牛大力提取物对小鼠的急性毒性与遗传毒性研究.pdf

接收日期：2023-04-14 接受日期：2023-05-29 基金项目：广东普通高校重点领域(乡村振兴战略)项目(2019KZDZX2003)*通信作者。E-mail: 牛大力提取物对小鼠的急性毒性与牛大力提取物对小鼠的急性毒性与 遗传毒性研究遗传毒性研究 赵羽洁1，陈美芬2，李 欣2，张紫虹2，黄金文1，黄俊明1，张 焜1，李冬利1*(1.五邑大学生物科技与大健康学院，广东 江门 529000；2.广东省疾病预防控制中心，广东 广州 510000)摘 要：本研究评价了牛大力提取物的急性毒性和遗传毒性。采用限量法进行急性毒性试验；采用平板掺入法，对有组氨酸营养缺陷的 5 株鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株 TA97a、TA98、TA100、TA102 和 TA1535 进行回变菌落计数；经口灌胃法进行哺乳动物红细胞微核试验，计数骨髓嗜多染红细胞占总红细胞的比例及含微核嗜多染红细胞比率；采用中国仓鼠肺细胞(CHL)培养技术进行染色体畸变试验，观察受试样品牛大力提取物致 CHL 细胞株染色体数目及结构变化。结果显示，受试样品牛大力提取物属实际无毒级物质，细菌回复突变试验、红细胞微核试验、染色体畸变试验结果均为阴性。牛大力提取物在本试验剂量范围内未观察到急性毒性和遗传毒性。关键词：牛大力；急性毒性；遗传毒性 Doi:10.3969/j.issn.1009-7791.2023.03.004 中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：1009-7791(2023)03-0197-06 Acute Toxicity and Genotoxicity Test Study of Extracts from Millettia speciosa Roots ZHAO Yu-jie1,CHEN Mei-fen2,LI Xin2,ZHANG Zi-hong2,HUANG Jin-wen1,HUANG Jun-ming1,ZHANG Kun1,LI Dong-li1*(1.School of Biotechnology and Health Sciences,Wuyi University,Jiangmen 529000,Guangdong China;2.Guangdong Provincial Center for Disease Control and Prevention,Guangzhou 510000,Guangdong China)Abstract:This study evaluated the acute toxicity and genotoxicity of Niudali(Millettia speciosa roots)extracts.The limit method was used in acute toxicity test.The plate incorporation method was used in bacterial revert mutation test,and five strains of Salmonella typhimurium mutant strains TA97a,TA98,TA100,TA102 and TA1535 with histidine nutritional deficiency were counted back.The proportion of bone marrow polychromatic erythrocytes in total red blood cells and the proportion of micronucleus-containing polychromatic erythrocyte were counting in mammalian erythrocyte micronucleus test.Chromosomal aberration test was carried out through Chinese hamster lung(CHL)cell culture technology,the chromosome number and structural changes of CHL cell lines infected with samples were observed.The results showed that the tested samples were practically non-toxic,and the results of bacterial reversion mutation test,erythrocyte