气道平滑肌细胞长距离促进胶原基质的重构作用.pdf

生 物 医 学 工 程 研 究 ，（）：国家自然科学基金资助项目（，）。通信作者 ：；气道平滑肌细胞长距离促进胶原基质的重构作用胡燕玲，董羽涵，董伯翊，邓林红，欧阳明星，（常州大学 药学院 医学与健康工程学院，常州 ；常州大学 生物医学工程与健康科学研究院，常州 ）摘要：本研究利用微加工图形技术，设计了气道平滑肌细胞团的点阵排布，通过荧光标记胶原蛋白，以可控和可视化的方式研究细胞长距离促进胶原基质重构的力学机制。实验结果显示，内，相距 的细胞之间能有效生成胶原纤维条带，在相距 的细胞团组之间也有此现象，表明细胞能长距离地精确调控胶原基质的重构作用。进一步探索该现象的细胞力学机制，发现加入肌动蛋白骨架和收缩力的抑制剂均阻止了胶原纤维的发生，而添加钙离子抑制剂的实验结果证明细胞钙信号参与了胶原重构。本研究初步验证了细胞收缩力和钙信号的传导作用，可为进一步深入研究细胞群体力学交流水平上的力学信号转导通路提供思路。关键词：细胞长距离力学通讯；细胞微加工图形排布；胞外基质重构；细胞力学机制中图分类号：；文献标志码：文章编号：（），（，；，）：（），：；引言生物力学在生命过程中起着重要作用，体现在基因表达、机体发育、生长分化、肿瘤转移等 ，其研究关注机械力如何作用于细胞，以及细胞如何感应力学刺激并调控其生物学行为 ；分子结构如何决定其功能 ，以及分子间相互作用怎样调控细胞粘附与聚集 等动力学行为。力学作用通过长程传递引起协同生物学效应的长距离力学通讯也是其研究方向之一 。在长程生物力作用促进胞生物医学工程研究第 卷外基质重构研究方面，年 等 报道了两个分离的成纤维细胞外植体之间通过细胞牵张力作用形成数厘米长的 型胶原纤维条带。近年来，有多项研究结合实验观察和计算模拟来深入理解力在基质胶中的传递和诱导胶原纤维生成的机制 。有研究证实，细胞通过基质传递张应力，激活长距离力学响应而促进细胞定向迁移，并且细胞能通过张应力 作 用 主 动 募 集 胶 原 纤 维，重 塑 细 胞 外 基质 ，表明细胞能够响应基质环境中的长距离力学作用。力学因素如何调控细胞内信号也是研究热点之一，如钙离子信号是细胞内重要的第二信使，通过剪切流的力学刺激定量分析细胞内的钙信号响应 、细胞内钙离子调节室性心动过速的动力学和稳定性 。在细胞间信号交流方面，体外培养的心肌细胞通过基质介导的力学振动交流促进群体协同化的收缩 舒张节律跳动 ；力敏感的离子通道和整合素信号参与细胞间的力学通讯 ；肿瘤细胞通过重构胶原基质形成的纤维发生定向迁移，而细胞能响应力学刺激启动基因表达程序 ，这些结果证明了力学信号能参与细胞间通讯。多细胞生物需要通过细胞间通讯来协调生理功能 。在单细胞水平上，研究证明，内皮细胞（）的牵引力会在聚丙烯酰胺凝胶基质上产生局部张力梯度，影响 的迁移以及与相邻细胞的接触 。细胞之间通过长距离力学作用促进基质重构，或达到群体水平的协同生物学效应，其具体的力学机制仍有待进一步阐明。气道平滑肌是气管的重要结构组成之一，在机体的正常生理过程中发挥着重要作用，近期研究都通过培养气道平滑肌细胞来观察其生物力学行为 。本研究结合细胞团的三维基质胶培养，利用微加工图形技术，初步探究了细胞间通过长距离力学作用促进胶原纤维带发生的机制。材料与方法 材料 细胞种类与来源从 周雌性 大鼠的气管组织中分离、提取并反复提纯得到大鼠气道平滑肌（，）。