神经介素U蛋白在人甲状腺乳头状癌中表达的意义及作用机制.pdf

论 著文章编号（23）5-0521-05基金项目 河南省科技攻关项目（2 2 2 1 0 2 3 1 0 3 3 8）作者简介 高关清（1 9 8 3-），男，主治医师，硕士，研究方向：头颈疾病尤其是肿瘤的防治和诊疗等；E-m a il：g u a n q in g g a o 1 6 3.c o m。神经介素 U 蛋白在人甲状腺乳头状癌中表达的意义及作用机制高关清1，郭丹2，卢文亚1，张萍3，王芳2，石科2（1.河南省第二人民医院耳鼻咽喉科，郑州451191；2.河南医学高等专科学校生物化学与医学遗传学教研室，郑州451191；3.河南省第二人民医院普外科，郑州451191）摘要 目的：探讨神经介素U（NMU）蛋白在人甲状腺乳头状癌组织中的表达、临床意义及对细胞增殖的影响。方法：生物信息学分析GEPIA数据库中NMU在甲状腺乳头状癌组织及正常组织中的mRNA水平，并分析其表达与患者无病生存期的关系。进一步回顾性分析了来自河南省第二人民医院2016年3月2022年3月接受手术治疗的71例患者的临床病理资料。采用免疫组化法检测甲状腺乳头状癌组织和正常组织中NMU蛋白表达水平，分析其与患者临床病理特征的关系。培养TPC-1和KTC-1细胞，通过NMU的shRNA质粒转染下调NMU表达，通过集落形成实验及噻唑蓝（MTT）实验检测对甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响。结果：生物信息学分析揭示在GEPIA数据库中NMU的mRNA显著高表达，并与患者无病生存期显著相关。免疫组化揭示NMU在癌组织中显著高表达，而在正常组织中则为阴性或无表达，表达水平与肿瘤分期（高级别者42例，字2=8.184，P=0.004）及多灶（33例，字2=7.469，P=0.006）显著相关，而与患者的年龄、性别、淋巴结转移无关（均P0.05）。MTT实验（t=7.33，P=0.005 2；t=8.08，P=0.004 0）及集落形成实验（t=12.43，P=0.001 1；t=16.46，P=0.000 5）证实，NMU在甲状腺乳头状癌细胞中的下调抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖。结论：甲状腺乳头状癌组织中NMU显著高表达，且与患者侵袭性临床病理特征及无病生存有关，NMU蛋白促进甲状腺乳头状癌细胞增殖。关键词甲状腺乳头状癌；免疫组化；神经介素U蛋白；肿瘤分期；增殖中图分类号R736.1文献标志码The significance and mechanism of expression of neuromedin U protein in human papillary thyroidcarcinomaGAO Guan-qing1，GUO Dan2，LU Wen-ya1，ZHANG Ping3，WANG Fang2，SHI Ke2（1.Department of Otolaryngology，Henan Second Provincial Peoples Hospital，Zhengzhou 451191，China；2.Department of Biochemistryand Medical Genetics，Henan Medical College，Zhengzhou 451191，China；3.Department of General Surgery，Henan Second ProvincialPeoples Hospital，Zhengzhou 451191，China）AbstractObjective：To investigate the expression and clinical significance of neuromedin U（NMU）protein in human thyroid papillarycarcinoma tissues，as well as the effects on cell proliferation.Methods：The mRNA levels of NMU in thyroid papillary carcinoma tissues andcorresponding normal tissues in GEPIA database were analyzed by bioinformatics，and the correlation between its expression and disease-free survival of patients was analyzed.The clinicopathologic data of 71 patients who received surgical treatment in the Second PeoplesHospital of Henan Province from March 2016 to March 2022 were retrospectively