神经递质抑制类肽淡化面部动态皱纹作用机理及研究进展.pdf

专论与综述2023年8月第4期Aug.2023,No.4香料香精化妆品FLAVOUR FRAGRANCE COSMETICS30www.ffc-www.ffc-收稿日期：2022-06-27；修回日期：2022-07-15作 者仁和全域（上海）大健康研究院有限公司，上海 200000 彭 蕴 姜浩敏 刘雨菲#邓 昊 王 圳神经递质抑制类肽淡化面部动态皱纹作用机理及研究进展摘 要面部表情肌频繁收缩形成动态皱纹，进而转化为永久性皱纹。表情肌的收缩源于神经信号的传递，神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh）是重要的信号因子，与其受体结合后传递信号，引起肌细胞的收缩活动。多肽中的一部分肽被发现能够抑制 ACh 的传递，如乙酰基八肽-3、五肽-3、芋螺毒素等。本文综述了面部动态皱纹产生过程中肌肉收缩的原理、神经递质抑制类肽的种类及其抑制动态皱纹的作用机理。关键词动态皱纹 神经肌肉接头信号传递 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）复合物 神经递质抑制类肽Mechanism and Research Progress of Neurotransmitter Inhibitor Peptides to Lighten Facial Dynamic Wrinkles PENG Yun JIANG Haomin LIU Yufei#DENG Hao WANG Zhen(Quanyu(Shanghai)Onehealth Research Institute Co.,Ltd.,Shanghai 20000,China)Abstract:The frequent contractions of the facial expression muscles create dynamic wrinkles,which in turn transform into permanent wrinkles.The contraction of facial muscles originates from the transmission of nerve signals.The neurotransmitter acetylcholine(ACh)is an important signaling factor,and after binding to its receptors,it transmits signals and causes the contraction of muscle cells.Some peptides in the polypeptide are found to inhibit the transmission of ACh,such as acetyl octapeptide-3,pentapeptide-3,conotoxin.The principle of muscle contraction in the process of facial dynamic wrinkles,the types of neurotransmitter inhibitory peptoids and their mechanism of action in inhibiting dynamic wrinkles were reviewed in this paper.Kewords:dynamic wrinkles nerve joint signal transmission SNARE complex neurotransmitter inhibitory peptide衰老是所有生命体共有的特征，也是人类最关注的问题。衰老是机体内部因素和外部环境共同作用的结果：外部环境如紫外线、粉尘等持续地伤害皮肤导致皮肤老化加剧；内源性损伤如氧化损伤、炎症机制等都参与了皮肤老化的生理进程。