主要试剂和仪器 低糖培养基、培养基、胎牛血清 、胰蛋白酶、转染试剂盒 等购自美国 ；鼠尾 型胶原（美国 公司）；二甲基亚砜（，上海凌风化学试剂有限公司）；细胞松弛素 、（二盐酸盐）、（）（）均购自美国 公司；（钙螯合剂）购自阿拉丁试剂公司；激光共聚焦培养皿（，公司）；细胞培养箱（日本三洋公司）；倒置显微镜（）、倒置荧光显微镜（）购自德国 公司；模具芯片采用菲林掩膜和硅片模具两种材料分别购自苏州硅时代电子科技有限公司和原位芯片有限公司。方法 聚二甲基硅氧烷模型的制备本研究设计了两个内径 ，边界相隔 的细胞团为一组，每组细胞团间隔 的点阵分布。制备聚二甲基硅氧烷（）模具时，将 与交联剂（，）以 的质量比充分混匀后，浇筑在硅晶圆模具上，抽真空，固化 以上。室温放置过夜后，剥离得到微孔凸出的 模具，用纯化水洗净后泡入 乙醇消毒灭菌备用。蛋白的制备制备 荧光蛋白需要经过细菌转化和表达，进一步提取纯化等步骤 。首先，取微量 质粒转化 感受态细菌，将转化菌液涂在固体 平板上，挑取单菌落于室温液体培养，中间加入 诱导蛋白表达。用 细菌裂解液（）重悬细菌沉淀，加入 琼脂糖微珠结合表达的 ；将混合液转移至纯化柱，通过洗涤、洗脱、透析等步骤获得目标蛋白，测定蛋白浓度后分装储存于 备用。实验设置与细胞培养配置好 琼脂糖凝胶（），取 溶于 内，加热溶解冷却后置于 冰箱备用。实验开始前，首先取 加热过的 琼脂糖凝胶于共聚焦皿上，而后把 模具打印在其上方；然后将大鼠 细胞接种到琼脂糖凝胶上的凹孔中，形成图案化分布的细胞团；最后在上部浇注一层匀质分布的胶原基质（，），使细胞团处于胶原水凝胶层下方。基质凝胶制备过程在冰上进行。取出 蛋白置于冰上溶解，将大鼠尾 型胶原（，）溶液与目标蛋白（提前稀释到 ）以 的体积比充分混匀，孵育 左右，加入与 体积比为 的中和液，补充加入 使 使用浓度达到 ，将混合后的基质溶液加入到提前准备好的细胞实验模具上，铺平整个共聚焦皿，置于 培养箱中凝胶化 第 期胡燕玲，等：气道平滑肌细胞长距离促进胶原基质的重构作用 ，然后添加 培养基。荧光成像在显微镜成像系统中，成像通道的荧光滤片参数为激发（），分光 ，发射（），通过 软件系统控制 和明场成像通道的切换。同时分别选择 倍和 倍的物镜对样品进行荧光成像，单个实验跨度为 ，分别在不同的时间点通过显微镜成像观测荧光标记的胶原纤维和细胞迁移状态。结果 基于微加工图形分布的细胞团长距离促进胶原基质重构利用微加工图案技术，本研究设计了以两个相隔 ，内径为 的细胞团为一组，每组细胞团相距 的点阵，通过大范围的简易图案分布，观测大鼠 细胞在长距离力学作用下促进胶原基质的纤维发生情况 ，。本研究采用三步实验 来定量化调控细胞团的分布：首先，把 模具打印在不黏附细胞的 琼脂糖凝胶（）上；然后将大鼠 细胞接种到琼脂糖凝胶上的凹孔中，形成图案化分布的细胞团；最后在上部浇注一层匀质分布的胶原基质 （），使细胞团处于胶原水凝胶层下方。为观察胶原纤维的发生，胶原被标记上带荧光蛋白的胶原结合分子 。实验中，细胞团处于琼脂糖凝胶和 型胶原之间，并粘附于胶原基质上。通过活细胞显微镜（倍、倍镜）定时拍摄细胞团之间的迁移和纤维发生情况，见图 。实验结果显示，细胞团之间会发生相向迁移，且具有长距离促进胶原纤维带发生的能力，相距较远的每组细胞团间可进一步产生远距离交流，促进胶原基质重构，见图 （）、（）。实验中可见荧光标记的 在细胞团之间随培养时间延长而出现明显的聚集，体现了细胞长程力作用的空间分布。