食用菌的分子生物技术研究现状.pdf

183 科学视界/2023年8月(上)现代医学与生命科学研究食用菌作为一项全球化产业，经济价值极其高，分子生物技术的应用为食用菌产业的发展创造了良好的条件。分子生物技术作为一项研究生物生命结构的技术，不仅能够推动生物医学领域的发展，而且还能为食用菌的分析和应用创造基础，从技术方面提供基础保障。国外学者 Devries 最早于 1972 年分离出裂褶菌。从此，分子生物技术就逐渐应用于食用菌的研究中。传统的食用菌主要采取自然培育、杂交育种的形式，质量和产量均无法满足人们的需求。而分子生物技术是以生物学为基础，在分子水平上进行核酸和蛋白质研究，从而了解研究目标的分子构成及生物特性。特别是近些年来，我国食用菌行业快速发展，人们逐渐认识到分子生物技术的价值，能够规避传统育种方式易受到环境因素影响的风险，进而推动食用菌产业向着高质量的方向发展。对此，文章综合近些年来关于食用菌的分子生物技术研究报道，对食用菌的品种选育、菌种鉴定、基因定位、基因编辑、基因克隆等方向的应用展开分析，从而为食用菌产业发展提供参考。一、食用菌品种选育对于食用菌产业的发展而言，品种是关键。我国从20 世纪七八十年代开始实现食用菌菌种大规模自主选育，主要采用自然选育、杂交育种、人工驯化、原生质体技术以及诱变技术等，其中广泛应用的是杂交育种方式，而且效果良好。针对杂交育种方式常常应用分子标记辅助进行，在食用菌品种选育中有着良好的效果。例如，针对白灵菇的研究，营养价值较高。近些年来，白灵菇的生长周期、培育时间以及菌种退化等问题对该产业的发展造成严重的影响。高坤梅在对白灵菇的杂交育种研究中采用单孢杂交育种方式，将不同亲本进行出菇处理，然后收集到子实体单孢子分离操作，获取单孢萌发的单核菌丝，然后进行配对杂交，获取和亲本菌株有着不同遗传背景的菌株，进而从杂交菌株中筛选出优良的菌株。其在试验中对 5 个白灵菇菌株进行两两拮抗试验，并进行同工酶测定，并从其中选择出拮抗明显、酶谱存在差异、亲本农艺性优良并且互补的两个菌株作为亲本，通过挑选长势比较旺盛的两个亲本单核菌株，在两两配对杂交后一共获取 150个杂交组合，再结合菌丝长势和镜检观察锁状联合有无，共获取 99 个具有锁状联合的优良杂交子，经过杂交诱导，最终有 50 个杂交菌株长出菇蕾。刘海娟采用原生质体提纯技术对白灵菇菌种进行试验，筛选出 41个原生质体双核菌株，并对其进行三个指标测定，分别是平板PDA培养基菌丝长速、平肝低温刺激形成原基、栽培料菌丝长速等，对其进行筛选后最终选出 15 个优良的原生质体菌株。在栽培试验中，生物学转化率高达 100-120%。再例如，针对草菇的研究，菌丝多核而且无锁状联合，杂交育种缺乏可实施的方法。在分子生物学不断发展下，分子标记逐渐应用于草菇杂交后代鉴定中。陈剑等人对草菇亲本和杂交后代采用 RAPD 技术进行标记，发现亲本单孢菌株和杂交菌株试管中未见到厚垣孢子，最终从其中筛选出具有潜力的假定杂交菌株 10 个。赵妍等人对 RAPD、SCAR 等分子标记进行创新，建立交配型基因分子标记，通用性更高，而且和常规草菇的杂交育种方式相对比，能够有效提升交配成功率，提升筛选耐低温草菇菌种的效率。二、菌种鉴定在食用菌的生产发展过程中，一些从业人员缺乏相关保护意识，或者单纯为了利益随意赋予菌种品名，导致菌种管理上出现混乱问题，同名异物、同物异名的现象比比皆是，对此就需要对菌种进行快速、准确的鉴定。在食用菌生产环境的影响下，形态学鉴定方式准确性较低，而且存在一定亲缘关系的品种实施拮抗试验差异不大，不同生长时期同工酶试验结果是不同的，这样就导致同工酶分析缺乏准确性，而应用分子生物技术就能将菌种的 DNA 序列遗传关系直接反映出来，而且不受生育时期和环境的影响，相比传统方式更加准确，当前已经广泛应用于菌种分类鉴定中。