漆树WRKY转录因子基因家族生物信息学分析.pdf

西北林学院学报2 0 2 3,3 8(4):1 1 1-1 1 8J o u r n a l o f N o r t h w e s t F o r e s t r y U n i v e r s i t y d o i:1 0.3 9 6 9/j.i s s n.1 0 0 1-7 4 6 1.2 0 2 3.0 4.1 4漆树WR KY转录因子基因家族生物信息学分析 收稿日期:2 0 2 2-0 5-2 4 修回日期:2 0 2 2-0 7-0 4 基金项目:“十三五”国家重点研发计划(2 0 1 7 Y F D 0 6 0 0 7 0 5)。第一作者:肖纪元。研究方向:植物分子生物学。E-m a i l:x j y n w a f u.e d u.c n*通信作者:刘朝斌,博士,副教授。研究方向:林木育种及栽培技术。E-m a i l:l i u c h a o b i n 1 2 6.c o m肖纪元,白航宇,宋金禄,张智雯,赵爱国,刘朝斌*(西北农林科技大学 林学院,陕西 杨陵 7 1 2 1 0 0)摘 要:漆树作为中国古老的经济树种,具有巨大的经济价值。WR KY转录因子是植物抗逆过程中最为常见的蛋白家族。为探索WR KY转录因子在漆树生长发育及抗逆境胁迫中的作用,以漆树转录组测序结果为试验材料,通过对保守结构域分析和多序列比对,共筛选出2 0个具有WR KY保守域的基因,根据WR KY结构特征,将筛选出的基因分为3组,其中组根据保守基序分析又可分为5个亚组。通过构建漆树和拟南芥WRKY基因家族系统进化树,分析漆树WRKY基因同源性,并根据其与拟南芥同源漆树基因进行功能预测。同时,对漆树WR KY转录因子在漆树不同部位 的 差 异 表 达 做 分 析,T v WRKY 2、T v WRKY 1 1、T v WRKY 1 4、T v WRKY 1 6、T v WRKY 1 7、T v WRKY 1 9、T v WRKY 8、T v WRKY 1 5在根中表达水平上调。通过对漆树WR KY转录因子基因家族进行系统的生物信息学分析,为进一步分析特定WRKY基因功能提供了参考,同时为后续深入研究漆树WR KY蛋白的结构与功能奠定了理论基础。关键词:漆树(T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m);WR KY;转录因子;生物信息学中图分类号:S 7 1 8.4 6 文献标志码:A 文章编号:1 0 0 1-7 4 6 1(2 0 2 3)0 4-0 1 1 1-0 8B i o i n f o r m a t i c s A n a l y s i s o f WRKY T r a n s c r i p i t i o n F a c t o r F a m i l y i n T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u mX I A O J i-y u a n,B A I H a n g-y u,S O N G J i n-l u,Z H A N G Z h i-w e n,Z H A O A i-g u o,L I U C h a o-b i n*(C o l l e g e o f F o r e s t r y,N o r t h w e s t A&F U n i v e r s i t y,Y a n g l i n g 7 1 2 1 0 0,S h a a n x i,C h i n a)A b s t r a c t:A s a n a n c i e n t n o n-t i m b e r t r e e s p e c i e s i n C h i n a,T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m t r e e s h a v e g r e a t e c o-n o m i c v a l u e.I n o r d e r t o e x p l o r e t h e r o l e o f WR KY t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n t h e g r o w t h a n d d e v e l o p m e n t o f