micronucleus test and chromosome aberration test were all negative.No acute toxicity or genotoxicity were observed within the dose range of this test for Niudali extracts.2023,52(3):197202.Subtropical Plant Science 第 52 卷 198Key words:Millettia speciosa root;acute toxicity;genetic toxicity 牛大力为豆科崖豆藤属美丽崖豆藤 Millettia specisoa 的根，主要分布于广东、广西、海南等长江流域以南地区，可供药用，具有补虚润肺、强筋活络等功效1。此外，牛大力还具有广泛的药理活性，包括免疫调节2、抗疲劳3、抗氧化4等。近年来，牛大力深受大众追捧和热爱，可用作煲汤制药的原料，市场需求不断增加。根据卫生部关于进一步规范保健食品原料管理的通知(卫法监发200251号)要求，牛大力并不在既是食品又是药品的物品名单及可用于保健食品的物品名单中。国家卫计委2018 年 6 月对“牛大力粉”申报新食品原料给出的审查结论为“鉴于该产品具有地方传统食用习惯，建议按照食品安全法第 29 条管理，终止审查”，即对牛大力有传统食用习惯的省份可通过制定食品安全地方标准进行管理。但目前对于牛大力毒性研究还不够系统1,5。因此，作者项目团队在对牛大力进行全面的食品安全性毒理学评价基础上牵头制定了广东省食品安全地方标准牛大力干制品(DBS 44/016-2021)，为广东省牛大力作为食品开发和应用奠定基础。本文主要报道基于食品安全国家标准610，牛大力提取物的小鼠急性经口毒性试验、细菌回复突变试验、哺乳动物红细胞微核试验及体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果。1 材料与方法 1.1 试验药物 采集广东江门市恩平良西镇种植的牛大力植物新鲜根，洗净切成约 1 cm 小段，晒干或烘干。按以下方法提取：加入 10 倍体积的 50%乙醇煮沸回流提取 2 h，过滤；滤渣再以同样方法提取，过滤；滤渣用 10 倍体积水再次煮沸回流提取 2 h，过滤得滤液和滤渣；将三次滤液合并，浓缩至可流动的浸膏，尽量减小体积，得到牛大力提取物浓缩液样品。700 kg 牛大力干品经提取浓缩得到提取物浓缩液 57.0 L，重量 72.0 kg，提取物得率 10.3%，密度为 1.26 gmL1，浓缩比例为 12.3 g(药材)mL1。拟定牛大力干品的人体推荐每日服用量为 15 g，以成人体重 60 kg 计，推荐量为 0.25 gkg1 BW，按牛大力(提取物浓缩液)得率 10.3%折算，则牛大力(提取物浓缩液)每日推荐量为 0.02575 gkg1 BW，以下各试验均采用牛大力(提取物浓缩液)进行。1.2 供试动物 广东省医学实验动物中心提供的昆明种 SPF 级健康小白鼠，生产许可证号：SCXK(粤)2018-0002；颗粒饲料由广东省医学实验动物中心提供，使用许可证号：SYXK(粤)2018-0011；动物实验室为屏障环境，室温 2026，相对湿度 40%70%。1.3 方法 1.3.1 小鼠急性经口毒性试验小鼠急性经口毒性试验 采用限量法11，选用体重 1822 g 健康昆明种小白鼠 20 只(质量合格证编号：44007200080668)，雌雄各半，禁食不禁水 4 h 后，空腹灌胃 1 次，灌胃剂量为 0.3 mL10 g1 BW，观察 14 d，记录小鼠的增重量及死亡情况。1.3.2 细菌回复突变试验细菌回复突变试验 采用符合要求的 TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535等5种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌突变型菌株，在加及不加代谢活化系统 S9 条件下采用平板掺入法进行试验11。设牛大力（提取物浓缩液）最高剂量为每皿 5000 g，按 5 倍间隔，共设五个剂量组，分别为每皿 5000、1000、200、40、8 g，以上五组受试液经过 20 min、121、0.103 MPa 高压灭菌后使用。另设各类阳性对照组、蒸馏水对照组、二甲亚砜对照组和未处理对照组。阳性对照物分别为 NaN3、2-AF、丝裂霉素 C、1,8-二羟蒽醌、2-AA和敌克松。在顶层培养基中加入 0.10 mL 试验菌株增菌液，0.10 mL 受试物溶液和 0.50 mL S9 混合液(当代谢活化时加入)，混匀后倒入底层培养基平板上，每一剂量组均为 3 个平皿。