浅谈核酸保护液的保护效果.pdf

472023 年第 3 期 总第 91 期健康养殖浅谈核酸保护液的保护效果王丽芳 梅惠敏（海南农垦安健畜牧药械有限公司,海南海口 570110）摘 要：自2018 年我国出现非洲猪瘟疫情后，面对非洲猪瘟的感染威胁，促使实验室检测体系在养猪业迅速发展，受非洲猪瘟的影响也导致猪病诊断从根据临床症状鉴别转向依赖于实验室病原学与血清学检测。针对猪群各类传染病的病原学诊断，实时荧光定量PCR（qPCR）技术成为猪病实验室诊断检测的常用手段。实验室检测结果的准确性也受到很多因素的影响，从样品的采集到实验室检测的过程中，样品的包装及运输环节会受温度、时间、纯净度等因素的影响，从而导致样品中未知病原的DNA 或RNA 病毒的降解。核酸保护液的出现在很大程度上减少了样品运输过程中受到各种因素的影响，从而逐渐被广泛应用，但核酸保护液效果受复杂样本干扰，对不同类型病原的核酸保护作用也不同。关键词：核酸保护液；病原核酸；干扰因素；保护效果 自我国出现非洲猪瘟疫情后，猪病的诊断方式发生了变化，PCR 成了猪场疾病诊断的标准配制。实验室对疾病的诊断能否得出准确的结论，与样品的采集、运输和保护等因素有着密切的关系1。从样品采集到实验室接收这个过程，样品采集会受温度、时间、纯净度等因素影响，容易导致样品中 DNA 或 RNA 病毒的降解。核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称 RNA)和脱氧核糖核酸(简称 DNA)2。在病毒感染的情况下，如果能及时并且准确地鉴别出病毒的存在，则可以采取有效的措施阻止病毒的扩散传播，从而大大减少由此带来的经济损失3。核酸的性能不稳定，容易变性，因此，在研究过程中，通常将核酸置于超低温(-70)下进行长期保存，作者简介：王丽芳（1988），海南海口人，中国农业大学动物医学本科毕业，初级兽医师。现任海南农垦草畜猪业有限公司兽医检测中心实验室主任，主抓猪场兽医体系建设及猪场疫病的监测检测工作。梅惠敏（1997），海南万宁人，海南职业技术学院畜牧兽医专业毕业。现任海南农垦草畜猪业有限公司兽医检测中心实验室主管，主要负责猪场常规疫病的检测工作。然而，该保存方式易对核酸的结构造成影响，且研究过程中进行检测获得的结果不准确。核酸保护液是利用生物化学的方法抑制样本中酶的活性，保持样本中靶标物质稳定性的方法而制成。现在核酸保护液逐渐被广泛应用，但核酸保护液效果受复杂样本干扰，对不同类型病毒的核酸保护作用也不同。故本实验采用荧光定量 PCR 检测方法，对核酸保护液对 DNA 病毒及 RNA 病毒的核酸保护效果，以及复杂样本对核酸保护液效果干扰情况进行评测。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 DNA 病 毒（PRV）、RNA 病 毒（PRRSV、PEDV）、核酸保护液（A、B、C 品牌）1.1.2 实时荧光 PCR1.2 试验方法 以 DNA 病毒（PRV）、RNA 病毒（PRRSV、PEDV）为检测样本，分别采用 3 个品牌（A、B、C）的核酸保护液对病毒进行保护，将试验设置为 5 组，生理盐水+病毒；组织液+病毒；50%核酸保护液+50%生理盐水+病毒；50%核酸保护液+50%组织液+病毒；100%核酸保护液+病毒；畜牧业环境 第3期内文.indd 472023/9/28 10:46:4748 其中 2 组为对照组，利用 qPCR 测定起始 CT值后，放在37恒温箱内静置，分别于实验后第1、3、5、7d 再次进行检测，并记录。2 试验结果和分析2.1 DNA 病毒试验数据 从表 1、图 1 中可以看出，无核酸保护液参与情况下，纯水及组织液中的 DNA 抗原检测值由 CT 29.56 逐渐上升，第 7 d 检测结果为可疑或阴性。而有核酸保护液参与情况下：1 周内 DNA 抗原检测平均值均在 CT 31 以下，离散度最大为 3.96%，保护效果均比无核酸保护液参与的效果好。2.2 RNA 病毒（PED 病毒）试验结果 从表 2，图 2 中可以看出，无核酸保护液参与情况下，纯水中与组织液中的 PED 抗原均随时间增加逐渐被消耗，至第 7 d 检测结果为阴性；有核酸保护液参与情况下，1 周内 50%水稀释的保护液效果与采用保护液原液效果相当，CT 值在 30以内；1 周内 50%组织液稀释的保护液效果较差。2.3 RNA 病毒（PRRS 病毒）试验结果 从表 3、图 3 中可以看出，在无核酸保护液参与情况下，纯水稀释的阳性样品较组织液稀释的检测值CT 值较低，1 周后接近可疑区间。