常用到的分子标记方式包括简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）、内转录间隔区（internal transcribed space，ITS）、单核甘酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）、细 胞 色 素 C 氧化 酶 亚 基 基 因（cytochrome c oxidase subumit gene，CO）。（一）SSRSSR 标记方式具有多种优点，包括多态性丰富、数量多、基因组内分布均匀、易检测、共显性标记等，将其作为优良的遗传标记应用于遗传连锁图谱构建、分子生态学、遗传多样性分析和进化学研究等领域中。吴锦荣等人结合香菇全基因组设计的 104 对 SSR 引物对香菇食用菌的分子生物技术研究现状乌伊含(内蒙古农业大学 生命科学学院，内蒙古呼和浩特，021000）摘 要 食用菌有着较高的经济价值和食用价值，在生物科技领域对其热度很高，其研究成果也为食用菌产业的种植与发展提供思路。结合近些年来国内外的相关文献报道，本文对食用菌的分子生物技术从品种选育、菌种鉴定、基因定位、基因编辑、基因克隆等方向的应用进行综述，为食用菌产业的发展提供一定的参考。关键词 食用菌；分子生物技术；研究现状中图分类号:S646.0 文献标识码:A 文章编号:1002-1221(2023)22-0183-03 184 科学视界/2023年8月(上)现代医学与生命科学研究21 株原生质体单合体进行遗传多样性分析。其中有 58对 SSR 引物呈现出多态性，这一比例达到 55.8%，共获取 430 条扩增带，其中多态性带占有 298 条，比例为69.3%。通过软件对试验菌株之间的遗传相似性进行分析，发现栽培品种和野生菌株之间存在明显的遗传差异，但是相似系数较高，同一双核体获取的两个原生质体单核体菌株之间存在非常近的遗传关系。章炉军等人对香菇 F2 代群体农艺性状的 SSR 关联进行分析，以沪香 F2 为亲本，构建 F2 代群体，在 PDA 平板上对 85 个F2 代菌株的菌丝生长速度、出菇周期、菌柄直径、菌盖直径、菌柄长度、单包产量、单包菇数等农艺性状进行测定，通过筛选获取 32 对具备多态性的 SSR 引物对其进行基因检测，共扩增出 93 条多态性条带，将测定的这几项农艺性状和 93 个 SSR 标记实施相关性分析，结果显示有 26 个标记存在性状关联。（二）ITSITS 是核糖体 DNA 序列，具有种间变异率低、序列小、应用范围广等优势，在真菌鉴定上发挥了重要作用。在 2011 年举办的第四届国际生命条形码大会上，将其作为真菌 DNA 条形码首要选择，在之后的发展中，进一步明确其作为真菌 DNA 条形码研究的重要任务。杨永彬等人对香菇菌株进行 ITS 序列分析检测，对 13 个菌株的 ITS、rDNA 序列进行分析后发现，除了个别存在突变之外，其余菌株的差异都较小，证明分子生物学技术在菌株鉴定区分上具有良好价值。崔筱等人对河南地区生产区的香菇资源通过拮抗和 ITS 序列进行鉴定和遗传多样性分析。收集 41 个香菇栽培菌株作为样本，两两之间进行拮抗测试，并提取出DNA进行分析，研究发现 ITS 序列对比分析将这 41 个香菇品种规划为独立进化的四大类，也就是三个不同菌株和八个不同亚种，种内的遗传距离为 0.0000-0.0065，和 Pleurotus ostreatus种间遗传距离为0.3740，判断出香菇的品种。袁滨等人通过 ITS 系列分析鉴定野生灵芝菌种，将从福建漳州采集到的 5 个野生大型灵芝作为试验菌体，对其菌丝体进行分离纯化，提取出基因组 DNA 并扩增其 ITS序列。经过研究对这 5 个野生灵芝进行准确鉴定。（三）SNPSNR 标记方式是第三代标记法，优点也较多，包括数量多、基因稳定、突变率低、分布密度大等。王大莉等人在香菇品种鉴别中应用功能基因 SNP 标记方式，再通过 NCBI 获取香菇 uck、mapk、ecgl 的功能基因序列，利用 Primer5.0 设计引物，PCR 扩增获取目的片段，进而通过软件对 15 个香菇栽培菌株的基因和序列进行对比分析，最终能够完全区分开 15 个香菇的栽培菌株，实现菌种鉴定。