皮肤老化产生皱纹、下垂、肤色变化等表象，其中皱纹是最明显的标志之一，一直以来抗皱都是化妆品领域的重点研究课题，抬头纹、法令纹、鱼尾纹等由表情肌频繁收缩而产生的皮肤纹路备受消费者的关注 1。在不断发展的抗皱产品专论与综述彭 蕴，等作 者 简 介彭蕴（1987），女，本科学历，主要从事化妆品研发。#通信作者：刘雨菲（1995），女，硕士，主要从事化妆品研发。联系电话：[phone]E-mail:DOI:10.20099/j.issn.1000-4475.2022.0139第 4 期专论与综述彭 蕴，等：神经递质抑制类肽淡化面部动态皱纹作用机理及研究进展31www.ffc-及技术中，通过阻隔外部环境中紫外线来延缓皮肤老化；此外，医美行业通过注射A型肉毒素来改善面部动态皱纹并取得了明显的疗效 2。然而，随着A型肉毒素面部注射方案的普及，其并发症的发生率也越来越高，轻症如红肿、疼痛、局部皮肤感知能力下降，重症则产生感染、形成脓肿或长期的瘀斑 3。因此，亟需寻求更安全且具备功效性的类似物以丰富市场。近年来，科学家对多肽保持较高的关注度，发现多肽中的一类肽可在肌肉信号传递的过程中发挥抑制作用，这类神经递质抑制类肽可作为肉毒杆菌毒素的良好替代物 4，同时因其安全、稳定、效果好被广泛应用到化妆品抗皱领域，但缺乏对此类多肽的系统研究。因此，概述了动态皱纹产生过程肌肉收缩的原理，神经递质抑制类肽的种类及其抗皱作用机理，以期为这类肽的后续研究提供参考。1 动态皱纹及产生原理1.1 动态皱纹简述动态皱纹又称为动力性皱纹，是表情肌活动产生的结果，是衰老的重要表现形式，哭、笑、皱眉等都会引起表情肌的收缩，长期的反复收缩就形成了动态皱纹，且不会随表情的消失而消失 1。人从婴孩时期就会以哭或笑表达情绪，但却少见婴孩产生皱纹，这是因为皮肤成分随着年龄的增加产生了变化，其中最明显的就是由成纤维细胞分泌的细胞外基质（extracellular matrix，ECM），代表性的如胶原蛋白、弹性蛋白和多糖等 5。一方面，真皮成纤维细胞通过转化生长因子-（TGF-）信号通路介导 ECM 的沉积和伸缩性，通过 Hippo 信号通路调节了 ECM 的体积刚度，通过Bmp/Noggin 信号通路调节毛囊生长，成纤维细胞的损伤导致 ECM 沉积、伸缩性与刚性产生变化，同时衰老机制介导产生的基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）损伤成纤维细胞，降低其机械张力和合成胶原蛋白的效率，促进 ECM 的降解，真皮胶原蛋白的密度、厚度和组织程度均降低，同时弹性蛋白减少，如图 1（a）所示 6-7。另一方面，表皮肥大细胞和朗格汉斯细胞的数量减少、角蛋白纤维变硬、脂质流失，造成角质层变薄、表皮硬化、通透性改变等结果 8。因此，相较于年轻人群的肌肤，衰老人群皮肤组织硬度和弹性的下降，使得皮肤在表情肌的作用下产生的移动很难恢复，久而久之形成皱纹，如抬头纹、法令纹、眼角纹等，见图 1（b）。但是，真皮成纤维细胞的衰老被称为不可逆的衰老，如何在“不可逆衰老”中寻求抗衰的可能，表情肌的相关活动显得尤为关 键 9。图 1 皮肤衰老与动态皱纹的产生 5,10（a）（b）专论与综述2023 年 8 月香料香精化妆品32www.ffc-1.2 动态皱纹产生机理表情肌活动引起肌肉收缩，这个过程主要发生在神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）部位（图 2）。NMJ 位于运动神经元轴突末梢（突触前膜），另一端与肌细胞相连（突触后膜），二者中间是 20 50 nm 宽的间隙 11。突触前膜含有大量的可以与膜结合的突触小泡，这些突触小泡包含神经递质乙酰胆碱（acetylcholine，ACh），并集中在突触前膜的电子致密结构周围形成诱发递质释放的“活性区”。突触后膜是肌细胞膜特化的终板结构，所以又称为终板。