T.v e r n i c i f l u u m t r e e a n d t h e r e s i s t a n c e t o s t r e s s,t a k i n g t h e s e q u e n c i n g r e s u l t s o f t h e t r e e t r a n s c r i p t o m e a s e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s,t h r o u g h t h e a n a l y s i s o f c o n s e r v e d d o m a i n a n d m u l t i s e q u e n c e a l i g n m e n t,a t o t a l o f 2 0 g e n e s w i t h WR KY c o n s e r v e d d o m a i n w e r e s c r e e n e d.A c c o r d i n g t o t h e s t r u c t u r a l c h a r a c t e r i s t i c s o f WR KY,t h e s c r e e n e d g e n e s w e r e d i v i d e d i n t o t h r e e g r o u p s,o f w h i c h g r o u p c o u l d b e d i v i d e d i n t o f i v e s u b g r o u p s a c c o r d i n g t o t h e a n a l y s i s o f c o n s e r v e d m o t i f.B y c o n s t r u c t i n g t h e p h y l o g e n e t i c t r e e o f T.v e r n i c-i f l u u m a n d A r a b i d o p s i s WRKY g e n e f a m i l y,t h e h o m o l o g y o f WRKY g e n e w a s a n a l y z e d,a n d i t s f u n c t i o n w a s p r e d i c t e d a c c o r d i n g t o t h e h o m o l o g o u s w i t h A r a b i d o p s i s.A t t h e s a m e t i m e,d i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f T.v e r n i c i f l u u m WRKY t r a n s c r i p t i o n f a c t o r s i n d i f f e r e n t t i s s u e s w a s a n a l y z e d.T h e e x p r e s s i o n l e v e l s o f T v WRKY 2,1 1,1 4,1 6,1 7,1 9,8 a n d 1 5 w e r e u p-r e g u l a t e d i n t h e r o o t.T h e s t u d y c o n d u c t s a s y s t e m a t i c b i o i n f o r m a t i c s a n a l y s i s o f T.v e r n i c i f l u u m WRKY t r a n s c r i p t i o n f a c t o r f a m i l y,w h i c h p r o v i d e s a r e f e r e n c e f o r f u r t h e r a n a l y s i s o f s p e c i f i c WRKY f u n c t i o n s,a n d l a i d a t h e o r e t i c a l f o u n d a t i o n f o r t h e f o l l o w-u p i n-d e p t h s t u d