（四）CO 2003 年，加拿大分类学家 Hebert 等人首次提出对动物物种用 CO 基因作为条形码进行鉴定，在动物、红藻物种等鉴定中应用比较广泛，在食用菌方面的应用较少。宋驰等人利用 CO 对侧耳属物种进行鉴定，结果发现所有的菌株都能获取到单一条带，结合条带大小可以将试验的15个菌株分为4组，进而进行PCR扩增，显示每一个菌株只有在自己特异的引物中出现的目标条带。三、基因定位对于食用菌而言，其农艺性状包括酶活性、生长速度等，表现出连续变异情况，主要是由多个数量基因座位（QTL）以及环境所导致的。食用菌的育种都是为了获取优良的农艺性状，常规培育形式无法对其进行遗传改良，就需要构建遗传连锁图谱，寻找和数量性状点位存在连锁的分子标记，是进行QTL研究的基本形式。龚文兵等人利用 F2 群体的香菇遗传图谱构建为基础，探究其在 QTL 定位中的应用，研究发现能够提升遗传作图效率，解决作图群体和表型分离群体之间不一致的问题。四、基因编辑在生命科学不断发展下，基因编辑成为了生命科学研究的重要内容，研究者逐渐发现了第一代锌指核酸酶、第二代类转录激活因子效应物核酸酶、第三代CRISPR/Cas9 基因编辑技术，后者与前两者相对比，操作更加方便，而且靶向效率较高，广泛应用于各种植物的基因组定向编辑中，但是在食用菌中的研究较少。王亭立在研究中对杏鲍菇功能基因进行挖掘和编辑技术探索，通过基因组测序信息，结合 RNA-seq 数据分析发现，杏鲍菇和平菇之间存在接近的亲缘关系，并达到 86.54%。并将 RNA-seq 数据中表达量最高的 gpd基因和 TW1 基因进行 RT-qPCR 分析和 WesternBlotting 检测后发现，TW1 基因的启动子表达外源基因水平显著高于 gpd 基因的启动子，在该实验中成功的在杏鲍菇中构建了RNPs基因编辑技术，实现了对pyrG基因的敲除。五、基因克隆在食用菌研究领域，应用基因克隆技术，不仅能够实现食用菌功能基因定位，还能实现食用菌化学物质提取与复制。同时，利用基因克隆技术，能鉴定携带基因突变基因的等位基因菌株特性，便于培育食用菌品种，复制培育出更加优质的食用菌。袁学文、刘宗奇等人对香菇血红素过氧化物酶基因进行生物信息学分析、基因鉴定与基因克隆的研究，采用荧定量 PCR 对各 leHP 基因在香菇采后贮藏期间的表达进行研究，结果发现香菇中含有三个 leHP 基因，而且所有的基因均为亲水性稳定蛋白，理论相对分子质量 117597-120457，理论等电点 5.735.93。通过 PCR 扩增结果，发现各产物大小与预期一致，而且得到的 leHP 基因编码序列和已发表的基因组数据一直，通过各种进化关系分析表明，leHP基因 1、2、3 分别和牛肝菌、紫丁香蘑、安络裸柄伞具有同源性。艾柳英、柯萍萍等人对杏鲍菇、松杉灵芝两种食用菌漆酶基因克隆和表达进行研究分析，发现这两种食用菌的基因序列有着较大的差异，而且蛋白同源性较低。在对杏鲍菇进行基因克隆研究的过程中，发现其在高 N 低 C、完全培养基以及高无机盐中，胞外漆酶的酶活性较高，在转录基因表达上，表现出低 N、完全和高 N 低 C 培养基，在加入有机碳，比如蔗渣之后，能够有效促进松杉灵芝漆酶基因转录，并且提升漆酶的酶活性。综上所述，在生物科学领域中，分子生物技术作为 185 科学视界/2023年8月(上)现代医学与生命科学研究大学生心理健康是当前社会各界备受关注的话题，同时也是当前高校做好思想政治教育和日常管理工作中关注的关键问题之一。当前的大学生都是 2000 年以后出生的网一代孩子，他们在成长环境、性格特征等方面与以往的大学生还是存在着明显的差异。研究和工作实践均表明大一新生的心理健康及校园适应状况能够较大程度预测大学生大学四年的学业发展及心理健康水平。人格是一个人最坚硬的底牌，对于探寻大学生的心理健康状况具有重要意义，人格健全是心理健康发展的前提和基石。大五人格结构模型因为跨文化的稳定性得到了人格心理学家的广泛接受。因此，研究旨在探讨大一新生大五人格与心理健康之间的关系，从而从积极心理学视角为维护大学生的心理健康，促进人格完善提出建议。