突触后膜被深深折叠，形成许多皱褶，乙酰胆碱受体（acetylcholine receptor，AChR）集中在皱褶的顶部，皱褶深处的膜含有高密度的电压门控钠通道（NaChs）12。突触间隙中包含能够水解 ACh 的酶与蛋白。的电信号继续沿着肌肉膜传播，引起肌细胞收缩 12。ACh 是神经递质家族中的一种，是肌细胞发生收缩活动的主要信号来源。ACh 在经由其合成酶合成后，通过囊泡被运输至膜边界（图 2），经由胞吐作用被释放，囊泡运输 ACh 的过程中 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE)是关键的细胞膜融合组分 15。SNARE 是含有细胞质两亲螺旋的小蛋白质分子，大小区间在 18 42 kDa，根据其位置的不同主要分为两类：一类是位于囊泡的蛋白（v-SNARE），如 synaptobrevin 等蛋白，另一类是位于突触膜上的蛋白（t-SNARE），如 syntaxin 和 SNAP-25/23 蛋白等，3 种蛋白按照111 的比例，前两者分别提供 1 个螺旋束，后者提供 2 个螺旋束，一起组成 SNARE 四螺旋复合物 16。Schoch 等 17通过敲除小鼠 v-SNARE 类蛋白发现由钙离子引发的囊泡融合减少了 100 倍甚至更多，其他融合减少了10倍，由此可见，v-SNARE的缺失影响 SNARE 的合成，抑制了囊泡的胞吐作用。syntaxin 是一种跨膜蛋白，具有一种特殊的结构域，通过折叠的方式改变构型，在囊泡融合的过程中产生作用，还能与其他调节蛋白（如 Munc-18 蛋白等）相互作用，确保融合过程顺利进行 18。而 SNAP-25 则没有这种结构域，它通过棕榈酰侧链连接到突触部位，是钙离子引发的囊泡融合的关键性蛋白，缺乏 SNAP-25 基因的小鼠同样表现出严重的胞吐抑制现象。与 v-SNARE 类蛋白不同的是，SNAP-25 是必需的胞吐作用的蛋白，二者都能被肉毒杆菌毒素破坏，阻碍 SNARE 的合成，从而达到抑制囊泡传递 ACh 的目的 16,19。单体AChR相对分子质量为250 000 275 000，并包含 2 个 ACh 结合位点，烟碱型（nAChR）和毒蕈碱型（mAChR），二者作用方式不同 20。其中，nAChR 属于直接门控或离子型受体，由 5 个亚单位组成五聚体，包括 l 10、1 4、和 等17 种亚基 21。该受体对阳离子敏感，但不区分阳离子，其中对二价阳离子（Ca2+）反应迅速，达到毫秒级，是肌肉信号通道中主要作用受体，而在中枢神经系统中是不同的门控通道 22。mAChR 属于代谢型受体，与 nAChR 属于不同的超基因家族，它主要参与中枢神经系统、周围神经系统和副交感神经末梢器官中 ACh 的释放，几乎不参与肌肉通道 ACh 的释放 23。图 2 ACh 的传递过程机理图 13NMJ 的信号传递过程是一个复杂的电化学反应过程 14。当神经冲动产生后，因离子浓度变化产生的动作电位沿着细胞膜传递至突触前膜时，细胞膜上电压门控钙通道瞬间打开，大量钙离子内流，突然增加的钙浓度触发突触小泡与活性区的突触前膜融合，通过胞吐的方式将囊泡内ACh 传递至突触间隙；随后 ACh 快速扩散到突触间隙，被突触后膜上的 AChR 迅速识别并结合，钠离子通道被打开，大量钠离子流入肌肉，产生第 4 期专论与综述彭 蕴，等：神经递质抑制类肽淡化面部动态皱纹作用机理及研究进展33www.ffc-2 神经递质抑制类肽近年来，越来越多的多肽在化妆品中发挥作用，根据其作用机理的不同分为信号类肽、神经递质抑制类肽、承载类肽和酶抑制类肽，其中神经递质抑制类肽因其可特异性地抑制神经递质分泌，是改善面部动态性皱纹的优良选择 24-25。神经递质抑制类肽主要通过 3 种机制来对抗动态皱纹：（1）通过影响 SNARE 复合体的合成过程，抑制胞吐作用；（2）通过与 ACh 竞争性结合 AChR，减少信号的传递；（3）在 ACh 与受体结合后，通过阻断其产生的钠离子的内流效应而阻断神经肌肉接头的信号传 递。