葡萄籽抗氧化活性成分研究.pdf

第 51 卷第 9 期2023 年 5 月广 州 化 工Guangzhou Chemical IndustryVol.51 No.9May.2023葡萄籽抗氧化活性成分研究陈徐回1,熊财智1,梅 瀚1,马建龙2,曹金凤1,刘世巍1,丁建海1(1 宁夏师范学院化学化工学院,宁夏 固原 756000;2 宁夏大学化学化工学院,宁夏 银川 750021)摘 要:为了研究葡萄籽中的抗氧化活性成分,本文用 DPPH、ABTS+、OH 自由基清除测定葡萄籽乙醇提取物的抗氧化活性,利用各种色谱方法对葡萄籽乙醇提取物进行分离纯化,并对得到的单体化合物测定抗氧化活性。从葡萄籽的乙醇提取物中分离得到 9 个化合物,分别鉴定为(-)-epicatechin(1)、(+)-epicatechin(2)、n-hexadecane(3)、linoleic acid(4)、-sitosterol(5)、-nigerose(6)、dibutyl phthalate(7)、diisobutyl phthalate(8)、isovanillic acid(9),化合物 6 为首次从葡萄籽中分离得到。活性测试表明,化合物 1 2 具有显著的抗氧化作用。关键词:葡萄籽;化学成分;抗氧化活性中图分类号:R284.1 文献标志码:A文章编号:1001-9677(2023)09-0077-04 基金项目:宁夏重点研发计划项目(2019BFH02005、2019BDE03009);宁夏自然科学基金项目(2021AAC03244、2022AAC02049、2022AAC03297);宁夏师范学院 2020 年一流本科课程建设培育项目(分析化学)(NXSFYLKC202010)。第一作者:陈徐回(1996-),男,硕士,研究方向为天然产物化学。通讯作者:刘世巍(1971-),男,教授,研究方向为天然产物分析。丁建海(1977-),男,教授,研究方向为天然产物化学。Antioxidant Constituents of Grape SeedsCHEN Xu-hui1,XIONG Cai-zhi1,MEI Han1,MA Jian-long2,CAO Jin-feng1,LIU Shi-wei1,DING Jian-hai1(1 College of Chemistry and Chemical Engineering,Ningxia Normal University,Ningxia Guyuan 756000;2 College of Chemistry and Chemical Engineering,Ningxia University,Ningxia Yinchuan 750021,China)Abstract:To determine the antioxidant activities of ethanol extracts from grape seeds,the antioxidant activity ofethanol extracts from grape seeds was determined by DPPH,ABTS+and OH radical scavenging.The ethanol extracts wereisolated and purified by various chromatographic methods,and the antioxidant activity of the monomer compounds wasdetermined.Nine compounds were isolated from the ethanolic extract of grape seeds,and identified as(-)-epicatechin(1),(+)-epicatechin(2),n-hexadecane(3),linoleic acid(4),-sitosterol(5),-nigerose(6),dibutylphthalate(7),diisobutyl phthalate(8),isovanillic acid(9).Compound 6 was isolated from grape seeds for the firsttime.The activity test showed that compounds 1 and 2 had significant antioxidant effects.Key words:grape seeds;chemical constituents;antioxidant activity自古以来,葡萄就被用于酿酒,而葡萄籽是酿酒过程的工业副产品,过去葡萄籽多用作动物饲料1,近年来的研究表明,葡萄籽提取物有抗癌2和抗糖尿病3作用,引起学者们的广泛关注。葡萄籽的化学成分和活性已有报道,原花青素是葡萄籽提取物中的主要成分,Silva 等4从葡萄籽中分离得到23 个原花青素类化合物,其中化合物 procyanidin B2-3,3-di-O-gallate 可以诱导人前列腺癌细胞凋亡5,Fuleki 等6从葡萄籽中分离得到 29 个原花青素类化合物,其中化合物 procyanidinB2-3-O-gallate 可以抑制 T 细胞中细胞因子的产生7。