y o f t h e s t r u c t u r e a n d f u n c t i o n o f WR KY p r o t e i n.K e y w o r d s:T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m;WR KY;t r a n s c r i p t i o n f a c t o r;b i o i n f o r m a t i c s 漆树(T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m)是漆树科(A n a c a r d i a c e a e)漆属(T o x i c o d e n d r o n)植物,分布在亚热带地区,落叶乔木或小乔木。漆树分泌的生漆是天然树脂涂料,生漆中近8 0%成分是漆酚,具备极佳的耐腐蚀性、耐磨性、耐热性、隔水性、电绝缘性等物理化学特性,在军工领域也十分重要1。利用生漆制成的漆器,具有很高的文化艺术价值,中国漆艺传承七千多年,是世界文化宝库的珍贵资源2。国内外学者在对漆树的研究中,多集中于漆树的栽培、生漆提取加工,以及漆树中其余化学成分的研究,对于漆树WR KY转录因子家族基因的研究较少,且经过研究发现,WR KY转录因子在多种生物和非生物胁迫过程中调节各种信号转导通路发挥了关键作用。这些转录因子通过调节不同的信号转导途径,参与植物的各种过程,包括营养剥夺、胚胎发生、种子和毛发发育、衰老以及其他发育和激素调控过程3以及应对病菌虫害等生物胁迫反应和冷害、干旱、高盐等非生物胁迫4,是植物生命活动中重要的调控枢纽,参与了生长发育过程以及非生物逆境胁迫响应5。WR KY转录因子不是局限于单个基因的分析,从1 9 9 4年第1个WR KY转录因子基因被克隆得到,到目前为止,研究人员对WR KY转录因子生物学功能进行了广泛的研究,筛选并鉴定出几十种高等植物的WR KY转录因子,其中拟南芥7 4个、木瓜6 6个、小立碗藓3 8个6、高粱6 8个、卷柏3 5个、松树8 0个、大麦4 5个、杨树1 0 4个、大豆1 9 7个WRKY基因7,并对WRKY对植物生理生化影响做了系统的研究。国外科学家针对拟南芥WR KY转录因子单基因在植物生长发育过程中以及生物和非生物胁迫应 答过程中 的作用 进 行 了 较 多 的 分析8,但仍有部分基因作用机制以及功能不完全清楚,关于WR KY转录因子在高等植物中的功能挖掘及作用机制的研究仍有挑战。随着部分高等植物测序的完成,越来越多的生物信息学方法用于鉴定和分析WR KY转录因子9,为研究WRKY基因的作用机制提供了初步研究,为WRKY成员用于转基因植物改良植物遗传提供了新的基因资源。本研究以漆树为研究对象,对漆树WR KY转录因子家族进行系统的生物信息学分析,包括漆树WR KY转录因子筛选、WR KY家族保守结构域分析、多序列比对,保守基序分析,系统进化树构建以及WRKY在漆树不同部位的表达模式分析,对漆树WRKY基因家族做一个初步筛选以及功能预测,为漆树以及相近漆树科植物中WR KY转录因子的深入研究提供一定的参考和理论依据。为传统育种结合转基因操作等方法用以提高植物的胁迫耐受性,培育选育抗逆植物新种质,改良漆树的抗逆性提供相关理论依据及前期准备。1 材料与方法1.1 试验材料采自西北农林科技大学漆树园(3 4 1 5 5 4 N,1 0 8 5 4 1 E)的2年生漆树 大红袍,随机采取生长较为均匀的漆树(T o x i c o d e n d r o n v e r n i c i f l u u m),并采集其幼嫩的根、茎、叶。漆酶基因源于实验室已构建的漆树转录组数据库(登录号:P R J NA 5 8 7 8 3 0)。漆树的转录组数据为大红袍漆树根、茎、叶转录组 测 序 数 据,N C B I数 据 库 获 取 号 为P R J-NA 5 8 7 8 3 0。1.2 漆树WR K Y转录因子筛选将B L A S T和HMME R两种方法相结合的,从拟南芥转录因子数据库下载WR KY转录因子序列,获得拟南芥中WRKY基因家族成员的I D及所有基 因 的c D NA序 列、基 因 组 序 列 和 氨 基 酸 序列1 0。用每一个基因的氨基酸序列作为Q u a r y,对漆树转录组数据进行本地B L A S T P搜索,将结果中E值(e x p e c t v a l u e)1 e-2 0的基因作为初步的候选基因,筛选出WRKY基因并剔除不完整的基因以及长度小于3 0 0个碱基的WRKY基因1 1。