analyzed.Immunohistochemistry was used to detect theexpression levels of NMU protein in papillary thyroid carcinoma tissues and paracancer tissues，and the relationship between NMU proteinexpression and clinicopathologic features of patients was analyze.The expression of NMU was down-regulated by shRNA plasmidtransfection in TPC-1 and KTC-1 cells，and the effects on the proliferation of thyroid papillary carcinoma cells were detected by colonyformation assay and thiazolyl tetrazolium（MTT）assay.Results：Bioinformatics analysis revealed that NMU mRNA was significantlyoverexpressed in GEPIA database，and was significantly correlated with disease-free survival.Immunohistochemistry revealed significantlyhigh expression of NMU in cancer tissues，while negative or no expression in paracancer tissues.The expression level was significantlycorrelated with tumor stage（42 cases with high grade，字2=8.184，P=0.004）and multiple foci（33 cases with 字2=7.469，P=0.006），but not withpatient age，sex，and lymph node metastasis（all P0.05）.Both MTT（t=7.33，P=0.005 2；t=8.08，P=0.004 0）and colony formation assays（t=12.43，P=0.001 1；t=16.46，P=0.000 5）confirmed that down-regulation of NMU in thyroid papillary carcinoma cells inhibited cellproliferation.Conclusion：NMU is highly expressed in thyroid papillary carcinoma tissues，which is related to clinicopathological featuresand disease-free survival of patients.NMU promotes proliferation of thyroid papillary carcinoma cells.Key wordsthyroid papillary carcinoma;immunohistochemistry;neuromedin U protein;tumor stage;proliferation天津医科大学学报Journal of Tianjin Medical University第29卷5期23年9月 29熏 5Sep.23521甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤，预后通常较好1。与其他类型的肿瘤类似，甲状腺乳头状癌的早期诊断对 提高生存率很重要。目前多种生物标志物和不同疗法成功用于甲状腺乳头状癌的诊断和治疗2-4。然而，阐明甲状腺乳头状癌转移的分子机制对 于开发新的甲状腺乳头状癌治疗方法至关重要。神经介素U（neuromedin U，NMU）蛋白是人体内源神经调节肽家族的重要成员，能够通过激活人体中枢和外周组织的神经介素U受体1（NMU receptor 1，NMUR），发挥多样而复杂的生理功能5。NMU是参与人体胃肠道免疫调节的重要角色，已有大量研究证实了它与炎症发生以及先天淋巴细胞的活性调控息息相关6。NMU激活NMUR后通过调节中枢神经系统和外周胃肠道运动两条途径来实现对 能量平衡的调节7。研究显示，NMU具有控制肿瘤进展的能力，并且有可能成为监控肿瘤发生与进展的标志物。NMU表达升高或降低与肿瘤细胞迁移、侵袭、糖代谢、上皮间充质转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）、维持肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）表型等密切相关，进而影响肿瘤的免疫反应、药物敏感性和治疗效果等8。