置于 37 下培养48 h，记录每个平皿回变菌落数，计算各试验组 3个平皿回变菌落数的均数和标准差。如在背景生长良好的条件下，测试菌株 TA98、TA1535 的回变菌落数等于或大于未处理对照组的 2 倍，测试菌株第 3 期 赵羽洁等：牛大力提取物对小鼠的急性毒性与遗传毒性研究 199TA97a、TA100、TA102 的回变菌落数等于或大于未处理对照组的 2 倍，并具有以下 a、b 两种情况之一的可判定为阳性结果：a 为有剂量-反应关系；b 为某一测试点有可重复的阳性结果。1.3.3 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 选择昆明种小鼠 50 只(质量合格证编号：44007200082167)，体重 2535 g，随机分为 5 组，每组 10 只，雌雄各半。设 10.0、5.0、2.5 gkg1 BW三个剂量组，另设阴性对照组(超纯水)和阳性对照组(40 mgkg1 BW 环磷酰胺)。采用 30 h 给受试物法进行试验，经口灌胃，灌胃剂量 0.2 mL10 g1 BW，第一次灌胃 24 h 后以同样剂量进行第二次灌胃，6 h后处死小鼠，取胸骨骨髓材料制片、染色，每只小鼠观察 2000 个嗜多染红细胞(PCE)，计数含有微核的嗜多染红细胞数；若一个嗜多染红细胞中出现两个或两个以上微核，仍按一个有微核细胞计数，计算各组含微核细胞率()。同时记录观察 200 个红细胞(RBC)中嗜多染红细胞数(PCE)，计算 PCE/RBC比值。1.3.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验体外哺乳类细胞染色体畸变试验 根据受试物对细胞的毒性及其溶解度，确定受试物最高剂量为 2500 gmL1，称取牛大力(提取物浓缩液)2.5 g，加 PBS 至 100.0 mL，混合均匀，以此为基础用 PBS 依次作 2 倍稀释得一系列相应剂量的染毒液(2500、1250、625 gmL1)，于 121，0.103 MPa 高压灭菌 20 min 后使用，另设阴性对照组(PBS)、阳性对照组(15 gmL1环磷酰胺、0.5 gmL1丝裂霉素 C)。将中国仓鼠肺细胞(CHL)接种于六孔培养板中，接种密度 5105个孔1，置于 37、5%CO2培养箱中培养 24 h 后，吸去培养板中的培养液，加入不同浓度受试物溶液、S9 混合液(不加 S9 混合液时，需用培养液补足)以及一定量不含血清的培养液，置培养箱中染毒 4 h 后用 PBS 洗细胞，加入含 10%胎牛血清培养液，继续培养 24 h收获细胞，收获前 4 h 加入秋水仙素(终浓度为 1.0 gmL1)。按常规方法消化、低渗、固定、制片、Giemsa 染色，在油镜下阅片观察。每处理分别选取 100 个分散良好的中期分裂相细胞，分析染色体结构和数目改变情况，并计算染色体畸变细胞率。1.4 数据统计 采用 SPSS 16.0 统计软件分析数据。微核发生 率以含微核 PCE 千分率计，均按泊松分布进行统计分析；计量数据以平均数标准差表示，采用单因素方差分析对多个试验组与对照组之间均数进行比较；其余计数资料采用卡方检验。2 结果与分析 2.1 急性毒性分析 受试样品牛大力(提取物浓缩液)20.0 gkg1 BW剂量组未观察到动物出现中毒反应和死亡，因此雌雄性小鼠 LD5020.0 gkg1 BW，相当于受试物人体推荐每日服用量的 777 倍(表 1)。按照保健食品安全性毒理学评价程序和检验方法规范中的剂量分级规定，受试样品牛大力(提取物浓缩液)属实际无毒级物质。表 1 小鼠急性经口毒性试验结果 Table 1 Results of acute oral toxicity test in mice 剂量/gkg1 BW动物数/只 始重/g 终重/g 死亡数/只 LD50/gkg1 BW 雌性 20.010 19.81.234.31.2 0 20.0 雄性 20.010 20.01.035.71.1 0 20.0 2.2 细菌回复突变结果 受试样品牛大力(提取物浓缩液)对鼠伤寒沙门氏菌 TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535 等 5种试验菌株的细菌回复突变结果显示，加或不加S9，五个剂量组处理的不同菌株回变菌落数均未超过未处理对照组的 2 倍，亦无剂量-反应关系或可重复的并有统计学意义的阳性反应测试点(表 2、表 3)。因此，在该试验条件下，受试样品牛大力(提取物浓缩液)的细菌回复突变试验结果为阴性。2.3 哺乳动物红细胞微核试验 与阴性对照组比较，受试样品牛大力(提取物浓缩液)各剂量组PCE/RBC比值不小于阴性对照组的 20%，说明受试样品未出现细胞毒性；受试样品牛大力(提取物浓缩液)2.510.0 gkg1 BW 剂量组的含微核细胞率与阴性对照组比较，均无显著差异(P0.05)，且雌性小鼠和雄性小鼠结果一致(表 4、表 5)。