视黄醇结合蛋白7调控Akt_mTOR信号通路对乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响.pdf

论 著视黄醇结合蛋白 调控 信号通路对乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响 上海 复旦大学附属华东医院乳腺外科秦朝晖，李蔚萍，胡天华，程爱群，洪丽霞【摘 要】目的 探讨视黄醇结合蛋白（）调控蛋白激酶（）哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（）信号通路对乳腺癌细胞增殖和迁移侵袭的影响。方法 网站用于分析乳腺癌组织的 表达，实时定量（）用于检测乳腺癌细胞（、和）的 表达。将 细胞分为 组（阴性对照）、组（上调 表达）和 组（上调 表达且增强 活性）。和 用于检测磷酸化（）、磷酸化（）和 的表达。法、划痕愈合实验和 小室实验检测 细胞的增殖、迁移和侵袭情况。结果 在乳腺癌组织和细胞中低表达（）。生物信息学分析显示 低表达乳腺癌患者的预后较差。组、和 的表达低于 组（）；而 组、和 的表达高于 组（）。此外，组 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均弱于 组（），而 组 细胞的增殖、迁移和侵袭能力均强于 组（）。结论 通过调控 通路抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，可能为乳腺癌患者提供一种新的治疗干预手段。【关键词】乳腺癌；视黄醇结合蛋白；蛋白激酶 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号；侵袭迁移中图分类号：文献标识码：文章编号：（），【】（），（）（），（，）（），（）（），（），（）（），（）（），（），（），【】；临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤类型，在高人类发展指数和低人类发展指数地区其年龄标准化发生率分别为每年 和 万女性，据统计数据预测，全球每年新增病例数为，例，呈迅速增长趋势。因此，了解乳腺癌发病机理、鉴别新的诊疗标志物对于减少乳腺癌造成的社会经济负担以及改善患者预后至关重要。视黄醇结合蛋白（，）包含 个氨基酸，是细胞视黄醇结合蛋白（，）家族成员之一，由 基因编码，该基因位于人类染色体 。据报道，参与调节某些疾病的发生发展过程。例如，调控视黄醇代谢相关基因 表达，与脂肪细胞分化相关；在血管内皮细胞中，作为过氧化物酶体增殖物激活受体 的靶基因，通过与其形成正反馈回路，拮抗肾素血管紧张素系统，维持血管完整性，发挥一定心脏保护作用。还被发现在结直肠组织中表达缺失，可能作为肿瘤微环境调节因子来诱导 耐药。近期有研究显示 对 型乳腺癌的他莫西芬治疗反应有显著预测价值。蛋白激酶（）哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（）信号通路是调控基本细胞功能的最关键信号通路之一，参与细胞增殖、存活、侵袭、迁移、凋亡、葡萄糖代谢和 修复等过程。信号通路的突变常在癌症中被发现，在乳腺癌中尤其常见。然而，是否通过 信号通路影响乳腺癌进展尚不清楚。因此，本研究旨在探究乳腺癌中 的表达及其对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和 信号通路的影响，进一步揭示 调控乳腺癌的潜在机制，现将研究结果报道如下。材料与方法 生 物 信 息 学 分 析 通 过 数 据 库（：）分 析 平 台，模块 中点击 ，进入 ，栏中输入，选择 分析，样本来源选择 ，选择疾病名称乳腺浸润性癌（，），点击，分析 在 例 肿瘤组织和 例正常组织中的表达情况。