结直肠癌细胞分泌的NMU能在表达NMUR2受体的CRC细胞中诱导侵袭性表型9。NMU也是肺腺癌患者预后不良的生物标志物10。然而NMU在甲状腺乳头状癌中的表达及对 其潜在影响仍然未知。本研究主要探讨NMU蛋白在人甲状腺乳头状癌组 织中的表达及临床意义及对 细胞增殖的影响。1材料和方法1.1基因表达GEPIA分析在线软件GEPIA（http：/gepia.cancer- 图谱RNA序列而建立的程序，本研究采用GEPIA检测甲状腺癌和正常甲状腺标本中NMU mRNA水平，及其在不同类型肿瘤中的表达。NMU在甲状腺癌中的表达在expression DIY（The Boxplot TAB）中显示，截断标准为log2FC1和P0.01。1.2临床资料收集2016年3月2022年3月河南省第二人民医院71例甲状腺乳头状癌患者手术切除的肿瘤及正常组 织标本，分析其临床病理资料特征。全部病例均经过病理证实，术前未经化疗或放疗，且具有完整的病例资料。收集患者的一般临床资料，包括年龄、性别、肿瘤分期、淋巴结转移和腺内传播等。71例甲状腺乳头状癌患者年龄4365岁，平均年龄（57.55.75）岁；男性14例，女性57例；肿瘤分期低级别者29例，高级别者42例；淋巴结转移未转移者28例，转移者48例；多灶者33例，单灶者38例。1.3试剂NMU抗 体 为 兔 抗 人 单 克 隆 抗 体（ab2296335、abcam、Cambridge），-肌动蛋白（-actin）抗体（11 000稀释，ab8226、abcam）。免疫组化稀释浓度为1100，免疫印迹稀释浓度为11 000；免疫组 化二步法检测试剂盒（PV-6001）、DAB显色试剂盒（ZLI-9018）均购于北京中衫金桥生物技术有限公司；噻唑蓝（methylthiazoly tetrazolium，MTT）购自美国Sigma-Aldrich公司。1.4方法及免疫组化染色结果的评分标准甲状腺乳头状癌肿瘤及正常的组 织进行福尔马林固定，并用石蜡全包埋，包埋后的蜡块标本行5 m切片及免疫组化染色，抗体1100稀释。切片于75孵育30 min后，二甲苯脱蜡及梯度乙醇水合。柠檬酸缓冲液孵育20 min后5%BSA于室温封闭30 min。封闭后NMU抗体孵育2 h，二抗孵育1.5 h，通过DAB法显色，随后苏木素染色。组 化切片于蔡司显微镜下拍照。评分标准：阳性细胞比例：阳性细胞数20%为0分；阳性细胞百分率为20%50%记1分；肿瘤细胞阳性百分率为50%70%记2分；肿瘤细胞阳性百分率70%则为3分；同时对 阳性着色细胞的染色强度进行评分：阴性表达记0分，弱阳性表达记1分，中等阳性2分，强阳性记为3分；最终计分结果为阳性细胞比例分数加染色强度分数，范围为06分。02分为NMU低表达，36分为NMU高表达。1.5细胞培养及转染甲状腺乳头状癌的细胞系TPC-1和KTC-1细胞购自美国模式菌种收集中心（ATCC）。shRNA质粒购自Addgene。TPC-1和KTC-1细胞均于含有10%胎牛血清（FBS，美国Gibco公司）的RPMI-1640培养基（美国Gibco公司）中进行培养。细胞转染采用脂质体转染法进行。细胞实验分为对 照 组（转染对 照shRNA质粒）及NMU下调组（转染NMU的shRNA质粒），实验所用质粒购自Charles River公司，货号SH814099，序列如下：CCGCTCCTGCTGCTGCTGCTGCT。取2 mL灭菌的EP管加入质粒或Lipo2000和1.5 mL Opti-MEM培养基，室温孵育5 min。随后两者混合后孵育20 min，加入细胞培养基中，6 h后换液，24 h后进行功能实验。1.6蛋白质印迹法（Western blotting）实验利用RIPA细胞裂解液提取细胞总蛋白，使用BCA法测量蛋白浓度。加入蛋白酶抑制剂后，将总蛋白进行10%SDS-PAGE电泳后，转膜至聚偏氟乙烯（PVDF）的第29卷天津医科大学学报522图2 NMU在甲状腺乳头状癌中的表达水平Fig 2 TheexpressionlevelsofNMUinthyroidpapillarycarcinoma注：A：GPEIA数据库分析NMU mRNA在甲状腺乳头状癌组 织及正常组 织中的表达差异；B：NMU mRNA表达水平与甲状腺乳头状癌患者无病生存期的关系；NMU：神经介素U图1 NMU的mRNA水平在甲状腺癌中显著增加并与患者不良预后显著相关Fig 1mRNA levels of NMU are significantly increased in thyroidcancer and are significantly associated with poor prognosisin patients膜上，5%脱脂奶粉进行室温固定2 h，室温条件下NMU一抗（11 000）孵育2 h，随后Tris-HCL缓冲液（TBST）洗脱未结合抗体，共洗5次，每次5 min；随后室温山羊抗兔二抗（13 000）孵育45 min，TBST洗脱未结合抗体，共洗5次，每次5 min，加入ECL增强显影底物后在曝光仪中检测信号，所得信号使用Image J 8.0软件进行分析。