cell proliferation in planarians.Keywords:Dugesia japonica；hsp60 gene；molecular cloning；RNA interference；regeneration干细胞是动物组织和器官再生的重要细胞来源，但干细胞稳态受到一些外在的（如电离辐射、重金属和药物等）和内在的（如活性氧等）有害因素的影响（Cielar-Pobuda et al.，2017；Salvetti et al.，2020）。因此，干细胞维持在细胞世代中的稳定性和持续的自我更新能力必然受到一系列蛋白质的保护（Fan，2012）。热休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一类在细胞应激状态下表达的蛋白质，研究发现该类蛋白质在各类干细胞中高表达，对维持干细胞内的稳态具有重要的保护作用（Shende et al.，2019）。淡水涡虫作为研究再生的经典模式动物，逐渐受到国内学者的广泛关注（王志红等，2019；马克学等，2021；张芬熙等，2021）。涡虫强大的再生能力基于其体内被称为“Neoblasts”的多能干细胞（宇文延青等，2016；Reddien，2018），它可以分化形成神经细胞、肌肉细胞、肠道细胞和表皮细胞等。HSP60是热休克蛋白家族中的重要成员，研究发现其对鱼鳍再生及造血干细胞、胚胎干细胞的稳态维持很重要（Makino et al.，2005；Seo et al.，2018；Choi et al.，2022）。但 HSP60 在涡虫再生中的研究还不深入。本文从日本三角涡虫 Dugesia japonica 中克隆了 HSP60的 cDNA 全长序列，初步研究了其在涡虫再生中的表达模式，以及干扰HSP60表达对涡虫再生的影响。上述工作为深入研究HSP60在涡虫再生和抗逆性中的作用机制奠定了良好基础。1材料与方法1.1实验动物日本三角涡虫为本实验室无性繁殖获得的单克隆品系，18 避光培养，每2周喂食一次牛肝，实验前至少饥饿1周。再生用涡虫沿咽前咽后切割成3段，置于20 培养，分别于再生 1 d、3 d、5 d、7 d收集涡虫提取RNA和进行原位杂交实验，以整体涡虫为对照。1.2总RNA提取和Djhsp60 cDNA克隆将涡虫于液氮中研磨成粉末后加入 Trizol试剂，按照试剂盒操作说明提取总 RNA，然后将总RNA 反转录成 cDNA，并以此为模板进行 PCR 扩增。根据本实验室筛选的 Djhsp60 EST 序列设计3-RACE 和 5-RACE 特异性引物（表 1），按照RACE cDNA 试 剂 盒（Clontech）进 行 PCR 扩 增。PCR 片段经纯化后连接 pMD19-T载体，筛选阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司测序分析，根据测序结果拼接出Djhsp60全长cDNA序列。1.3Djhsp60基因组结构分析根据Djhsp60 cDNA全长序列，设计1对特异性引物（表1），以DNA为模板进行PCR扩增。PCR片段经纯化后连接 pMD19-T载体，筛选阳性克隆送苏州金唯智生物科技有限公司测序分析。通过比较Djhsp60基因DNA序列和cDNA序列即可获得基因组内含子信息。1.4生物信息学分析序列同源性比对和相似性搜索在NCBI（http：/www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）进行，多序列比对采用DNAMAN6.0，开放阅读框预测和氨基酸序列分析采用 DNAstar 5.0，蛋白质结构域分析采用 Expert Protein Analysis System（http：/www.expasy.org），HSP60 亲缘关系树采用 Clustal x 1.83 和 Mega 3.1构建，以人 Homo sapiens为外群，系统树各分支的置信度由Bootstrap 1 000次循环检验。391四川动物 2023 年 第 42 卷 第 4 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.4 20231.5qPCR分析总RNA提取和cDNA合成同前。PCR反应体系为 20 L：2TB Green Premix Ex Taq（ROX plus）10 L，上、下游引物各 0.8 L，cDNA 模板1 L，灭菌超纯水7.4 L。PCR反应在ABI 7500系统中进行：95 5 min；95 10 s，60 1 min，40个循环。