这3种机制可阻碍信号的传递，减少肌肉收缩，放松脸部肌肉，缓解面部动态皱纹的产生。目前常见的神经递质抑制类肽有五肽-3、五肽-18、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、乙酰基六肽-1、红蝎毒素、类蛇毒肽、芋螺毒素等。在神经递质的传导过程中这些肽在不同的位点发挥不同的作用，几乎覆盖整个神经递质传导过程。2.1 五肽-3五肽-3 是一种通过合成技术得到的多肽，氨基酸顺序为甘氨酸脯氨酸精氨酸脯氨酸丙氨酸，是 AChR 的竞争性拮抗剂，通过结合AChR，阻止 ACh 与 AChR 结合，导致受体封闭，突触后膜上钠离子不能释放，减少电信号的产生，进而减少肌肉的收缩。研究表明，体外使用五肽-3 效果良好，即时减少 71%的肌肉活动，2 小时后衰减到 58%，连续使用 4 周后皱纹深度减少49%25。这表明五肽-3 能够有效抑制乙酰胆碱神经递质的释放，阻碍甚至切断信号传导的第一步。2.2 五肽-18五肽-18 的氨基酸顺序为 D-酪氨酸丙氨酸甘氨酸苯丙氨酸异亮氨酸，是一种经过修饰的脑啡肽，通过模拟脑啡肽的自然机制抑制神经元活动和儿茶酚胺释放 24。脑啡肽是一种内源性阿片类物质，通过与 G 蛋白耦联受体结合抑制神经元活动，结合后细胞内 G 蛋白亚单位（、和）开始释放，这些亚单位关闭钙离子通道并打开钾通道，钙离子无法内流，信号级联触发失败，囊泡不能与突触前膜融合，ACh 就不能被释放，因此，脑啡肽能够阻止肌肉收缩。五肽-18模拟脑啡肽，在神经细胞外与脑啡肽受体结合引起构象变化启动神经元引发级联反应，导致其兴奋性降低，乙酰胆碱释放减少，从而减少肌肉收缩，淡化皱纹 26。研究表明，质量分数0.05%的五肽-18能够减少 11.64%的皱纹 24。同时，五肽-18 还能干扰嗜铬细胞释放儿茶酚胺（一种信号介质），进而干扰可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体复合物的形成来调节囊泡对接 27。2.3 乙酰基六肽-8乙酰基六肽-8是最常用的合成抗衰老肽之一，是 N 末端残基乙酰化的 6 个氨基酸链（N-乙酰L-谷氨酰L-谷氨酰L-甲硫氨酰L-谷氨酰胺L-精氨酰L-精氨酰胺），分子质量为890 Da。以前称为乙酰基六肽-3，应用在化妆品当中的乙酰基六肽-8 多为酰胺化的。其作用机理为：一方面通过覆盖了 SNARE 复合物中的 SNAP-25 蛋白的 N-未端结构域，与 SNAP-25 竞争在SNARE 复合物中的位置，并在不破坏其任何组成部分的情况下破坏 SNARE 复合物形成的稳定性，导致囊泡不能有效与膜结合释放出 ACh，阻断肌肉电脉冲信号，有效减少肌肉收缩，最终减少面部动态皱纹的产生；另一方面，乙酰基六肽-8 可能具有抑制 Ca2+依赖性胞吐作用，模拟 A4,7 型肉毒杆菌神经毒素的活性，同时具有更高的安全性，是 A 型肉毒素的良好替代品 28。但是，乙酰基六肽-8 分子质量较大，高于 500 Da，较大的相对分子质量使其在皮肤中难以渗透，且其亲水性与皮肤的脂质屏障相斥，加剧渗透难度。体外研究表明，质量分数30%的乙酰基六肽-8暴露24小时后，大部分都从皮肤表面洗掉，几乎所有穿透皮肤的乙酰基六肽-8 都位于皮肤表面，仅质量分数 0.01%的样品到达表皮层，这些少量的乙酰基六肽-8 是否足以引起生理效应仍然需要探索。但也有研究表明，受试者将含质量分数 10%乙酰基六肽-8 的乳液每天 2 次涂抹于眼周部位，4 周后眼周皱纹改善 48.9%，且皮肤粗糙度降低，表明乙酰基六肽-8具有显著的抗皱功效 29。乙酰基六肽-8 在皮肤中的渗透吸收及有效浓度仍然需要进一步的研究。2.4 乙酰基八肽-3乙酰基八肽-3，在乙酰基六肽-3 上添加了 2 个氨基酸链，是乙酰基六肽-3 的延长类似物，是一种可替代肉毒素改善面部皱纹的较安全稳定的化妆品原料 30。