模块 中点击 ，栏中输入，选择分析，值选择，样本来源选择 ，选择疾 病 名 称，点 击，分析 表达与 患者预后的关系。细胞和主要试剂 乳腺癌细胞（、）和人正常乳腺上皮细胞 购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所（上述细胞均由本院实验中心冻存），实时定量（）引物、和 过表达重组载体质粒 购自通用生物（安徽）股份有限公司，信号通路激动剂 购自美国 公司，培养基、胎牛血清、检测试剂盒和脂质体 购自美国 公司，逆转录试剂盒 和 试剂盒 购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，试剂和 购自北京索莱宝公司，兔源多克隆磷酸化（）、磷酸化（）、和 一抗以及 标记的二抗购自武汉博士德生物工程有限公司。细胞培养和分组 将细胞加入含有 胎牛血清及 青霉素链霉素的 培养基，在 、恒温湿润细胞培养箱中进行培养。利用转染试剂分别将 、和 转染至 细胞，根据处理情况分组如下：组（阴性对照）、组（过表达）、组（过表达 同时激活 通路）。总 提取和 利用 试剂提取细胞总，通过试剂盒逆转录为 并以上述 为模板行 检测。基因扩增条件：变性 ；个循环的 延伸 、退火 。扩增体系：（）、上下游引物（）各 、。作为内参，法计算各基因的相对表达量。上游引物：，下游引物：；上游引物：，下游引物：；上游 引 物：，下游引物：。实验转染处理后、收 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，集 细胞置于 培养基，每孔加入 的 溶液，培养箱孵育 ，加入 二甲基亚砜溶液震荡反应。酶标仪读取 波长下各孔细胞的光密度值（）。划痕愈合实验 将 细胞按照 的密度接种至 孔板，待细胞贴壁生长至融合度 时进行划痕操作，即使用灭菌枪头垂直于孔板底部划一条直线，显微镜下拍照记录；冲洗，加入无血清 培养基培养 ，冲洗，显微镜下再次拍照记录。根据伤口划痕宽度计算细胞愈合率。小室实验 用不含胎牛血清的 培养基重悬 细胞，取 个细胞接种到小室上室，下室加入 含 胎牛血清的 培养基，培养箱培养 。冲洗小室，浸于多聚甲醛溶液固定 ，弃去上室废液，棉棒轻轻擦拭上室内多余液体和细胞，浸于结晶紫染料工作液染色 ，流水冲洗干净，显微镜下拍照并细胞计数。处理 后收集 细胞，利用 裂解液提取细胞总蛋白。蛋白样本经过变性后进行电泳 分离目的蛋白，转膜，置于 牛血清白蛋白室温封闭 ，孵育一抗（以 比例稀释）并过夜，洗膜，室温孵育羊抗兔二抗（以 比例稀释），洗膜，滴入 试剂显影，避光曝光拍照，进行条带灰度分析。统计学分析采用 版统计学软件进行分析。本研究数据以均数标准差表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间比较采用 检验。以 为差异有统计学意义。结 果 乳腺癌组织的 表达 数据库分析显示 在 组织中的表达水平低于正常组织，差异有统计学意义（）；低表达 者的总生存期缩短，差异有统计学意义（）。见图。乳腺癌细胞的 表达相较于人正常乳腺上皮细胞（），乳腺癌细胞（）、（）、（）、（）、（）和（）中：表达水平；：生存预后曲线；图 在乳腺癌组织的表达及其与患者预后关系 的 相对表达水平下调，差异均有统计学意义（）；选择 表达下调程度显著的 细胞作为研究对象。见图。过表达效率 相较于 组（）和 组（），组 的 相对表达水平升高至 ，差异有统计学意义（），组和 组 相对表达水平的差异无统计学意义（）。见图。过表达对 信号通路的影响相较于 组，组 细胞中 和 的磷酸化表达水平降低（），同时 的相对 和蛋白表达水平均降 低（）；相 较 于 组，组 细胞中 和 的磷酸化表达水平升高，同时 的相对 和蛋白表达水平均升高（）。见图。