以持家基因 Djef2 为内参，以 2CT法计算mRNA 相对表达量，实验重复 3 次。采用 SPASS 10.0进行单因子方差分析，P16 h；6、样品经过充分洗涤后加入anti-DIG-AP抗体，4 孵育过夜，杂交信号用BCIP/NBT显色，Leica DFC300FX显微镜拍照后用Adobe Photoshop处理。双荧光原位杂交实验样品处理步骤同前，杂交液中含Dig-标记的Djhsp60探针和Fluorescein-标记的DjwiA探针。杂交完成样品洗涤后先用anti-DIG-POD（1 2 000 稀释；Roche，Catalog No.11207733910）表1本实验所用引物Table 1Primers used in this study引物名称5GSP15GSP23GSP13GSP2Hsp60F1Hsp60R1Hsp60F2Hsp60R2DjwiAF1DjwiAR1Hsp60F3Hsp60R3GFPFGFPRqHsp60FqHsp60RDjpcnaFDjpcnaRDjwiAF2DjwiAR2Djmcm2FDjmcm2RDjh2bFDjh2bRDjEF2FDjEF2R用途5-RACE5-RACE3-RACE3-RACEDNA PCRDNA PCRWISHWISHWISHWISHdsRNAdsRNAdsRNAdsRNAqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCRqPCR序列5-CCATTAGCGGAAATAGTTGCTACC-35-CAATTTCTTCTGGTGTCGTGACAGG-35-ACTCTCAGAGATATGGCAACTTCC-35-GAGAATGTTCAACTACACGATTTGG-35-TTATAACGTGATGTTTAGACTTGC-35-CATATTTCTTTACATCATTCCTCC-35-CAAACGAAGAAGCTGGTGATGGTAC-35-CTCCTGACGCATCAACTAAAGC-35-GAAGAACAGCCCATTACTATCCG TG-35-GAGTCGCTCCACGATGAACCTTGCC-35-ACGAAGAAGCTGGTGATGGTAC-35-CTCCTGACGCATCAACTAAAGC-35-CGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCC-35-AGCTCGTCCATGCCGTGAGTGATCC-35-CACCATGTTACACCATTGCCC-35-CCACCCATACCTCCCATTCCAC-35-AGCTACCGGAGATATTGGTAATGG-35-GAGACACGATAGGTGAAAGAGGC-35-GGTTATTCCACAACTATTACAAGAG-35-AATCTACTTCGTCATTGATATCC-35-GAGGAGGAGAAGAAGGATGT-35-GCTGTGCTCAAACTGGGACT-35-TGAGTTTTGCCGATGCTGAACACG-35-GTCTTATCTCTCACGATTGCTGCG-35-TTAATGATGGGAAGATATGTTG-35-GTACCATAGGATCTGACTTTGC-3扩增长度/bp5775498748051 7661 2901 2221 287507277168220161125250392陆琼等：日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究抗体4 孵育过夜，用Rhodamine-tyramide避光显色。样品再次洗涤后用anti-fluorescein-POD（1 2 000稀释；Roche，Catalog No.11426346910）抗体4 孵育过夜，用 FITC-tyramide 避光显色。蔡司体式荧光显微镜（Axio Zoom.V16）拍照后用附带的软件处理。1.7RNAi实验双链 RNA（dsRNA）的合成按照 Rouhana 等（2013）提供的方法进行。将合成的 10 g dsRNA与 20 L牛肝匀浆混合后，喂食 25条左右长度为34 mm涡虫，间隔3 d喂食一次，共喂食5次。以GFP dsRNA作对照。当涡虫头部开始退化时切割涡虫观察再生表型，用Leica DFC300FX显微镜拍照，图片用Adobe Photoshop处理。收集再生5 d的个体用于qPCR检测和原位杂交实验。2结果2.1日本三角涡虫hsp60基因的分子特征采用RACE技术获得日本三角涡虫hsp60基因的全长cDNA序列1 851 bp，5-有50 bp的非翻译区，3-有 73 bp 的非翻译区并含有 polyA 尾，在polyA 尾上游 14 bp 处可见 AATAAA 的加尾信号（图1）。