SNAP-8 模拟 SNAP-25 的专论与综述2023 年 8 月香料香精化妆品34www.ffc-N 端，使其成为竞争性抑制剂，与 SNAP-25 竞争 SNARE 复合物中的位置，从而调节 SNARE复合物的形成。如果 SNARE 复合物稍微不稳定，则囊泡不能有效释放出 ACh，因此肌肉收缩减弱，皱纹也因此减少 31。在 1.5 mmol/L 浓度的SNAP-8 的情况下，谷氨酸释放下降，抑制效率超过 43%，皱纹减少约 62%32。乙酰基八肽-3 因增加的 2 个氨基酸链而被认为效果优于乙酰基六肽-8，但增加的相对分子质量也显示出同样的渗透吸收问题 30。2.5 乙酰基六肽-1乙酰基六肽-1 是一款全新用计算机设计完成的仿生肽，是针对突触前肌肉收缩过程的最佳氨基酸序列，表现出肉毒杆菌样活性。乙酰基六肽-1 具有调节突触前和突触后肌肉收缩过程的双重机制，Munc-18 蛋白与 syntaxin-1 首先形成 SM蛋白，进而与 SNAP-25 和 VAMP2 结合，同时保护 syntaxin-1 序列免受暴露，以此调控 SNARE 复合物的形成 33。乙酰基六肽-1 与 Munc-18 竞争syntaxin-1，缺乏 SM 蛋白导致 SNARE 复合物的合成受阻，进而抑制胞吐作用，减少 ACh 的释放，从而减少肌肉收缩，减少动态皱纹。在突触后机制中，乙酰基六肽-1 与 AChR 结合，破坏乙酰胆碱受体簇，减少肌肉收缩所需的钙释放，从而减少肌肉收缩，减少皱纹。数据表明使用质量分数 3%的乙酰基六肽-1 乳霜，每天 2 次涂抹于眼部肌肤，2 周后眼周皱纹深度和长度显著降低 34。这类通过计算机完成的肽成本昂贵且耗时长，一定程度上阻碍了多肽的发展速 度。2.6 红蝎毒素红蝎毒素是特定的由 26 个肽组成的 SNAP-25的 C 端的仿生肽，包含精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、胱氨酸、天门冬酰胺、丙氨酸、丝氨酸、色氨酸等。红蝎毒素与 SNAP-25 竞争其在突触前膜的 SNARE复合物中的结合部位，减少 ACh 的释放，从而实现面部肌肉放松来达到淡纹效果 35。红蝎毒素是一种近年来新合成的神经递质抑制肽，关于它的功效、安全性的相关数据十分有限，后续可对其进行研究开发，以拓展化妆品原料多样性。2.7 类蛇毒肽蛇毒肽（waglerin-1）是树栖蛇为了防止猎物逃逸而分泌的一种含 22 个氨基酸的多肽，它选择性地阻断突触后膜乙酰胆碱受体激活，使猎物产生痉挛、呼吸急促等生理变化，最终导致死亡。类蛇毒肽（二肽二氨基丁酰芐基酰胺二乙酸盐）是合成的三肽，模仿 waglerin-1 作用机理，是一种氨基酸盐，分子质量为 495.57 g/mol 36，作用于突触后膜，通过结合 mnAChR 的亚基来阻止 ACh 与受体结合，导致钠离子通道闭合，去极化不能发生，肌肉电脉冲信号被阻断，肌肉收缩减少，进而减少皱纹的形成，是 mnAChR 的可逆拮抗剂 31。使用含质量分数 4%该类蛇毒肽的护肤品，受试者在 2 周和 4 周后鱼尾纹面积分别减少 0.66 mm2和 2.1 mm2，对皱眉纹也有相似作用，但对笑纹没有明显作用，这可能跟嘴周的皮肤厚度有关 37。Heidi 研究发现在使用添加约 0.210 3 mol 类蛇毒肽 1 分钟后，肌肉细胞收缩减少 36%，2 小时后达到最大收缩减少（82%），这说明该多肽具有良好的即时效果，2 天后收缩减少了 67%，可以证明这种效果是持久的，但 4 天后肌肉活动表现出可逆性 38。2.8 芋螺毒素海洋生物芋螺在捕猎时通过分泌毒液麻痹猎物，分泌物中富含二硫键，多由氨基酸残基组成的肽，称为芋螺毒素或芋螺肽，最早于 1960 年被发现 39。这类肽的链长约 12 20 个氨基酸，具有高生物活性，参与神经元兴奋性和神经肌肉传递的配体和电压门控离子通道 40-41。根据作用位点的不同主要有-芋螺毒素（作用于 Ca2+通道）、-芋螺毒素（作用于 Na+通道）、-芋螺毒素（作用于 K+通道）、-芋螺毒素（nAChR 拮抗剂）。