图 基于微加工图形点阵分布的细胞团之间的迁移和胶原纤维发生 长距离促进胶原纤维发生依赖于细胞收缩作用基于以上实验，本研究进一步探索长距离重构胶原基质的细胞内信号机制，通过检测肌动蛋白收缩力的影响，初步探索了 相关激酶 的抑制剂 （）和肌丝蛋白骨架松弛素 （，）的效果。在填充细胞前，先将培养在六孔板中的 细胞用抑制剂孵育 ，溶剂 作为对照组；将细胞转移至模具后，培养基中继续添加相应浓度的抑制剂 （）和 （）作为实验组。细胞团在 倍和 倍镜下拍摄代表性明场和荧光图像。后，重新补加含相应抑制剂使用浓度的培养生物医学工程研究第 卷基，继续观察至 。实验结果显示，对照组中细胞团之间出现了胶原纤维条带，而实验组均未出现纤维条带，见图。结果表明，基质中 的聚合和基质重构来源于细胞的收缩力作用。与对照组相比，对细胞的迁移影响较小，而 明显抑制了细胞团的向外迁移。第 期胡燕玲，等：气道平滑肌细胞长距离促进胶原基质的重构作用图 抑制细胞收缩力对胶原基质重构的影响 胞内钙信号调控胶原纤维带的形成细胞钙信号常见于力学信号转导过程 ，为检测实验模型中钙信号对细胞长距离诱导的胶原纤维带形成的影响，本研究初步采用了 和 生物医学工程研究第 卷图 抑制细胞钙信号对胶原纤维发生的影响 两种钙离子抑制剂。是一种用于生化研究的无机化合物，可阻断细胞膜上二价阳离子通道（主要是钙通道）的活性；是一种选择性的钙螯合剂，对 的选择性比 高 倍以上，可用来调节胞外的 水平 。在培养细胞的六孔板中加入抑制剂预孵育 ，浓度分别为 （）、（）、（）。细胞团分别于 倍和 倍镜下拍摄代表性明场和荧光图像。后，补加含同等药物浓度的新培养基，继续观察至 。实验结果显示，对照组第 期胡燕玲，等：气道平滑肌细胞长距离促进胶原基质的重构作用（）细胞团之间出现了明显的胶原纤维带，而通过 抑制细胞膜上的钙通道 或 螯合细胞外钙离子，降低了钙离子内流，细胞团促进胶原纤维带发生的效果明显减弱，见图 。结果表明，细胞钙信号参与长距离力学作用促进胶原基质中纤维的发生。讨论本研究利用微加工图形技术设计了 细胞团的点阵排布，通过荧光标记胶原蛋白，以可控和可视化的方式研究细胞长距离促进胶原基质重构的力学机制。实验结果显示，相距 细胞团之间能有效生成胶原纤维条带，同时相距 的每组细胞团之间也发生长距离相互作用而形成胶原纤维带，表明细胞能长距离地精确调控胶原基质的重构作用。本研究初步探索了长距离诱导胶原纤维发生的细胞力学机制，结果显示，加入肌动蛋白骨架和收缩力的抑制剂 或 均有效阻止了胶原纤维的发生，通过添加钙离子抑制剂 和 的实验证明，细胞钙信号参与了长距离重构胶原基质的作用。近期也有研究显示，细胞的运动特性远距离促进胶原纤维的形成 ，然而其中细胞与胶原基质长距离相互作用的机制仍不清楚。本研究的实验模型将有助于从定量的角度探索其中的细胞力学机制，后续将以此为基础，进一步深入探究细胞群体力学交流水平上的力学信号转导通路。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：生物医学工程研究第 卷 ，（）：，（）：，：？，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，：，：，：，?，（）：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，：（收稿日期：）