1.7实时定量荧光PCR通过TRIzol试剂提取HUVEC细胞内总RNA，并进行两步法反转录，条件为42，1 h，所得cDNA通过SYBR荧光探针进行实时定量聚合酶链式反应（PCR），并使用-actin作为内参，检测相关mRNA的表达水平。实验结果采用2CT法进行定量。NMU正向：5-AGT TGTGGA ATG AGG CAT CC-3，反向：5-GGA TGC ACA ACT GAC GAC AC-3；-actin：正向5-GCACTC TTC CAG CCT TCC TT-3，反向：5-GTT GGCGTA CAG GTC TTT GC-3。以2-CT公式计算出-actin和NMU相对 表达量。1.8MTT实验细胞铺于96孔板中，进行质粒转染处理后于48 h加入40 L的MTT试剂，37培养箱孵育4 h，应用200 L的DMSO震荡溶解，随后在570 nm波长下使用多功能酶标仪检测其吸光度值。每组实验设3个重复，统计结果。1.9集落形成实验细胞进行质粒转染处理后48 h铺于6孔板中，每孔约1 000个细胞，37培养箱培养14 d，随后使用0.2%的结晶紫染色15 min，使用4%多聚甲醛室温固定20 min，流水缓慢冲洗，随后奥林巴斯荧光显微镜下观察拍照，使用Image J 8.0软件分析图片。1.10统计学处理统计学处理采用Graphpad 8.0软件。符合正态分布的计量数据采用表示。通过GPEIA数据库分析NMU mRNA在甲状腺乳头状癌组织中的表达。通过卡方检验比较临床病理特征与患者肿瘤组 织NMU表达的相关性，P0.05表示差异具有统计学意义。2结果2.1生物信息学分析揭示NMU的mRNA在甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中高表达且与患者预后相关首先通过GPEIA数据库分析NMUmRNA水平在512例人甲状腺乳头状癌组织及对 应的337例正常组织中的差异，发现在肿瘤组织中NMU mRNA呈显著高表达（图1A，P=0.006）。且生物信息学分析结果证实甲状腺乳头状癌患者肿瘤组 织NMU的表达与患者无病生存率显著相关（图1B，P=0.021）。2.2NMU蛋白在甲状腺乳头状癌患者肿瘤组织中高表达并与患者临床病理特征显著相关将肿瘤组 织按NMU的表达水平分为高表达组 与低表达组，结果发现，相对 于正常组织，NMU蛋白在人甲状腺乳头状癌组织中呈显著高表达（图2）。对 染色结果进行评分量化分析，结果证实，NMU表达水平与甲状腺乳头状癌患者的肿瘤分期100200低表达高表达100200AB1.00.80.60.40.20.005010015086420ABNMU表达水平THCAnum（T）=512；num（N）=337存活率无病生存率生存时间（月）注：A：肿瘤组织；B：正常组织；NMU：神经介素UNormal高关清，等.神经介素U蛋白在人甲状腺乳头状癌中表达的意义及作用机制第5期523NMU表达特征n=71低高字2Pn=17n=54年龄（岁）0.5430.4614524（33.8）7（9.9）17（23.9）4547（66.2）10（14.1）37（52.1）性别0.6440.422男14（19.7）5（7.0）9（12.7）女57（80.3）12（16.9）45（63.4）肿瘤分期8.1840.004T129（40.8）12（16.9）17（23.9）T2T342（59.2）5（7.0）37（52.2）淋巴结转移0.0060.938是34（47.9）8（11.3）26（36.6）否37（52.1）9（12.7）28（39.4）多灶情况7.4690.006是33（46.5）3（4.2）30（42.3）否38（53.5）14（19.7）24（33.8）（P=0.004）及多灶情况等（P=0.006）密切相关，而与其他的临床特征，包括年龄（P=0.461）、性别（P=0.422）、淋巴结转移（P=0.938）等无显著相关性（表1）。2.3下调NMU蛋白抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖与对 照 组 相比，NMU下调组TPC-1和KTC-1细胞NMU的mRNA及蛋白水平均显著下降（t=7.96、7.37、10.42、7.69，均P0.05），见图3。集落形成实验结果表明，在TPC-1和KTC-1细胞中，NMU蛋白的下调会导致形成集落的数量下降（图4A，t=12.43，P=0.001 1；t=16.46，P=0.000 5）。MTT实验结果表明，在TPC-1和KTC-1细胞中，NMU蛋白下调后TPC-1和KTC-1细胞平均吸光度值均下降（图4B，t=7.33，P=0.005 2；t=8.08，P=0.004 0）。3讨论甲状腺乳头状癌是最为常见的一种甲状腺癌，其生长缓慢，恶性程度低，预后通常较好。其发生会受到辐射、激素、遗传、环境及炎症等因素的影响。由于甲状腺乳头癌对 放化疗不敏感，因此靶向治疗便成了最有潜力的一种治疗手段11。