将该序列命名为Djhsp60，并在GenBank注册（GenBank登录号：MH509193）。Djhsp60基因的开放阅读框长度1 728 bp，编码575个氨基酸，分子图1日本三角涡虫hsp60基因的核苷酸序列和编码区蛋白质序列Fig.1Nucleotide sequence of hsp60 gene and the deduced amino acidin the coding region of planarian Dugesia japonica方框示起始密码子、终止密码子和polyA加尾信号，单下划线示N端线粒体导肽序列和ATP结合结构域，双下划线示HSP60的标签序列和C端GGM重复结构域，*终止密码子The start codon，stop codon and polyadenylation signal（AATAAA）were boxed，the N-terminal leading peptide that is required for importing into mitochondria and ATP-binding motif were underlined，the classical mt-HSP60 signature motifs and a typical GGM repeat motif at the C terminus were double underlined，*stop codon393四川动物 2023 年 第 42 卷 第 4 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.4 2023量 61.7 kD，理论等电点 5.79。DjHSP60 的蛋白质序列中N端含有进入线粒体的导肽序列，C端含有典型的GGM重复序列，中间区域含有HSP60蛋白家族高度保守的标签序列（AAVEEGIVPGGG）和ATP 结合结构域。亚细胞定位分析显示（http：/ HSP60蛋白家族。此外还测序了Djhs60的DNA序列，发现该基因结构区仅有 1个内含子，位于第 56 位赖氨酸密码子AAA 和第57位甘氨酸密码子GGT之间，内含子的5-和3-拼接位点符合典型的“GT-AG”法则（图2）。2.2DjHSP60的亲缘关系分析NCBI Blast检索分析显示，DjHSP60氨基酸序列与已经报道的脊椎动物和无脊椎动物HSP60s的氨基酸序列高度同源，与人、小鼠Mus musculus和斑马鱼 Danio rerio 的同源性分别是 71.4%、71.8%和71.7%，与果蝇Drosophila melanogaster和日本血吸虫Schistosoma japonicum 的同源性分别是73.4%和78.9%。地中海涡虫Schmidtea mediterranea基因组数据库（http：/smedgd.neuro.utah.edu）的检索结果显示，其 同 源 性 基 因 Smedhsp60 编 码 的 也 是575 个氨基酸的蛋白质，与 DjHSP60 的一致性为95.1%。HSP60亲缘关系树显示，所有的吸虫和绦虫分别聚类形成2个独立的姊妹分支，而自由生活的涡虫则从寄生虫中独立出来形成一个单独的分支，与人的亲缘关系更近。2.3Djhsp60的表达模式分析整体原位杂交显示，Djhsp60阳性细胞在除咽以外的组织中均有表达（图4：A），尤其是在实质组织中表达量较高，且阳性细胞成簇分布（图4：A1）。双荧光原位杂交显示，Djhsp60 与涡虫干细胞marker基因DjwiA的表达模式非常相似，存在明显图2Djhsp60基因结构（方框示内含子）Fig.2Structure of Djhsp60 gene（intron between AAA codon and GGT codon was boxed）图3基于邻接法建立的扁形动物门HSP60家族亲缘关系树Fig.3Phylogenetic tree of HSP60 family members from Platyhelminthes based on the Neighbour-Joining394陆琼等：日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究的共表达现象（图4：B）。原位杂交显示，涡虫再生1 d，Djhsp60的阳性表达信号在伤口下的组织中显著增强（图 4：C）。随再生进行，Djhsp60的阳性表达信号逐渐减弱（图4：C）。qPCR检测结果显示，与对照组相比，Djhsp60表达量在再生1 d后升高了约 5.3 倍，然 后 随 再 生 进 行 表 达 量 逐 渐 下 降（图4：D）。