而有核酸保护液参与情况下，针对蓝耳病原的表 1 DNA 病毒试验 7d 数据时间水组织液核酸保护液 A核酸保护液 B核酸保护液 C50%水50%组织液全核保50%水50%组织液全核保50%水50%组织液全核保0d29.8729.5629.8230.429.8530.1129.529.3329.4729.3729.391d31.9531.5329.1129.3329.2729.3229.5129.1529.0828.928.973d32.4135.3729.9530.3828.9728.7329.8629.5329.5229.4429.165d33.9933.4330.8130.6430.0530.4730.2530.530.3531.0130.487d35.39-29.230.1529.729.5530.5830.0829.3331.6630.34平均值32.7232.4729.7830.1829.5729.6429.9429.7229.5530.0829.67离散度6.40%2.30%1.68%1.49%2.29%1.58%1.88%1.62%3.96%2.34%表 2 RNA 病毒（PED 病毒）试验 7d 数据日期水组织液核酸保护液 A核酸保护液 B核酸保护液 C50%水50%组织全核保50%水50%组织全核保50%水50%组织全核保0d23.1429.2323.4829.7623.8222.8227.3522.5922.7628.5722.31d27.8232.4125.3130.7225.7525.0933.0524.2624.1230.4224.863d29.8830.5526.6532.2327.1826.4535.9426.1225.0632.4325.835d32.9931.4727.2437.2926.4826.78-26.1725.9635.1426.687d-28.2734.228.8329.6235.2129.162933.329.93平均值28.4630.9226.1932.8426.4126.1532.8925.6625.3831.9725.92离散度14.52%7.08%9.14%6.98%9.51%9.57%9.24%7.97%10.72%畜牧业环境 第3期内文.indd 482023/9/28 10:46:47492023 年第 3 期 总第 91 期健康养殖参考文献1 樊福好.唾液中核酸样本的长期保护 J.猪业观察，2020,(02):45.2 赵晓莉.一字之差的五组生物学名词辨析 J.新课程学习(上)，2012,(12):48.3 张耀丹.样品保存液对组织样品中 PRRSV 核酸保存的影响 J.猪业科学，2022,39(06):64-66.保存，3 种核酸保护液表现不一，1 号为全液及 3 号50%水稀释效果较好，2 号全液效果与纯水稀释效果相当。3 讨论 由于每次 qPCR 的阈值线不固定，CT 值也会发生变化，本次试验在数据分析时，固定每次 PCR 阳性对照 CT 值，样本的 CT 值相对能更直观地体现出核酸保护液的效果。对 DNA 类病原检测，核酸保护液可以起很好的保护作用，稀释后效果与原液效果相当，可以摸索最佳的使用浓度适当降低检测成本。对 RNA 类病原检测，需要根据不同病原选择不同的核酸保护液及其对应的稀释浓度。采用组织液作为稀释介质时，对核酸保护液的挑战较大，表现不佳。综上可以看出，在针对不同类型核酸病毒样本时，核酸保护液对核酸病毒的保护差异较大；不同品牌核酸保护液间质量参齐不齐；核酸保护液保护效果差会导致核酸检测假阴性，建议开展核酸检测时对使用的核酸保护液进行质量控制。表 3 RNA 病毒（PRRS 病毒）试验 7d 数据日期水组织液核酸保护液 A核酸保护液 B核酸保护液 C50%水50%组织全核保50%水50%组织全核保50%水50%组织全核保0d23.9425.7623.5926.5923.4123.3828.4923.4123.2728.3523.321d24.8527.4433.29-23.9533.84-25.3224.61-32.553d25.4729.9134.9337.723.2134.82-26.6523.79-34.265d32.1829.3935.63-26.4436.76-33.1126.16-37.657d32.0432.3736.86-24.2333.97-32.5622.737.3633.88平均值27.728.9732.8632.1524.2532.5528.4928.2124.1132.8632.33离散度14.68%8.67%16.25%5.33%16.16%15.53%5.58%16.63%畜牧业环境 第3期内文.indd 492023/9/28 10:46:47