临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，与 细胞比较，图 乳腺癌细胞的 表达水平与 组细胞比较，图 细胞的 表达水平 过表达对细胞增殖的影响相较于 组，组 细胞活力降低（）；而相较于 组，组 细胞活力升高（）。见图。过表达对细胞迁移的影响 相较于 组的（），组 细 胞 伤 口 愈 合 率 降 低 至（）（）；而相较于 组，组 细胞伤口愈合率升高至（）（）。见图。过表达对细胞侵袭的影响相较于 组的（）个，组 细 胞 穿 膜 数 量 减 少 至（）个（）；而 相 较 于 组，组 细 胞 穿 膜 数 量 增 加 至（）个（）。见图。讨 论 被称为，属于是 亚家族成员之一，该家族属于脂肪酸结合蛋白家族，不同成员拥有相对不同的视黄醇结合模式，是视黄醇构象维持和细胞内正常代谢转运所必需。在肿瘤中 常表现为表观沉默，与细胞的分化丧失和肿瘤的恶性进展有关。还是维甲酸信号传导的关键蛋白，主要参与调节细胞增殖分化，而多种维甲酸类化合物在临床上已经被证实是肿瘤治疗的靶向药物，包括急性早幼粒白血病、卵巢癌、乳腺癌等。在乳腺癌中，早期有学者发现 在乳腺癌细胞 和 中表达缺失，过表达：水平；：记录图；：蛋白相对水平；图 各组 细胞 信号通路的活性 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，图 各组 细胞的增殖曲线：划痕实验记录图（）；：小室实验记录图（）；：划痕愈合率；：穿膜细胞数；图 各组 细胞迁移侵袭能力的评估结果 明显抑制细胞存活。维甲酸活性介导蛋白 和 作为分子伴侣，影响乳腺癌细胞的维甲酸敏感性。近期有研究发现，在乳腺癌中低表达，这种表达沉默可能与其启动子高甲基化相关，并且能够增加乳腺癌耐药细胞对他莫西芬的敏感性，。本研究首先通过生物信息学分析显示 在乳腺癌组织中的表达水平低于正常组织，且低表达患者的生存预后较差，同时收集不同乳腺癌细胞系进行检测，与组织分析结果趋势一致。为进一步分析 是否影响乳腺癌细胞的增殖和迁移侵袭等生物学行为，本研究以细胞检测结果中 表达下调较为显著的 细胞为研究对象并构建 过表达体系。检测结果显示上调 表达减弱 细胞的增殖能力，同时抑制细胞的迁移和侵袭过程，明显缓解了乳腺癌细胞的恶性表型。是肿瘤中最常被激活的、能够促进细胞恶性生长存活、运动转移的信号通路，主要组分包括、以及下游效应基因 等，其中关键成分在乳腺癌等多种癌症中出现 临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，失调或突变，。例如，编码 催化亚基 的 基因突变在乳腺癌中最为常见，在 型、和基底样乳腺癌亚型中发生频率为、和。近期有学者通过 网络分析和 数据库分析发现 信号通路在乳腺癌组织中富集，并且 和 表达呈现明显负相关性，暗示 轴在乳腺癌发展中的潜在调控作用。本研究检测发现过表达 明显下调了 细胞中 和 的磷酸化表达，同时下游 基因表达水平降低，说明 能够抑制 信号通路活性。前期有研究表明 能够通过维甲酸受体依赖机制，调节 异二聚体，直接失活 通路来影响乳腺上皮细胞生长。为进一步证实 是通过调控 信号影响乳腺癌细胞生物学行为，本研究在增强 表达同时加入 信号激动剂处理 细胞进行挽救实验，检测结果显示 信号激动剂明显减弱了过表达 对 细胞增殖、迁移和侵袭过程的抑制作用，由此推测 可以通过 信号通路影响乳腺癌进展。综上所述，本研究显示 在乳腺癌组织和细胞中表达下调，通过负调控 信号通路活性抑制细胞增殖与迁移侵袭过程，作为抑瘤因子来参与乳腺癌进展。参考文献 ，：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，：，：，（）：，：，：，（）：，：，：，（）：，：，（）：，（），（）：，：，：，（）：收稿日期：；修回日期：临床肿瘤学杂志 年 月第 卷第 期 ，