天麻素对缺血缺氧大鼠星形胶质细胞MCP1表达的影响.pdf

Chinese Journal of Neuroanatomy志杂解经神2023,39(3):289294天麻素对缺血缺氧大鼠星形胶质细胞MCP1表达的影响陈澍雨，杨雪珂12，张晓丽娜!3，李顺达，赵永强，杨艳，袁云1*（1.昆明医科大学基础医学院人体解剖与组织胚胎学系，昆明6 50 50 0；2.三峡大学第一临床医学院输血科，宜昌4430 0 3；3.昆明医科大学第一附属医院疼痛科，昆明6 50 0 32）摘要目的：通过建立新生大鼠缺血缺氧脑损伤（HIBD)模型和体外星形胶质细胞系TNC1细胞糖氧剥夺（O G D)模型,从体内体外探索天麻素（GAS)对星形胶质细胞缺血缺氧损伤后单核细胞趋化因子1（MCP1）表达的影响。方法：将星形胶质细胞TNC1随机分为对照组（control）、糖氧剥夺组（OGD）、糖氧剥夺+天麻素（OGD+G）。将3d新生SD大鼠随机分为假手术组（sham）缺血缺氧脑损伤模型组（HIBD）、H IBD 模型+天麻素干预组（HIBD+G）。使用免疫荧光双标染色和WesternBlot检测各组细胞及大鼠左侧损伤皮质半暗区MCP1的表达变化。结果：体外免疫荧光染色和WesternBlot结果显示，与control组相比,OGD组TNC1细胞MCP1表达明显增加（P0.05），G A S可减轻0 CD损伤后MCP1的表达（P0.05）；体内免疫荧光双标染色和WesternBlot结果也显示：GAS干预显著降低了HIBD后星形胶质细胞MCP1的表达（P0.05）。结论：GAS可以通过降低星形胶质细胞MCP1的表达对HIBD发挥保护作用。关键词缺血缺氧性脑损伤；天麻素；单核细胞趋化因子1；糖氧剥夺；星形胶质细胞；大鼠D0I:10.16557/ki.1000-7547.2023.03.006The effects of gastrodin on the expression of MCP1in astrocytes after ischemia and hypoxiaCHEN Shuyu,YANG Xueke-2,ZHANG Xiaolina-3,LI Shunda,ZHAO Yongqiang,YANG Yan,YUAN Yun*(1.Department of Human Anatomy,Histology and Embryology,School of Basic Medical,Kunming Medical University,Kunming650500;2.Department of Blood Transfusion,The First Clinical Medical College of Three Gorges University,Yichang 443003;3.Department of Pain,The First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming 650032,China)AbstractObjective:To explore the effect of gastrodin(GAS)on monocyte chemoattractant factor-1(MCP1)expression in astrocytes after hypoxic-ischemic brain damage,the neonatal rat hypoxia ischemia model in vivo and astro-cyte line TNC1 oxygen glucose deprivation(OGD)model was established in vitro.Methods:Astrocytes TNC1 wererandomly divided into control group(control),oxygen glucose deprivation group(OGD),oxygen glucose deprivation+gastrodin group(OGD+G).Three-day old SD rats were randomly divided into sham group(sham),ischemic hypoxicbrain damage model group(HIBD),HIBD model+gastrodin treatment group(HIBD+G).Immunofluorescence doub-le labeling and Western Blot were used to detect the expression of MCP1 in the cells of each