一、研究对象与方法（一）对象此次调查对象为某高校大一新生，应测人数为5694 人，剔除未测及无效问卷后，有效问卷为 5584 份，有效率为98.07%。其中男生为2799人，女生为2785人；独生子女为 1204 人，非独生子女为 4380 人；有 242人有寄养经历，5432 人无寄养经历。生源地为农村的学生为 3156 人，生源地为非农村的学生为 2428 人。（二）方法1.研究工具。（1）大五人格问卷。大五人格量表（NEO），主要用于人格结构的测查，包含了神经质、外向型、宜人性、开放性和责任感 5 个因子，共 60 个题目。采用李克特 5级计分，从 1 5 分别代表从非常不符合到非常符合。据研究表明该量表在中国大学生群体中具有较好的信度和效度。（2）症状自评量表（SCL-90）。症状自评量表（SCL-90）主要用于心理健康状况的评定和测查，包含了躯体化、强迫症状、人际关系敏感、抑郁、焦虑、敌对、恐怖、偏执、精神病性及其他等10个维度，共90个题目。从 1 5 分别代表从无该症状、症状较轻、中度、重度及严重。总分 160，视为阳性症状，总分 250 为严重问题。研究结果表明该量表具有较好的信度、效度。2.施测程序。本次调研在新生入学一个月之后进行，按照学院分批进行测试，测试前告知学生测试的目的，注意事项及测试的具体方式。测试依托学校采购的心理测评系统，在系统中导入学生基础信息，派发施测量表，学生用手机端扫描二维码即可自主参与测试。3.数据分析。测查完成之后从系统中导出原始数据采用 SPSS19.0 进行统计分析。二、研究结果（一）大一新生大五人格在人口社会学特征的差异比较通过对大一新生大五人格在性别、有无寄养经历的差异检验表明（见表 1），男生与女生在神经质、开放性维度上存在显著差异，且女生高于男生。有寄养经历的大一新生在神经质、外向性、宜人性、责任心四个维度上与不存在寄养经历的学生存在显著差异。有寄养经历的大一学生在神经质维度得分高于无该经历的学生，无寄养经历的大一学生在外向性、宜人性、责任心维度得分高于有该经历的学生。（二）大一新生 SCL-90 的调查结果大一新生大五人格与心理健康关系的实证研究陈炎秋（郑州航空工业管理学院，河南郑州，450015）摘 要 目的：探讨大一新生大五人格与心理健康的关系。方法：采用大五人格量表和 SCL-90 症状自评量表对某高校大一新生进行测查。结果：大一新生人格的整体特点较为积极。男生与女生在神经质、开放性维度上存在显著差异。大一新生心理健康的阳性检出率为 20.40%，整体状况优于全国大学生常模。除大五人格中的开放性与大一新生的偏执、精神病性两维度相关不显著外，其余各因子之间均呈现显著相关。关键词 大一新生；人格；心理健康中图分类号:G479.3 文献标识码:A 文章编号:1002-1221(2023)22-0185-03重要的实验手段，也是帮助人们了解生物体的基本构造、基本构成和化学物质组成的技术途径。针对食用菌的研究，从品种选育、菌种鉴定、基因定位、基因编辑、基因克隆等方向的应用展开分析，实现食用菌的准确鉴定和高效率培育，为食用菌产业发展提供良好的机遇。参考文献：1 高坤梅.白灵菇优良杂交菌株的初步筛选 D.邯郸:河北工程大学,2016.2 刘海娟.白灵菇原生质体提纯复壮及液体发酵条件优化研究 D.邯郸:河北工程大学,2021.3 陈剑,林原,谢宝贵,朱坚.利用 RAPD 技术鉴定草菇杂交后代 J.食药用菌,2011,19(02):21-23.4 赵妍,林锋,颜素雅,汪虹,陈明杰.高效草菇分子标记辅助杂交育种方法的建立与应用 J.微生物学通报,2015,42(06):1165-1174.5 吴 锦 荣,鲍 大 鹏.用 SSR 分 子 标 记 分 析 香菇原生质体单核体的遗传多样性 J.发酵科技通讯,2017,46(04):233-237.6 章炉军,高成,于海龙,宋春艳,尚晓冬,谭琦,王瑞娟,张美彦.香菇 F2 代群体农艺性状的 SSR 关联分析 J.食用菌学报,2019,26(01):1-10+100.