然而截至目前，甲状腺乳头状癌的治疗靶点有限。为了进一步提高患者的生存率，仍需发现新的更有效的治疗靶点。NMU在多种肿瘤中均出现高表达并与不良预后相关，因此进一步借助ProteinAtlas验证NMU mRNA在多种肿瘤中与患者预后的相关性。在本研究中发现，NMU在甲状腺乳头状癌中显著高表达，并与患者的无病生存期显著相关，提示不良预后。进一步的临床病理特征分析证实NMU的表达与患者的肿瘤分期及多灶情况密切相关，而这两种特征均与甲状腺乳头状癌的转移有关。因此推测NMU可能参与甲状腺乳头状癌的进展和转移，是一个甲状腺乳头状癌的潜在治疗靶点和标志物。注：A：qPCR检测NMU的shRNA质粒转染后24 h，TPC-1和KTC-1细胞中NMU mRNA的表达；B：免疫印迹检测NMU的shRNA质粒转染后24 h，在TPC-1和KTC-1细胞中NMU蛋白的表达；*P0.05图3 NMU的shRNA在甲状腺乳头状癌细胞系TPC-1和KTC-1中的沉默效率Fig 3 shRNA silencing efficiency of NMU in thyroid papillary cancercell lines TPC-1 and KTC-1注：A：NMU下调后TPC-1和KTC-1细胞集落形成实验；B：NMU下调后培养48 h，TPC-1和KTC-1细胞的MTT实验，*P0.05图4NMU下调抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖Fig 4NMU down-regulation inhibited the proliferation of thyroidpapillary cancer cells表1 71例甲状腺乳头状癌患者NMU的表达水平与临床病理特征相关性分析n（%）Tab 1Correlation analysis between NMU expression levels andclinical pathological characteristics in 71 patients with papillary thyroid cancer n（%）TPC-1KTC-1TPC-1KTC-11.00.80.60.40.20.0OD值（570 mm）1.00.80.60.40.20.0OD值（570 mm）对 照 组shRNA组对 照 组shRNA组250200150100500TPC-1KTC-1克隆细胞数量对 照 组shRNA组对 照 组shRNA组AB*1.00.80.60.40.20.0对 照 组shRNA组NMU-actinNMU-actinKTC-1NMU基因表达1.00.80.60.40.20.0NMU基因表达TPC-1KTC-1对 照 组shRNA组TPC-11.00.80.60.40.20.0NMU蛋白质表达对 照 组shRNA组1.00.80.60.40.20.0NMU蛋白质表达对 照 组shRNA组A*B注：NMU：神经介素U第29卷天津医科大学学报524为了证实推测，进一步利用两种甲状腺乳头状癌的细胞系开展体外实验。通过转染NMU的shRNA质粒，下调NMU的表达，并通过集落形成实验和MTT实验检测其对 细胞增殖的影响，结果表明，NMU的下调显著抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖。因此，研究初步揭示了NMU在甲状腺癌中的功能。NMU表达水平的改变能够影响癌细胞的多种功能，如增殖、迁移、侵袭、代谢、EMT等，进而影响肿瘤免疫、药物敏感性和治疗效果8。研究表明，结直肠癌细胞分泌的NMU能够调节肿瘤微环境，促进细胞侵袭9。另有研究证实，NMU在人树突细胞中表达12，而NMUR1在免疫效应细胞（如T细胞、NK细胞）中表达13，提示抗原提呈细胞和免疫效应细胞群之间存在相互作用，并进一步提示NMU可参与肿瘤的免疫治疗。除此之外，NMU作为一种神经调节蛋白，也能参与代谢过程，负责调节能量消耗、进食行为，维持生命的新陈代谢14。而肿瘤的微环境及肿瘤细胞代谢在甲状腺癌进展与转移中同样扮演重要角色15，故有理由推测NMU可能通过调控甲状腺肿瘤细胞的代谢影响肿瘤进展。在本研究中，初步发现NMU对 甲状腺乳头状癌细胞增殖的影响，而对 于细胞迁移及代谢等方面的影响仍需进一步体内外研究证实。总之，本研究发现了NMU在甲状腺乳头状癌中显著高表达，并与患者的无病生存期显著相关。NMU的表达水平与甲状腺癌患者的肿瘤分期及多灶情况密切相关，且NMU的下调能够抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖，提示其可作为甲状腺乳头状癌的潜在治疗靶点。