group and in the penumbraof the left injured cortex of rats.Results:The expression of MCPI in TNCI cells in the OGD group was significantlyincreased(P0.05);In vivo immunofluorescence double staining and Western Blot results also showed that GAS pre-treatment significantly reduced the expression of MCPI in astrocytes after HIBD(P0.05).Conclusion:GAS can基金项目：国家自然科学基金（317 6 0 2 97）；云南省基础研究计划昆医联合专项（2 0 2 10 1AY070001-095）*通信作者：袁云电话：1357 7 17 98 8 7，E-mail：y u n y u a n k m 12 6.c o mtantprotein-l2902023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，protect HIBD by decreasing MCP1 expression of astrocytes.Key words hypoxic-ischemic brain damage(HIBD);gastrodin(GAS);monocyte chemoattrac(MCP1);oxygen-glucose deprivation(OGD);astrocyte;rat新生儿缺血缺氧性脑损伤（hypoxia-ischemicbrain damage,HIBD)是指由于围产期室息缺氧导致的脑损伤,造成侧脑室周围白质区软化、坏死1。中枢神经系统（central nervous system，CNS）损伤后，星形胶质细胞激活聚集于缺血梗死周围区，即半暗区，其胞体变大,突起变多2 ,分泌大量细胞因子介导炎症反应和氧化应激,加重脑损伤3。因此,抑制星形胶质细胞介导的炎症反应可能是治疗新生儿HIBD的潜在策略。单核细胞趋化因子1（monocyte che-moattractantproteinl,MCP1）是炎症期最高且瞬时表达的趋化因子之一4,募集白细胞到损伤部位。缺血性脑卒中时星形胶质细胞分泌MCP1,MCP1募集单核细胞/巨噬细胞，加重脑损伤5。因此，MCP1在缺血性脑损伤引起的神经炎症上发挥着重要作用。天麻素（gastrodin，G A S）是天麻的有效单体，具有抗炎抗氧化的作用6 。缺血缺氧时，天麻素抑制大脑中动脉闭塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO)中反应性星形胶质细胞中的白细胞介素-18(interleukin-18,IL-18）表达7 ,抑制炎症发生。但目前尚未见报道GAS是否能通过调节MCP-1影响星形胶质细胞介导的炎症反应。因此,本研究通过体外TNC1星形胶质细胞糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation,OGD）模型和体内HIBD模型,给予 GAS,研究HIBD后星形胶质细胞MCP1的表达变化，探讨GAS是否通过MCP1调节星形胶质细胞介导的炎性反应发挥神经保护作用。材料与方法1.材料1.1细胞系大鼠源性星形胶质细胞系TNC1细胞，由新加坡国立大学LingEngAng教授捐赠(CRL-2005TM)1.2实验动物勿本实验采用SPF级新生3dSD大鼠30 只，体重8 12 g，由昆明医科大学实验动物中心提供。1.3试剂与仪器天麻素、含DAPI的荧光封片剂购自美国Sigma公司;DMEM（d u l b e c c o s m o d i f i e deagles medium,DMEM)培养基、胎牛血清(fetal bo-vine serum，FBS）均购自以色列BI公司；小鼠抗MCP1抗体、Cy3偶联的山羊抗小鼠IgG、A l e x a Fl u-o488标记的山羊抗免IgC、辣根过氧化物酶（h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e，H R P）标记的山羊抗小鼠二抗均购自武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗神经胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，G FA P)抗体购自江苏亲科生物研究中心有限公司；聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidenefluoride,PVDF）膜购自美国Millipore公司;ECL化学发光检测试剂购自合肥白鲨公司；缺氧小室购自美国Billups-rothenberg公司；小型动物缺氧箱购自深圳瑞沃德科技有限公司；石蜡切片机器购自德国SLEE公司；蛋白电泳仪购自北京凯元公司；半干转膜仪和凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司；荧光显微镜购自日本Olympus公司。