研究最多的是-芋螺毒素 42，它是芋螺毒素中最丰富的一类，大约有 80 种，通过与突触后膜上的AChR 结合，减少活化，阻断信号传递，达到减少肌肉收缩的目的 43。衰老小鼠模型证明注射-芋螺毒素对 nAChR 具有高效力，IC50值（半抑制浓度）为 4.68 nmol/L，衰老组小鼠的皮肤结构和胶原纤维明显改善 44。最新的研究关注-芋螺毒素 CnIIIC，是一种高效的 22 氨基酸残基芋螺肽，是电压门控钠通道 Nav1.4 的有效拮抗剂，能特异性地阻断肌肉纤维上钠离子内流，从而放松肌肉，淡化皱纹 45。值得注意的是，芋螺毒素本身相对分子质量较大，直接涂抹很难发挥作用，且-芋螺毒素的副作用大于-芋螺毒素，过量使用-芋螺毒素可能引起肌肉无力症状，甚至引起呼吸衰竭威胁生命 46。因此，如何控制芋螺毒素的相第 4 期专论与综述彭 蕴，等：神经递质抑制类肽淡化面部动态皱纹作用机理及研究进展35www.ffc-对分子质量且不影响生物活性，如何更安全地使用芋螺毒素仍然需要科学家们继续探索。3 结语面部表情肌长时间、频繁地收缩逐步形成肌肤纹路，进而形成动态皱纹。面部表情肌的收缩主要是依赖神经信号的传递，ACh 是重要的信号因子。多肽中的一部分肽被发现能够抑制 ACh 的传递，这些神经递质抑制类肽通过 3 种主要机制发挥作用。第一，模拟 SNP-25 等相关蛋白来减少SNARE 复合物的合成，通过减少囊泡与前膜融合抑制 ACh 的释放，如五肽-18、乙酰基六肽-8、乙酰基八肽-3、红鞋毒素等；第二，与 ACh 竞争性结合 AChR，阻碍甚至阻断信号传递，如乙酰基六肽-1、五肽-3；第三，拮抗突触后膜电压门控钠通道，特异性地阻断肌肉纤维上钠离子内流，中断信号传递，有效减少肌细胞活动，如-芋螺毒素等。神经递质抑制剂类多肽可参与 ACh 信号传递的全过程，能够在不同阶段影响信号传递。值得注意的是，这类多肽虽然能够阻碍信号的传递，但其在应用到化妆品中时，由于相对分子质量较大而无法吸收，仅通过涂抹很难达到抗皱的功效，只有很少的一部分能够到达角质层。这些到达角质层的少量多肽是否具有生物活性，以及是否会引起机体的其他生理反应还需要进一步研究。此外，过量使用神经递质抑制肽可能引起肌肉无力症状，甚至影响呼吸系统，危及生命。如何在安全范围内使用这些多肽仍需探索。参考文献 徐保境,李汉洪.面部皮肤松弛的类型与防治 J.中国美容1 医学杂志,2000,9(3):235.刘鹤,袁强,胡芹宝.注射用 A 型肉毒毒素在面部年轻化中2 除皱的效果 J.中外医学研究,2019,17(17):132-134.周翔,黎冻.A 型肉毒毒素在美容整形外科应用中的并发症3 及其防治 J.中国美容医学,2010,19(6):937-940.GOMES C,SILVA A C,MARQUES A C,4 et al.Biotechnology applied to cosmetics and aesthetic medicines J.Cosmetics,2020,7(2):33.FRANCO A C,AVELEIRA C,CAVADAS C.Skin senescence:5 mechanisms and impact on whole-body aging J.Trends in Molecular Medicine,2022,28(2):97-109.DRISKELL R R,WATT F M.Understanding fibroblast 6 heterogeneity in the skin J.Trends in Cell Biology,2015,25(2):92-99.王贺聪,何聪芬.皮肤衰老表现及相关标志物研究及应用 J.7 香料香精化妆品,2018(6):68-71.LEE H,HONG Y J,KIM M.Structural and functional 8 changes and possible 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