为确保无基因遗漏,从P f a m数据库中下载保守结构域的HMM(H i d d e n M a r k o v M o d e l)文 件:WRKY(P F 0 3 1 0 6)。利用HMME R 3.0中h mm b u i l d建立模型,进 而 通 过h mm s e a r c h检 索 漆 树 中 具 有WRKY D NA-b i n d i n g d o m a i n保守结构域的候选蛋白序列,设置E值为1 e-2 01 2。综合2种方法得到的结果,手动去除冗余后获得目的序列。1.3 漆树WR K Y家族保守结构域分析利用O R F f i n d e r将筛选出的WR KY转录因子翻译成蛋白质,借助E x P A S y提供的一系列的蛋白质理化性质的工具,使用P r o t P a r a m(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/p r o t p a r a m/)在线工具线上分析漆树家族基因编码蛋白的理化性质。预测家族成员的等电点(P I)、相对分子质量、氨基酸长度、蛋白质亲疏水性等性质。1.4 漆树WR K Y家族保守结构域分析通过 美 国 国 家 生 物 技 术 信 息 中 心N C B I的C D D(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/S t r u c t u r e/c d d/w r p s b.c g i)与B i t c h(h t t p s:/www.n c b i.n l m.n i h.g o v/b i t c h)1 3对筛选出的漆树WRKY基因进行保守结构域分析,筛选出其中含有WR KY保守结构域的基因序列。其中,C D D只可以进行单条序211西北林学院学报3 8卷 列分析,B i t c h可以选择文件来上传,也可以直接输入批量递交多条序列,所以研究过程中先把所有的漆树WRKY基因序列放入一个文件上传到B i t c h,批量进行 保守结构域 分 析 后,再 用C D D对 通 过B i t c h筛 选 出 的 不 具 有WR KY保 守 结 构 域 的WR KY序列单个进行确认,以保证保守结构域分析的准 确 性。将 蛋 白 序 列 导 入U n i p r o t(h t t p s:/www.u n i p r o t.o r g/a l i g n/)进行序列对齐处理,将得到的序列保存为f a s t a格式,导入G e n e D o c中获得保守结构域对比图。1.5 漆树WR K Y转录因子的多序列比对利用O R F f i n d e r将得到的WR KY蛋白序列通过线上工具U n i p o r t(h t t p s:/www.u n i p r o t.o r g/a-l i g n/)对齐并转换为F a s t a格式,并导入到G e n e D o c中,进行多序列比对。参照E u l g e m等对WRKY基因家族的分类标准,将鉴定得到的候选漆树WR KY转录因子基因家族成员进行分类。通过多序列对比导出的F a s t a文件,根据多序列对比的分类结果,利用G e n e D o c进行漆树WRKY家族保守结构域类别比对分析1 4。1.6 漆树WR K Y蛋白保守位点分析利用在线软件MEME(M u l t i p l e E x p e c t a t i o n M a x i m i z a t i o n f o r M o t i f E l i c i t a t i o n)(h t t p:/m e m e-s u i t e.o r g/t o o l s/m e m e)进 行 预 测1 1,对 漆 树WR KY蛋白家族的保守基序进行分析,参数设置为1 0个m o t i f,基序位点设置为序列出现次或0次,最大基序 5 0,最小基序 6得到相关性最高的保守元件。分析图片利用T B o o l s进行处理美化1 5。1.7 漆树WR K Y转录因子系统进化树的构建下载拟南芥WRKY基因序列(h t t p:/p l a n t-t f d b.c b i.p k u.e d u.c n),进行系统进化树的构建,由于转录因子类亚家族有2个WR KY保守结构域,将N端C端分别命名为-N和-C亚组,独立参与构建。