2.方法2.1细胞培养实验采用大鼠源性星形胶质细胞系TNC1细胞，将其置于含有10%FBS的高糖DMEM培养基中,5%CO2,37培养。选择复苏第3代后，形态良好的细胞，待细胞密度长至8 0%时传代种板。2.2细胞实验分组与模型制备将星形胶质细胞系TNC1细胞随机分为对照组（control）、糖氧剥夺组（O CD）、糖氧剥夺+天麻素组（OGD+G）。六孔板每孔接种310 5个、2 4孔板每孔接种8 10 4个。OGD+G组给药前更换培养基为不含血清的高糖DMEM培养基,0.34mmol/L的天麻素预处理1h。随后,将OGD组和OGD+G组的培养基更换为无糖培养基，置于缺氧小室内充盈混合气5%CO2、95%N2,37缺氧处理4h。2.3动物实验分组与模型制备新生3dSD大鼠随机分为假手术组（sham）、H IBD 模型组（HIBD）、HIBD模型+天麻素干预组（HIBD+G）。H I BD+G组于结扎前1h、缺氧后即刻、缺氧后12 h腹腔注射天麻素（10 0 mg/kg）。七氟醚吸入麻醉，碘伏消毒后，分离组织，暴露左颈总动脉。sham组到此步即可，HIBD组和HIBD+G组用线径为4-0 的线结扎左侧颈总动脉后缝合。乳鼠休息30 min后，置于小291陈澍雨：天麻素对缺血缺氧大鼠星形胶质细胞MCP1表达的影响型动物缺氧箱内，充盈N2，维持8%0，浓度，37 缺氧2 h。2.4Western Blot细胞部分：取出缺氧处理后的细胞,弃去六孔板内培养基,用0.0 1mmol/L的磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered solution,PBS)漂洗。将细胞裂解液与蛋白酶抑制剂按照10 0:1的比例提前均匀混合。六孔板每孔加入6 0 l混合液，冰上静置。收集细胞悬液低温超速离心。取上清，用蛋白浓度检测试剂盒（BCA）检测蛋白浓度，并配制上样液。动物组织部分：HIBD造模后3d,15只新生大鼠分别为sham组、HIBD组、HIBD+G组，每组5只。将其麻醉后取脑，取出皮层半暗区组织置于离心管。加人2 0 0 l预混合的细胞裂解液与蛋白酶抑制剂混合液，研磨至均匀浑浊状。静置15min后，将组织悬液低温高速离心。取上清,BCA试剂盒检测蛋白浓度,并配制上样液。取细胞蛋白30 g，动物组织蛋白50 g进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，将目标分子量的蛋白半干转（2 2 V/60min）转至PVDF膜上。5%脱脂牛奶室温封闭，加人一抗小鼠抗MCP1（1:2 50 0）4孵育过夜。次日TBST洗涤3次，用辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase,HRP）标记的山羊抗小鼠二抗（1:50 0 0）室温孵育，TBST洗涤后加入ECL化学发光试剂用凝胶成像系统检测条带。ImageJ软件量化各组灰度值并进行数据分析。2.5免疫荧光染色细胞部分：TNC1细胞制备成不同组别的细胞爬片。弃去培养基,PBS漂洗,加人含4%多聚甲醛的磷酸缓冲液（PB）固定后,PBS冲洗3遍。加人含10%山羊血清常温封闭，弃去封闭液，加人一抗4过夜（小鼠抗MCP1抗体，1:2 0 0；兔抗GFAP抗体，1:2 0 0），次日PBS洗去一抗后，Cy3标记的山羊抗小鼠IgG(1:200）和AlexaFluor488标记的山羊抗兔IgG（1:2 0 0）室温孵育，用含DAPI的封片剂封片。动物组织部分：造模后3d,15只新生大鼠分别为sham组、HIBD组、HIBD+G组，每组5只。用生理盐水和含4%多聚甲醛的PB溶液心脏灌注。取出脑组织固定，梯度酒精脱水进行石蜡包埋，切成7 m的组织切片。染色时,组织切片脱蜡后，柠檬酸钠缓冲液95抗原修复。降至室温,PBS洗涤3遍，再进行上述封闭等染色步骤。玻片干燥后，荧光显微镜采集图片，ImageJ软件数据分析。2.6乡统计学处理收集实验数据用SPSS统计软件进行统计，计量资料表示为均值标准误（MeanSEM）采用单因素方差分析（onewayANOVA）进行组与组间比较,P0.05时具有统计学意义。