第 52 卷 200以上结果显示，在该试验条件下受试样品牛大力(提取物浓缩液)的小鼠红细胞微核试验结果为阴性。表 2 第一次细菌回复突变试验结果(xs)Table 2 Results of the first bacterial reverse mutation test(xs)TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 受试物 剂量/g皿1 [phone] 453 473 1675 1757 39914 46712 212 232 2 1000 1337 1404 444 452 1625 1666 3817 43617 204 233 3 200 1255 1365 395 422 14610 1686 36114 41114 213 212 4 40 1267 1223 392 382 1447 1416 3538 38511 182 192 样品组 5 8 1206 1163 352 433 1366 1429 33121 3597 162 181 未处理对照 1085 1106 364 393 1275 1387 27813 29714 153 175 蒸馏水对照 1127 1156 383 412 1277 1406 28211 30112 133 184 二甲基亚砜 965 1173 402 403 1287 1305 29120 29615 142 133 阳性物对照 NaN3 1.5 1341133 1815123 2-AF 10.0 164679 1638124 1733106 敌克松 50.0 2374150 1245100 丝裂霉素 4.0 2083166 1,8-二羟蒽醌 50.0 1235151 2-AA 10.0 123195注：“”表示未加 S9，“+”表示加 S9，表 3、表 6 同。表 3 第二次细菌回复突变试验结果(xs)Table 3 Results of the second bacterial reverse mutation test(xs)TA97a TA98 TA100 TA102 TA1535 受试物 剂量/g皿1 [phone] 442 463 1657 1779 3707 44016 203 242 2 1000 1373 1455 374 424 1608 1715 3738 43510 213 191 3 200 1405 1403 392 381 1458 1605 35414 41311 171 192 4 40 1274 1313 384 403 15111 1465 3398 3819 173 213 样品组 5 8 1255 1256 372 393 1362 1477 30110 33611 162 172 未处理对照 1094 1105 353 404 1295 1348 2839 3058 182 184 蒸馏水对照 1105 1137 3373 393 1327 1404 28411 30010 123 175 二甲基亚砜 965 1184 392 403 1286 1334 29012 29513 143 152 阳性物对照 NaN3 1.5 134783 1770109 2-AF 10.0 1602109 1662102 1650110 敌克松 50.0 2297114 125581 丝裂霉素 4.0 2135100 1,8-二羟蒽醌 50.0 123889 2-AA 10.0 114381 第 3 期 赵羽洁等：牛大力提取物对小鼠的急性毒性与遗传毒性研究 2012.4 体外哺乳类细胞染色体畸变试验 经统计分析，受试样品牛大力(提取物浓缩液)处理 CHL 细胞，不管加或者不加 S9，各剂量组的染色体畸变细胞率与阴性对照组均无显著差异(P0.05)(表 6)。因此，在该试验条件下受试物牛大力(提取物浓缩液)的体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果为阴性。表 4 雌性小鼠红细胞微核试验结果 Table 4 Results of erythrocyte micronucleus test in female mice 剂量/gkg1 BW 动物数/只 PCE 数/个 含微核细胞数/个 含微核细胞率/200 个 RBC 中 PCE 数/个 PCE/RBC 0(阴性对照)5 10000 17 1.70.6 12012 0.600.06 2.5 5 10000 16 1.60.7 12010 0.600.05 5.0 5 10000 16 1.60.4 12210 0.610.05 10.0 5 10000 20 2.00.9 10914 0.550.07 环磷酰胺(0.04)5 10000 244 24.49.0*10018 0.500.09 注：雌鼠阴性对照含微核细胞率历史范围 03，雌鼠阳性对照含微核细胞率历史范围 1231；*表示与阴性对照组差异极显著(P0.01)。