为了葡萄籽资源的有效利用,我们采用 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2-联氮-双(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS+)自由基、羟基自由基清除测定葡萄籽的乙醇提取物的抗氧化活性,利用各种色谱方法对葡萄籽乙醇提取物进行分离纯化,通过理化常数和波谱数据分析鉴定所得化合物的结构并对得到的单体化合物测定抗氧化活性,为后续葡萄籽的活性成分的开发与利用奠定基础。1 实 验1.1 仪器与材料仪器:Bruker DRX-400 MHz 超导核磁共振仪测定(TMS 为内标),Bruker 公司;AutoSpec Premier P776 三扇型双聚焦磁质谱仪,美国 Waters 公司;ZF-20D 暗箱式紫外分析仪,上海光豪分析仪器有限公司;UV-1750 型紫外分光光度仪,日本岛津公司;FA2204B 电子天平,上海声源超声波仪器设备有限公司。材料:Sephadex LH-20,瑞典 Amersham Biosciences 公司;柱层析硅胶和硅胶薄层板 GF254TLC,青岛海洋化工厂生产;反相硅胶,德国 Merck 公司产品;D101 大孔吸附树脂,北京索莱宝科技有限公司;香草醛、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼78 广 州 化 工2023 年 5 月(DPPH)、2,2-联氮-双(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、过硫酸钾、H2O2及抗坏血酸(Vc),上海麦克林生化科技有限公司;乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷、石油醚、甲醇均为分析纯。1.2 葡萄籽抗氧化活性成分的提取和分离葡萄籽(13.5 kg)用 60%的乙醇浸提,减压浓缩,得到提取物浸膏。将浸膏分散于水中,加入乙酸乙酯,震荡以后静置一段时间分层,得到乙酸乙酯萃取相,萃取剩余水相,还有不溶性絮状沉淀物三相,用甲醇提取不溶性絮状沉淀物,得到甲醇相。提取的乙酸乙酯相经过大孔树脂柱色谱分离(梯度洗脱,依次为 0,30%,50%,95%乙醇-水),得到四个片段。片段2(乙醇/水,3 7)经 Sephadex LH-20 凝胶柱(甲醇)得到化合物 1(2.3 mg),化合物 2(1 mg)。甲醇相经过正相硅胶柱层析得到片段 a f,片段 c(200 300 目,二氯甲烷/甲醇,3 1)经过反复硅胶柱层析得到化合物 3(20.9 mg),反相硅胶柱层析(甲醇/水,10 0)得到化合物 4(3.9 mg),化合物 5(10.7 mg)。片段 f(200 300 目,二氯甲烷/甲醇,0 1),Sephadex LH-20凝胶柱(甲醇)得到化合物 6(29.2 mg),片段 a(二氯甲烷/甲醇,1 0)经过反复硅胶和 Sephadex LH-20 凝胶柱层析(二氯甲烷/甲醇,1 1)分离得到化合物 7 和 8 的混合物(10.1 mg),片段 b(二氯甲烷/甲醇,90 1)经过正相硅胶柱层析(石油醚/乙酸乙酯,4 1)洗脱得到片段 b-1,经过反复硅胶分离得到化合物 9(14.5 mg)。1.3 DPPH 自由基清除率的测定参照康超等8的方法,并做适当改进。称量 DPPH 0.0099 g,定容稀释至 50 mL,避光保存 30 min。将 1 mg/mL 的待测样品稀释至0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,将 DPPH 与待测液3 1 避光混合于5 个不同比色管中,反应静置30 min,在 517 nm记录吸光度 A1;将无水乙醇代替 DPPH,重复以上操作,记录吸光度 A2;空白组用 DPPH 与蒸馏水按照上述方法做对照,记录吸光度 A0;以 Vc 代替样品做为阳性对照,测定自由基清除率公式如下:清除率=1-A1-A2A0()100%(1)1.4 ABTS+自由基清除率的测定参照杨阳等9的方法,并做适当改进。称取过硫酸钾0.331 g,ABTS 0.192 g 分别用蒸馏水稀释到 50 mL,将两者各取 5 mL,1 1 混合配制 ABTS 工作液避光放置 12 h。之后用蒸馏水稀释工作液到 40 1 左右使得吸光度在 0.6 0.9 之间就可以正常使用(吸光度最大吸收波长大概在 734 nm)。将1 mg/mL的待测样品稀释成 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的溶液。根据实际多次实验得出当样品与 ABTS 工作液的比例为 1 10效果比较好,所以我们选择在试管中加入样品 0.5 mL,ABTS工作液 5 mL 充分反应 6 min,并在最大吸收波长下测定吸光度,将 Vc 按同样方式操作与样品进行对照,测定自由基清除率公式如下:清除率=1-A1-A2A0()100%(2)式中:A1为 ABTS 工作液与待测样品的吸光度,A2为无水乙醇与待测样品的吸光度,A0为 ABTS 工作液与蒸馏水的吸光度。