参考文献：1 MIRANDA-FILHO A，LORTET-TIEULENT J，BRAY F，et al.Thyroid cancer incidence trends by histology in 25 countries：a population-based studyJ.Lancet Diabetes Endocrinol，2021，9：225-234.2 LIN R X，YANG S L，JIA Y，et al.Epigenetic regulation of papillarythyroid carcinoma by long non-coding RNAsJ.Semin Cancer Biol，2022，83：253-260.3 HARRIES V，WANG L Y，MCGILL M，et al.Should multifocality bean indication for completion thyroidectomy in papillary thyroid carcinoma?J.Surgery，2020，167：10-17.4 BERGDORF K，FERGUSON DC，MEHRAD M，et al.Papillary thyroid carcinoma behavior：clues in the tumor microenvironment J.Endocr Relat Cancer，2019，26：601-614.5DE PRINS A，VAN EECKHAUT A，SMOLDERS I，et al.Neuromedin U and structural analogs：an overview of their structure，function and selectivityJ.Curr Med Chem，2020，27：6744-6768.6 YE Y，LIANG Z，XUE L.Neuromedin U：potential roles in immunityand inflammationJ.Immunology，2021，162：17-29.7 DOGGRELL S A.Neuromedin U-a new target in obesityJ.ExpertOpin Ther Targets，2005，9：875-877.8PRZYGODZKA P，SOBOSKA K，SOCHACKA E，et al.NeuromedinU：a small peptide in the big world of cancerJ.Cancers（Basel），2019，11（9）：1312.9PRZYGODZKA P，SOBOSKA K，SOCHACKA E，et al.NeuromedinU secreted by colorectal cancer cells promotes a tumour-supportingmicroenvironmentJ.Cell Commun Signal，2022，20：193.10 WU Y，MCROBERTS K，BERR SS，et al.Neuromedin U is regulatedby the metastasis suppressor RhoGDI2 and is a novel promoter of tumor formation，lung metastasis and cancer cachexiaJ.Oncogene，2007，26：765-773.11 FILETTI S，DURANTE C，HARTL D，et al.Thyroid cancer：ESMOClinical Practice Guidelines for diagnosis，treatment and follow-updaggerJ.Ann Oncol，2019，30：1856-1883.12 LI Y，GAO Y，CHU W，et al.Differences in and verification of genetic alterations in chemotherapy and immunotherapy for metastaticmelanomaJ.Aging（Albany NY），2021，13：23672-23688.13 HEDRICK J A，MORSE K，SHAN L，et al.Identification of a humangastrointestinal tract and immune system receptor for the peptideneuromedin UJ.Mol Pharmacol，2000，58：870-875.14 MALENDOWICZ L K，RUCINSKI M.Neuromedins NMU and NMS：anupdatedoverviewoftheirfunctionsJ.FrontEndocrinol（Lausanne），2021，12：713961.15 FERRARI S M，FALLAHI P，GALDIERO M R，et al.Immune andinflammatory cells in thyroid cancer microenvironmentJ.Int J MolSci，2019，20（18）：4413.（2023-02-10收稿）高关清，等.神经介素U蛋白在人甲状腺乳头状癌中表达的意义及作用机制第5期525