用Graphapd prism 8.0 制作统计图。结果1.天麻素减少TNC1细胞OGD损伤后MCP1的表达WesternBlot检测TNC1星形胶质细胞MCP1的表达变化。结果显示：与control组相比，OGD组MCP1蛋白表达明显升高，而GAS干预后,TNC1细胞MCP1的表达显著下降(P0.05,Fig.1）。MCP11.0ma0.8ControlOGDOGD+G0.6MCP126kDa0.4b0.2-actin42kDa0.0BControl OGD OGD+GAFig.1 Effect of gastrodin on expression of MCPI in TNC1 cells.A:The result of Western Blot.B:Quantitative statistical results ofMCP1.P0.05 us Control group,p0.05 us OGD group.免疫细胞荧光染色检测TNC1细胞MCP1的表达变化。结果显示：OGD组MCP1荧光表达明显升高，OGD+G组细胞中MCP1荧光表达显著降低(P0.05,Fig.2)。2.天麻素减轻新生大鼠HIBD后皮层MCP1表达WesternBlot检测新生大鼠HIBD3d皮质半暗区组织MCP1的表达变化。结果显示：与sham组相比，HIBD组MCP1蛋白表达明显升高，而GAS干预后,MCP1表达下降(P0.05,Fig.3)。免疫组织荧光染色检测新生大鼠HIBD3d皮2922023年5月第39 卷第3期神经解剖学杂志，质半暗区域MCP1的表达变化。结果显示：HIBD组与sham组相比星形胶质细胞体积增大，MCP1荧光表达升高，而HIBD+G组，细胞中MCP1荧光表达显著降低(P0.05,Fig.4)。DAPIGFAPDAPI/MCP1DAPI/GFAP/MCP1MCP1200ab150100500BControlOGDOGD+GAFig.2 The immunofluorescence expression of MCP1 in TNC1 cells after OGD and GAS intervention.A:The result of MCP1(red)ex-pression in TNC1 cells by immunofluorescence staining.B:Average optical density of MCP1 fluorescence.P0.05 vs Con-trol group,bP 0.05 us OCD group.Bar=20 m.MCP11.2aShamHIBDHIBD+G0.9MCP126kDa60.6-actin42kDa0.3AB0.0ShamHIBDHIBD+GFig.3 Effect of gastrodin on expression of MCP1 in left cerebral cortex.A:The result of Western Blot.B:Quantitative statisticalresults of MCP1.P0.05 us Control group,bp0.05 us OGD group,n=5.讨论研究发现，新生儿对缺血缺氧更易感，从而更易产生氧化应激、血脑屏障破坏和神经炎症的反应8 。CNS中小胶质细胞和星形胶质细胞被激活可介导神经炎症，是神经退行性疾病与创伤性脑损伤不可忽视的致病机制之一9，同时也被认为参与缺血再灌注损伤10 ,是新生儿HIBD的致病机制之一。缺血后小胶质细胞通常聚集在缺血核心，激活成阿米巴样10 ,星形胶质细胞填充于缺血半暗区神经瘢痕处1。不可否认，小胶质细胞作为脑内的巨噬细胞在神经炎症中发挥重要作用，但近年来人们发现星形胶质细胞介导的炎症反应也具有不可忽视的影响。CNS损伤时，星形胶质细胞可通过NF-kB通路调控释放细胞因子如白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、肿瘤坏死因子-（t u mo r n e c r o s i s f a c t o r-,TNF-）、M CP1引起炎症反应12 。研究发现,脑中动脉闭塞再灌注模型中(middle cerebral artery occlusion/Re-fusion,MCAO/R），星形胶质细胞释放白细胞介素-1293陈澍雨：天麻素对缺血缺氧大鼠星形胶质细胞MCP1表达的影响（i n t e r l e u k i n-1,IL-1）、IL-6、T NF-引起的炎症，加剧了脑内炎症的级联反应和神经元氧化损伤13。研究证实，新生儿HIBD时，星形胶质细胞通过释放促炎因子IL-1、IL-6、T NF-、诱导型一氧化氮合酶(in-ductible nitric oxide aynthase,iNOS）浸润神经元附近，促进癫痫的产生14。