将拟南芥WRKY数据与筛选出的具有WR KY保守结构域的漆树序列以f a s t a格式保存,通过ME GA(M o l e c u l a r E v-o l u t i o n a r y G e n e t i c s A-n a l y s i s)中的C l u s t a l W进行多序列比对,采用最大似然,载入m e g文件,参数使用默认值,对WR KY的全长氨基酸序列作多序列联配,再利用ME GA中P HY L OG E NY功 能 的 邻 位 相 接 法(n e i g h b o r j o i n i n g,N J)构建漆树WRKY家族之间的进化关系,在NO.o f B o o t s t r a p R e p l i c a t i o n s置信值为1 0 0 0的条件下构建同源关系树,其他参数值设为默认值,由此得出漆树WR KY转录因子系统进化树。将通过C l u s t a l W的 结 果 导 入 到G e n e D o c(h t t p s:/g i t h u b.c o m/K a r l n i c h o l a s/G e n e D o c)中,适 当 修 改系统进化树的颜色及背景1 2。1.8 漆树WR K Y表达模式分析从实验室已有的转录组数据中调取漆树的根、茎、叶3种组织的F P KM数据,从漆树基因的表达数据中筛选到这些数据,数据首先经l o g 2标准化(以2为底差异表达倍数的对数),保留值1以及-1的数据,转换后提取WRKY基因的表达数据,利用软件T B t o o l s中的H e a t M a p I l l u s t r a t o r功能对数据进行可 视化分析,最 后制作热图(h e a t-m a p)。2 结果与分析2.1 漆树WR K Y转录因子筛选及理化性质分析本研究共筛选出WR KY转录因子基因2 0个,分 别 命 名 为T v WRKY1T v WRKY2 0,2 0个WRKY基因编码的蛋白大小不等,最大的编码蛋白分子量为6 6.6 3 D a,由6 1 8个氨基酸构成(表1)。2 0个T v WRKY理 论 等 电 点 范 围 从4.7 4(T v WRKY1 9)到1 0.5 4(T v WRKY9),说明不同的WR KY蛋白在不同的微环境下发挥了不同的功能。2 0个漆树WR KY蛋白均不属于稳定性蛋白。所有蛋白均为亲水性蛋白,其中酸性蛋白1 1个,碱性蛋白9个。2.2 漆树WR K Y转录因子的多序列比对及保守结构域分析 通过对2 0个漆树WRKY家族的保守结构域序列比对,发现共含2 5个WR KY结构域,对于同一条蛋白序列中存在的两个WR KY保守域,根据其在序列中的位置,分别命名为N端和C端保守域,基于比对结果及拟南芥WR KY转录因子分类,将漆树WRKY家族成员划分为3个大类:类共5个基因,类共1 2个基因,类共3个基因(图1)。类含有2个WR KY结构域,且锌指结构类型为C 2 H 2,共5个基因,占比2 5%。I组可进一步分为I-C和I-N亚组,I-N亚组N端WR KY七肽域和锌指结构均分别为WR KY GQK和C-X 4-C-X 2 2-H-X 1-H形式。I-C亚组C端WR KY七肽域和锌指结构均 分别为WR KY GQK和C-X 4-C-X 2 3-H-X 1-H形式。类含有1个WR KY R QK结构域,且锌指结构为C 2 H 2,共筛选出1 2个基因,占比6 0%。根据组成员WR KY结构域蛋白序列的相似性,进一步将组成员划分为5个亚组,其中-a有1个,-b有1个,-c有3个,-d有5个,-e有2个。-a、-b、-d、-e 4个亚组中,WR KY七肽域和锌 指 结 构 均 分 别 为WR KY GQK和C-X 5-C-311第4期肖纪元 等:漆树WR KY转录因子基因家族生物信息学分析X 2 3-H-X 1-H形式,而-c的3个基因WR KY七肽域和锌指结构均为WR KY GQK和C-X 4-C-X 2 3-H-X 1-H形式,与类C端而非N端的WR KY结构域更相似,暗示第类WR KY结构域的C端与第-c的WR KY结构域起相同的作用,构成D NA结合域1 6。