表 5 雄性小鼠红细胞微核试验结果 Table 5 Results of erythrocyte micronucleus test in male mice 剂量/gkg1 BW 动物数/只 PCE 数/个 含微核细胞数/个 含微核细胞率/200 个 RBC 中 PCE 数 PCE/RBC 0(阴性对照)5 10000 14 1.40.4 11612 0.580.06 2.5 5 10000 19 1.90.4 12114 0.610.07 5.0 5 10000 18 1.80.9 1166 0.580.03 10.0 5 10000 23 2.30.6 12315 0.610.08 环磷酰胺(0.04)5 10000 225 22.52.9*10113 0.510.07 注：雄鼠阴性对照含微核细胞率历史范围 03，雄鼠阳性对照含微核细胞率历史范围 1434；*表示与阴性对照组差异极显著(P0.01)。表 6 体外哺乳类细胞染色体畸变试验结果 Table 6 Test results of mammalian cell chromosome aberration in vitro 观察细胞数/个 染色体畸变细胞数/个 染色体畸变细胞率/%组别 终浓度/gmL1+阴性对照 100 100 1 2 1.0 2.0 剂量 1 2500 100 100 6 2 6.0 2.0 剂量 2 1250 100 100 4 2 4.0 2.0 剂量 3 625 100 100 5 4 5.0 4.0 环磷酰胺 15 100 39 39.0*丝裂霉素 C 0.5 100 28 28.0*注：阴性对照染色体畸变细胞率历史范围 1%3%(+S9)、1%3%(S9)，阳性对照染色体畸变细胞率历史范围 18%42%(+S9)、16%34%(S9)；*表示与阴性对照组差异极显著(P0.01)。3 讨论 牛大力在全国中草药汇编 中华本草 现代本草纲目等药学专著中均有记载，其气味甘香、药性温和，具有壮阳、养肾补虚、强筋活络、平肝、润肺的功效，对腰酸腿痛、风湿病、慢性肝炎、慢 性支气管炎、咳嗽、肺结核等有很好的疗效12，还有一定的清热提神、抗疲劳等功效13。牛大力提取物具有广阔的市场前景，但作为食品原料开发利用还缺乏充分的毒理安全评价支撑。杨增艳等14对小鼠的最大耐受量(MTD)进行测定，发现牛大力的水、醇提物最大给药量均比成人日剂量的 100 倍还要 第 52 卷 202大，受试动物不仅均未出现任何中毒症状，而且饮食和活动都正常，无死亡病例，说明牛大力没有明显的毒副作用，但是牛大力醇提物致使小鼠体重减少的状况需结合长期的毒性试验进行分析和考量。急性毒性研究是了解外源化合物对机体产生急性毒性的根本依据，可快速直观反映受试物毒性15。本试验根据 2014 年颁布的食品安全国家标准 食品安全性毒理学评价程序(GB 15193.1-2014)对牛大力提取物进行急性毒性和遗传毒性检测。小鼠经口急性毒性试验表明，牛大力(提取物浓缩液)的 LD5020.0 gkg1 BW，属实际无毒级。根据国家食品安全相关标准，食品遗传毒性研究必须遵循原核细胞与真核细胞、体内与体外试验相结合的方式进行。本研究选择细菌回复突变试验、小鼠骨髓细胞微核试验和体外哺乳动物染色体畸变试验进行测定。细菌回复突变试验检测牛大力提取物对微生物(细菌)的基因突变作用，预测其遗传毒性和潜在的致癌作用；哺乳动物红细胞微核试验通过分析动物骨髓红细胞，检测牛大力提取物是否引起成熟红细胞染色体损伤或有丝分裂装置损伤，预测其致突变性；哺乳类细胞染色体畸变试验通过 CHL细胞进行体外染毒，检测牛大力提取物引起染色体畸变细胞率。细菌回复突变试验结果为阴性，表明当前试验体系下未检出受试物致突变性；小鼠骨髓红细胞微核试验结果为阴性，表明当前试验体系下未检出 DNA 损伤风险；体外细胞染色体畸变试验结果为阴性，表明当前试验体系下未见染色体结构畸变风险。以上三项遗传毒性试验均表明牛大力提取物对哺乳类动物体细胞染色体无损伤作用。牛大力提取物在本研究剂量范围内未检测到急性毒性和遗传毒性，为其进一步食品开发研究提供了理论依据。参考文献 1 广西壮族自治区卫生厅.广西中药材标准M.南宁:广西科学技术出版社,1990:31.2 Huang Z,Zeng Y J,Chen X,Luo S Y,Pu L,Li F Z,Zong M H,Lou W Y.A novel polysaccharide from the 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