2.4干扰Djhsp60对涡虫再生的影响干扰 20 d 后，涡虫头部逐渐退化直至消失（图 5：A1A3）。进一步研究发现，干扰组涡虫丧失了再生能力（图 5：B1B4）。qPCR 检测结果显示，干扰后内源性 Djhsp60 表达量降低了约 60%图4Djhsp60的表达模式Fig.4Expression pattern of Djhsp60A.Djhsp60 在整体涡虫中的表达模式，ph.咽，比例尺=0.5 mm，A1.黑框放大；B.双荧光原位杂交示 DjwiA 和 Djhsp60 共表达，比例尺=0.2 mm；C.整体原位杂交示涡虫再生过程中 Djhsp60的表达模式，比例尺=0.5 mm；D.qPCR 示涡虫再生过程中 Djhsp60的表达变化，*P0.000 1A.expression pattern of Djhsp60 in intact animals，ph.pharynx，scale bar=0.5 mm，A1.the amplication of the box；B.co-expression of DjwiA/Djhsp60 revealed by double-FISH，scale bars=0.2 mm；C.expression pattern of Djhsp60 in regenerating animals revealed by whole mount in situ hybridization，scale bars=0.5 mm；D.changes of Djhsp60 expression during planarian regeneration detected by qPCR，*P0.000 1395四川动物 2023 年 第 42 卷 第 4 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.4 2023（图 5：C1）。原位杂交结果显示，干扰后的虫体Djhsp60 转 录 本 的 表 达 信 号 显 著 减 少（图 5：C2、C3）。2.5干扰Djhsp60对涡虫干细胞相关基因表达的影响原位杂交结果显示，干扰组几乎检测不到涡虫干细胞标志基因 DjwiA 的阳性表达（图6：A）。qPCR 结果显示，干扰组涡虫 DjwiA 的表达量是对照组的0.18倍，表达量减少约80%；其他涡虫干细胞marker基因Djmcm2、Djpcna和Djh2b的表达量也显著降低，分别是对照组的0.25倍、0.33倍和0.13倍（图6：B）。图5干扰Djhsp60对涡虫再生和组织稳态的影响Fig.5Effects of RNAi-Djhsp60 on planarian regeneration and homeostasisA1A3.涡虫头部：A1.对照组，A2，A3.干扰组；B1B4.再生涡虫：B1，B2.对照组，B3，B4.干扰组；C1C3.Djhsp60基因的表达：C1.相对表达量，C2.对照组，C3.干扰组；*P0.001；比例尺=1 mmA1A3.planaria head：A1.control group，A2，A3.RNAi group；B1B4.regenerating planaria：B1，B2.control group，B3，B4.RNAi group；C1C3.expression of Djhsp60 gene：C1.relative expression level，C2.control group，C3.RNAi group；*P0.001；scale bars=1 mm396陆琼等：日本三角涡虫hsp60基因的分子克隆和功能研究3讨论HSP60是热休克蛋白家族中的重要成员，主要分布在线粒体，对线粒体稳态的维持发挥重要作用（Duan et al.，2020）。Seo 等（2018）发现，HSP60在干细胞中表达较高，参与干细胞增殖的调控。淡水涡虫是研究再生的经典模式动物，涡虫再生依赖其体内的多能干细胞。已有研究发现，一些热休克蛋白家族成员如HSP90、HSP70和HSP40在涡虫干细胞表达且是涡虫再生所必需的基因（Dong et al.，2018；Wang et al.，2019；Wang et al.，2022）。但 HSP60在涡虫中的研究较少。本文首先采用RACE技术从日本三角涡虫中克隆出hsp60基因的全长cDNA序列，并推导出其编码的氨基酸序列。经检索分析，无论是核苷酸序列还是蛋白质序列，都与目前报道的 HSP60 高度同源，且DjHSP60含有HSP60家族的标签序列和C-端高度保守的GGM重复序列。