表1 漆树WR KY蛋白理化性质分析T a b l e 1 P h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s o f WR KY p r o t e i n i n l a c q u e r t r e e s基因名称基因I D分子量氨基酸数理论等电点不稳定指数脂肪系数亲疏水性T v WRK Y1P B_c 0_g 1 6 8 1 94 9.6 14 5 37.1 75 9.1 65 0.9 9-0.8 7 3T v WRK Y2P B_c 0_g 1 6 4 0 06 6.6 36 1 85.8 54 6.0 45 9.6 9-0.7 0 1T v WRK Y3P B_c 0_g 1 6 9 2 26 2.2 05 7 26.3 94 8.9 76 0.0 2-0.7 2 1T v WRK Y4P B_c 0_g 1 7 0 6 85 5.0 35 0 35.8 14 7.2 96 0.9 3-0.9 7 8T v WRK Y5P B_c 0_g 1 7 2 9 05 7.1 85 2 58.5 45 8.9 54 9.7 9-0.8 9 5T v WRK Y6P B_c 0_g 2 0 03 7.2 83 3 19.8 16 2.0 16 0.9 4-0.7 5 6T v WRK Y7P B_c 0_g 2 3 45 2.9 34 8 55.5 16 4.9 36 1.5 1-0.8 7 7T v WRK Y8P B_c 0_g 2 8 2 74 1.6 53 6 95.2 95 1.7 86 3.3 9-0.7 0 6T v WRK Y9P B_c 0_g 2 8 4 52 3.4 02 0 31 0.5 46 5.8 66 9.2 1-0.6 6 7T v WRK Y1 0P B_c 0_g 2 8 6 83 6.8 93 2 88.5 86 2.7 74 8.1 7-1.0 3 7T v WRK Y1 1P B_c 0_g 4 2 7 53 8.2 33 4 85.8 04 9.4 65 0.6 9-0.7 2T v WRK Y1 2P B_c 0_g 4 7 4 23 9.8 13 6 39.5 34 6.9 26 5.8 1-0.6 6 2T v WRK Y1 3P B_c 0_g 4 7 5 23 7.1 63 4 09.4 24 7.1 55 8.7 9-0.5 9 2T v WRK Y1 4P B_c 0_g 4 8 0 33 9.2 83 5 89.3 55 0.9 76 5.6 1-0.5 1 2T v WRK Y1 5P B_c 0_g 6 2 0 73 5.4 63 1 15.8 05 6.2 56 8.3 6-0.7 8 2T v WRK Y1 6P B_c 0_g 6 2 5 13 6.7 43 2 46.2 45 7.4 06 8.2 7-0.7 9 8T v WRK Y1 7P B_c 0_g 6 2 5 73 4.8 23 1 26.9 25 9.6 26 4.0 4-0.7 4 5T v WRK Y1 8P B_c 0_g 6 4 5 33 2.9 82 9 76.2 65 9.5 96 0.0 7-0.6 9 8T v WRK Y1 9P B_c 0_g 6 9 1 03 0.2 02 6 44.7 45 4.0 55 6.0 6-0.9 8 0T v WRK Y2 0P B_c 0_g 9 3 73 8.9 73 4 89.7 25 5.2 36 7.2 1-0.7 7 1图1 WR KY蛋白C端保守结构域分析F i g.1 C o n s e r v e d d o m a i n a n a l y s i s o f WR KY p r o t e i n c-t e r m i n a l 类含有1个WR KY结构域,锌指结构为C-X 7-C-X 2 3-H-X 1-C,共3个基因,占比1 5%,只具有C 2 HC类 型 的 锌 指 结 构。类3个 基 因 除WR KY GQK保守结构域外,靠近N端序列匹配度较高。在漆树WR KY转录因子中,未发现存在变异WR KY结构域,包括变异WR KY GQK以及锌指结构(图2)。2.3 漆树WR K Y蛋白保守位点分析对漆树基因分析可知,不同类型的WR KY蛋白具有不同的保守基序数量和种类(图3)。2 0个漆树WR KY蛋白包含7 7个保守基序,共8种。基序1和基序2存在于所有基因中,位于WR KY蛋白C端,说明基序1和基序2是漆树WR KY 基因家族的核心保守结构域。