因此抑制星形胶质细胞介导的炎症反应可能是治疗新生儿HIBD的潜在措施。DAPI/GFAPMCP1/DAPIGFAP/MCP1/DAPIweusMCP1150100500BShamHIBDHIBD+GAFig.4 The immunofluorescence expression of MCP1 in astrocytes of ischemic penumbra.A:The result of MCP1(red)expression inastrocytes by immunofluorescence double labeling technique.B:Average optical density of MCP1 fluorescence.aP0.05 vsControl group,bP0.05 us OGD group,n=5.Bar=20 m.MCP1（CCL2）由脑内神经元，星形细胞，小胶质细胞和脑微血管内皮细胞表达15,其配体CCR2分布于神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞16 。早在1997年的研究就发现在MCAO时，MCP1mRNA存在于梗死灶周围区的星形胶质细胞中，加重缺血性大脑的炎症反应17 ；近年来，也有研究报道在脑缺血再灌注时MCP1表达增加，促进神经炎症,加重脑损伤18 。中风后，星形胶质细胞分泌趋化因子参与脑内炎症反应，在MCAO模型中,趋化因子MCP1缺乏可使中性粒细胞聚集减少，炎症因子IL-6、IL-1表达降低,减轻缺血后炎症反应19。本研究结果显示，OGD后TNC1细胞MCP1表达增加，体内实验发现HIBD后星形胶质细胞GFAP的表达明显增加,荧光结果可见其胞体变大、突起变粗，伴随炎性因子MCP1分泌增加，表明MCP1参与新生儿HIBD后星形胶质细胞介导的炎症反应。因此调节MCP1的表达可以抑制HIBD后脑内的炎症反应。目前临床上公认的治疗新生儿HIBD的方法是低温治疗。低温治疗虽然能有效的提高新生儿HIBD的存活率，但死亡率和残疾率仍然很高,所以必须要寻找新的有效的治疗方法2 0 。研究发现，天麻素可以减轻炎症反应2 1。在脑卒中模型中,天麻素能降低TNF-和IL-1的表达，从而发挥神经保护作用2 。课题组前期研究发现,天麻素能够通过调节沉默调节蛋白3（sirtuin3，Si r t 3）、No t c h 信号通路抑制新生儿HIBD小胶质细胞的激活，通过Notch信号通路抑制星形胶质细胞介导的促炎因子表达减轻神经炎症,从而发挥保护作用2 3.2 41。本研究发现，GAS干预能够减轻OGD激活的TNC1星形胶质细胞分泌MCP1；抑制HIBD皮质半暗区星形胶质细胞MCP1的表达，这表明GAS可通过调节新生鼠HIBD后星形胶质MCP1的表达，减轻神经炎症，发挥保护作用。综上所述，本研究通过体内体外实验证实，GAS可以通过抑制星形胶质细胞表达MCP1,从而对缺血缺氧性脑损伤发挥保护作用。为研究HIBD后星形（收稿日期:2 0 2 2-10-11)2942023年5月第39 卷第3期神经解部学杂志，胶质细胞病理变化及GAS作用的分子机制提供依据,为临床上探索有效地预防和治疗HIBD后脑损伤策略提供可靠的形态学和分子生物学实验依据。参考文献1 Yang L,Zhao H,Cui H.Treatment and new progress of neonatalhypoxic-ischemic brain damageJ.Histol Histopathol,2020,35(9):929-936.D0I:10.14670/HH-18 214.2 Li L,Zhou J,Han L,et al.The specific role of reactive astrocytes instrokeJ.Front Cell Neurosci,2022,16:850866.D0I:10.3389/fncel.2022.850866.3 Sofroniew MV.Astrocyte reactivity:Subtypes,states,and functionsin CNS innate immunityJ.Trends Immunol,2020,41(9):758-770.D0I:10.1016/j.it.2020.07.004.4 Singh S,Anshita D,Ravichandiran V.MCP-1:Function,regula-tion,and involvement in diseaseJ.Int 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