研究还发现，Djhsp60仅含有1个内含子。内含子少便于转录本的快速加工剪切，以应对环境应急做出快速反应，这可能是涡虫热休克蛋白基因的共性特征（马克学等，2013；Ma et al.，2014）。HSP60系统进化树显示，涡虫比绦虫和吸虫更接近人类，这与最新提出的涡虫的分类地位一致（陈广文，马克学，2008）。涡虫干细胞属于未分化细胞，主要在实质组织中分布。而高度分化的组织如肌肉质的咽中的干细胞较少。本研究发现，Djhsp60转录本主要在皮下实质组织中表达，且成簇分布，与 Orri 等（2005）报道的涡虫干细胞分布模式非常相似。此外，Djhsp60 与涡虫干细胞 marker 基因 DjwiA 共表达。且地中海涡虫信息学数据库（https：/planosphere.stowers.org/feature/Schmitea/mediterranea-sex ual/transcript/SMED30025522）检索表明，HSP60 在Smedwi1（地中海涡虫干细胞标志基因，与DjwiA同源）阳性细胞中表达，进一步说明Djhsp60阳性细胞具有干细胞的特征。涡虫切割后1 d，Djhsp60强阳性表达信号出现在伤口下组织中，说明此处干细胞增殖活跃，急需产生大量的新生细胞来再生出缺失的组织和器官。随涡虫再生进行，新再生组织（如前端头部）细胞逐渐分化，Djhsp60阳性表达信号逐渐减弱。这种表达模式与Seo等（2018）报道的基本一致，即 HSP60在干细胞中的表达量高而在分化细胞中表达量低，敲除 HSP60表达影响干细胞增殖。本研究还发现，干扰后的涡虫耳突结构消失、头部逐渐退化。干扰Djhsp60的表型与干扰地中海涡虫干细胞标志基因Smedwi1的表型非常相似（Reddien et al.，2005）。因为涡虫耳突前的组织缺乏干细胞，干扰很可能影响了涡虫干细胞的增殖，导致头部组织不能有效地进行细胞更新，所以干扰后涡虫头部组织逐渐退化消失。此外，干扰后绝大多数虫子丧失了再生能力，进一步图6干扰Djhsp60对涡虫干细胞相关基因表达的影响Fig.6Effects of RNAi-Djhsp60 on the expression ofplanarian stem cell-related genesA1A2.原位杂交：A1.对照组，A2.干扰组；B.相对表达量，*P0.001A1 A2.whole mount in situ hybridization：A1.control group，A2.RNAi group；B.relative expression level，*P0.001397四川动物 2023 年 第 42 卷 第 4 期Sichuan Journal of Zoology Vol.42 No.4 2023说明干扰很可能影响了干细胞的功能。原位杂交和qPCR技术研究干细胞相关基因的表达变化，结果发现，干扰后涡虫干细胞相关基因的表达量极显著降低。上述研究表明，Djhsp60属于涡虫干细胞相关基因，在涡虫再生和组织稳态维持中发挥重要作用。本文报道了日本三角涡虫HSP60的核苷酸序列和氨基酸序列，初步研究了其表达谱和干扰其表达对涡虫再生的影响，为进一步深入研究其在涡虫再生和环境应激反应中的作用奠定了良好基础。参考文献:陈广文，马克学.2008.淡水涡虫：分类地位、胚胎发生和再生 J.河南师范大学学报（自然科学版），36（4）：140-143.马克学，冯程程，豆贺，等.2013.日本三角涡虫热休克蛋白 90 基因克隆及其表达模式 J.解剖学报，44（6）：778-783.马克学，李睿，郭芳莹，等.2021.细胞自噬基因Atg6在涡虫中枢神经系统再生中的功能研究 J.遗传，43（8）：792-801.王志红，王超，彭锐.2019.日本三角涡虫Caspase-7基因克隆及功能研究 J.四川动物，38（1）：11-19.宇文延青，苟士正，陈广文.2016.日本三角涡虫成体干细胞的异质性研究进展 J.四川动物，35（5）：797-800.张芬熙，董自梅，陈广文，等.2021.日本三角涡虫体内Djcullin1基因和 Djtinp1基因的相互作用研究 J.四川动物，40（2）：142-149.Choi HS，Lee HM，Kim MK，et al.2022.Role of heat shock protein 60 in primed and nave states of human pluripotent stem cells J/OL.PLoS ONE，17（6）：e0269547 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