在类 的5个 基 因 中,基 因T v WRKY1和T v WRKY5两个基因具有完全相同的8个保守基序,与基因T v WRKY4及T v WRKY7相比,基因T v WRKY3具有5个保守基序,多出M o t i f 8,说明411西北林学院学报3 8卷 在类基因中,3个基因所共有的基序1、2、3、5高度保守。在类基因中,-a基因T v WRKY1 7具有2个保守基序。-b基因T v WRKY2具有4个保守 基 序。-c基 因T v WRKY9、T v WRKY1 0、T v WRKY1 8都具有3个保守基序,且保守基序完全 相 同。-d基 因T v WRKY1 2、T v WRKY1 3、T v WRKY1 4都具有4个保守基序,且保守基序完全相同,T v WRKY2 0基因具有5个保守基序,但基序类型与其他3个基因完全相同,而T v WRKY6具有6个保守基序,基序M o t i f 5不存在于另外4个基因,说明在类基因中,4个基因相对保守,其中基序1 0为-d中 特 有。-e中T v WRKY1 1和T v WRKY1 9分别具有2和3个保守基序。在类 基 因 中,T v WRKY8、T v WRKY1 5和T v WRKY1 6分别具有2、2和3个保守基序,其中基序3为基因T v WRKY1 6特有(图4)。图2 WR KY蛋白保守结构域F i g.2 C o n s e r v e d d o m a i n o f WRKY p r o t e i n图3 漆树WR KY保守基序结构F i g.3 WR KY c o n s e r v e d m o t i f s t r u c t u r e o f S u m a c511第4期肖纪元 等:漆树WR KY转录因子基因家族生物信息学分析图4 WRK Y保守基序F i g.4 WRK Y c o n s e r v e d M o t i f(M o t i f)2.4 漆树WR K Y转录因子同源性分析在漆树WRKY系统发育树中(图5),-N中的基 因T v WRKY1和T v WRKY5具 有 同 源 性,T v WRKY3和T v WRKY4具有同源性,-C中,基因T v WRKY1和T v WRKY5的 进 化 源 与T v WRKY3具有同源性,结果均与保守基序的分析相一致,也验证了N端和C端两种不同锌指结构。类基因中,-a和-b进化关系较近,而-d和-e进化关系较近。-a、-b、-d、-e和类由共同祖先进化而成,均具有高度保守基序1和2。-c 3个基因与-N具有高度同源性,与保守结构域 分 析 一 致。类 中,基 因T v WRKY1 5和T v WRKY1 6由同 源 分 化 而 来,增 加 了 保 守 基 序M o t i f 3。图5 漆树WRKY系统发育树F i g.5 WRK Y p h y l o g e n e t i c t r e e o f S u m a c在漆树与拟南芥WRKY系统发育树中(图6),通过引入拟南芥WR KY蛋白参与构建进化树,对漆树WR KY结构域和7种类型1 4个不同拟南芥WR KY结构域进行对比,分析漆树WR KY蛋白的进化关系,发现同一物种的WR KY蛋白序列相似性较高,聚集在同一分支上。进化树中相距较近的WRKY因子往往具有相似功能,基于此,对漆树WR KY转录因子功能进行预测分析。图6 漆树与拟南芥WRK Y系统发育树F i g.6 WRK Y p h y l o g e n e t i c t r e e s o f S u l a c q u e r a n d A r a b i d o p s i s2.5 漆树WR K Y表达模式分析对漆树的根、茎、叶3种组织的F P KM数据分析,得到漆树WRKY基因在漆树不同部位的差异表达热图(图7)。在漆树的叶中,基因T v WRKY2、T v W R K Y1 1、T v W R K Y1 4、T v W R K Y1 6、T v W R K Y1 7、T v W R K Y1 9、T v W R K Y8、T v W R K Y1 5表达水平较高,其中基因T v WRKY1 6、T v WRKY1 7、T v WRKY1 9表达 水 平 最 高。相 较 于 漆 树 的 叶,根 中 基 因T v W R K Y1 3、T v W R K Y1 8、T v W R K Y6、T v W R K Y9、T v W R K Y1 0表 达 水 平 上 调,其 中T v WRKY1 3、T v WRKY6、T v WRKY9、T v WRKY1 0表达水平最高。在漆树茎中,基因T v WRKY3表达水平较高,其他基因表达水平均较低。611西北林学院学报3 8卷 在所有漆树WRKY基因中,T v WRKY2 0在上述所有组织中均未检测到,可能是由于存在假基因,或者T v WRKY2 0只在漆树特定的环境或特定生长发育阶段才会表达。在与拟南芥WR KY蛋白同源对比分析中,推测基因T v WRKY2 0可能参与到了干旱胁迫的响应中,因此T v WRKY2 0可能是干旱胁迫环境下选择表达的基因。注:D L:叶;D R:根;D S:茎。图7 漆树WRKY基因差异表达情况F i g.7 D i f f e r e n t i a l e x p r e s s i o n o f WRK Y g e n e i n S u m a c3 结论与讨论3.1 结论本研究通过生物信息学方法,分析漆树WR KY转录因子家族,发现在生长发育阶段中,T v WRKY3和T v WRKY5可能在漆树种子萌发阶段发挥了重要作用,T v WRKY8和T v WRKY1 4可能在漆树叶片和根的生长中发挥了重要作用,可通过转基因方法提高漆树成活率,促进漆树的生长。WRKY基因在植物生长发育及抗逆境胁迫中有重要意义1 7,一直是研究的热点问题,但在漆树中它的研究较少,本研究在基因水平上对其展开研究,为后续深入研究WR KY蛋白的结构与功能奠定了基础。本研究对于蛋白质结构以及染色体定位等相关研究没有深入,对漆树WR KY转录因子家族以及其他转录因子家族的分析有待进一步探索。3.2 讨论本研究通过实验室获得的漆树转录组数据,对漆树WRKY家 族 开 展 生 物 学 分 析,与 拟 南 芥WR KY转录因子对比可以发现,WRKY基因在进化过程中不断扩张丰富,同时引入新的功能1 8。漆树WRKY共筛选鉴定出共2 0条WRKY基因序列。对漆树WRKY编码蛋白理化性质分析,2 0个WRKY基因编码的蛋白大小不等,最大的编码蛋白分子量为6 6.6 3 D a,由6 1 8个氨基酸构成。2 0个T v MR KY理论等电点范围为4.7 4到1 0.5 4,说明不同的WR KY蛋白在不同的微环境下发挥了不同的功能。2 0个漆树WR KY蛋白均不属于稳定性蛋白。所有蛋白均为亲水性蛋白。蛋白质脂肪系数大部分在6 0,热稳定性较高。漆树WRKY家族成员符合WRKY家族的一贯分类,组基因和组基因相继 从I组 分 化 而 来。通 过 对 漆 树 与 拟 南 芥WR KY蛋白同源分析,推测在生物 胁迫中,基因T v WRKY9和T v WRKY8与生物胁迫作用有关,T v WRKY9可能参与了对烟草花叶病毒(TMV)的防御响应1 9,类中的T v WRKY8可能增强了植株对细菌斑点病的抗性2 0。在非生物胁迫作用中,中的基因T v WRKY5作用可能与种子萌发抑制的激素调节有关2 1。-a中的基因T v WRKY1 7参与到脱落酸在种子萌发中的负调控1 9。-b中的基因T v WRKY2在低磷环境下参与负调控2 1。-d中的基因T v WRKY1 4可能会参与渗透相关胁迫中2 3。-e中的基因T v WRKY1 1在碳元素不足时发生反应,调节碳元素的吸收2 4。中的基因T v WRKY8与A t WRKY4 6具 有 同 源 性,A t-WRKY4 6在植物干旱胁迫中充当负调控因子1 8。在植物生长发育 中表,T v WRKY3和T v WRKY5可能参与到 调 节 种 子 萌 发 中,T v WRKY2与A t-WRKY6具 有 同 源 性,可 能 与 植 物 叶 片 衰 老 有关2 1,T v WRKY1 4具有促进植物叶片生长的功能,A t WRKY1 2参与调控木髓部次级细胞壁的形成,基因T v WRKY1 8可能与其有关,而T v WRKY8与A t WRKY4 6具有同源性,可能影响到侧根发育。在漆树WRKY基因表达模式分析中,得到了漆树不同部位基因表达差异,在漆树的叶中,基因T v WRKY2、1 1、1 4、1 6、1 7、1 9、8、1 5表达水平上调;根中基因T v WRKY1 3、1 8、6、9、1 0表达水平上调;在漆树茎中,基因T v WRKY3表达水平较高,其他基因表达水平均较低。在所有基因中,T v WRKY2 0在上述所有组织中均未检测到,可能是由于存在假基因,根据与拟南芥WR KY蛋白同源对比分析,推测基因T v WRKY2 0可能参与到了干旱胁迫的响应中2 5-2