1.5 羟基自由基清除率的测定参照和英等10的方法,并做适当改进。将 1 mg/mL 的待测样品稀释至 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL,分别取 1 mL到试管中,每个管中加入 1 mL 2.5 mmol/L 用无水乙醇稀释的水杨酸以及 5 mmol/L 用蒸馏水稀释的硫酸亚铁溶液,进行充分的反应后,加入 0.06%H2O2溶液 1 mL,稍微震荡试管使得反应充分,之后将 5 个试管放入烧杯中,在烧杯中加水,将其一并放入40 左右的水浴锅中加热 20 30 min,之后在 510 nm的波长下对吸光度进行测定。阳性对照用 Vc 代替样品重复上述操作。测定自由基清除率公式如下:清除率=1-A1-A2A0()100%(3)式中,A1为上述提到方法所测吸光度,A2为把过氧化氢换成蒸馏水反应的吸光度,A0为将待测样换成蒸馏水的吸光度。2 结果与分析2.1 化合物结构鉴定化合物 1:红色无定型粉末,紫外灯 365 nm,254 nm 下不显色,香草醛-浓硫酸试剂显粉色,HR-ESI-MS m/z 289.0672M-H-,分子式 C15H14O6。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz):6.89(1H,d,J=1.3 Hz,H-2),6.66(s,1H,H-5),6.66(1H,s,H-6),5.89(1H,d,J=2.3 Hz,H-6),5.72(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),4.74(1H,s,H-2),4.01(1H,s,H-3),2.72-2.65(1H,m,H-4a),2.46(1H,d,J=3.4 Hz,H-4b);13C-NMR(DMSO-d6,100 MHz):156.6(C-5),156.3(C-7),155.8(C-9),144.5(C-3),144.5(C-4),130.7(C-1),118.0(C-6),114.9(C-2),114.8(C-5),98.6(C-10),95.1(C-6),94.2(C-8),78.1(C-2),65.0(C-3),28.2(C-4)。以上数据与文献11对照基本一致,故鉴定化合物 1 为(-)-epicatechin。化合物 2:红色无定型粉末,紫外灯 365 nm,254 nm 下不显色,香草醛-浓硫酸试剂显粉色,HR-ESI-MS m/z 289.5700M-H-,分子式 C15H14O6。1H-NMR(DMSO-d6,400 MHz):6.71(1H,d,J=2.0 Hz,H-2),6.68(1H,d,J=8.1 Hz,H-5),6.59(1H,dd,J=8.2,1.9 Hz,H-6),5.88(1H,d,J=2.3 Hz,H-6),5.68(1H,d,J=2.3 Hz,H-8),4.47(1H,d,J=7.5 Hz,H-2),3.81(2H,m,H-3),2.65(1H,m,H-4a),2.34(1H,m,H-4b)。以上数据与文献12对照基本一致,故鉴定化合物 2 为(+)-epicatechin。化合物3:无色油状,紫外灯254 nm 下呈暗色斑点,365 nm下不显色,香草醛-浓硫酸试剂不显色。HR-ESI-MS m/z225.0235M-H-,分子式 C16H34。1H-NMR(CDCl3,400 MHz):1.28(28H,brs,CH214),0.94 0.81(3H,m,CH3)。1.28 为 相近的 14 个亚甲基质子的强耦合信号。13C-NMR(CDCl3,100 MHz):32.1(C-3,C-14),29.9(C-5 12),29.6(C-4,C-13),22.9(C-2,C-15),14.3(C-1,C-16)。其中 29.9 是碳链中间 12 个 值相近的碳共振信号。以上数据与文献13对照基本一致,故鉴定化合物 3 为 n-hexadecane。化合物 4:无色晶体,紫外灯 365 nm,254 nm 下不显色,香草醛-浓硫酸试剂显灰色。HR-ESI-MS m/z 179.2320M-H-,分子式 C18H32O2。1H-NMR(CD3OD,400 MHz):5.35(4H,m,H-9,10,12,13),2.78(2H,t,J=6.2 Hz,H-11),2.28(2H,t,J=7.4 Hz,H-2),2.07(4H,m,H-8,14),1.61(2H,m,H-3),1.34(14H,m,H-4,5,6,7,15,16,17),0.91(3H,m,H-18);13C-NMR(CD3OD,100 MHz):178.0(C-1),131.1(C-13),131.1(C-9),129.3(C-10),129.3(C-12),35.3(C-2),32.9(C-16),30.9(C-7),30.7第 51 卷第 9 期陈徐回,等:葡萄籽抗氧化活性成分研究79 (C-15),30.5(C-4),30.4(C-5),30.4(C-6),28.4(C-8),28.4(C-14),26.7(C-11),26.3(C-3),23.8(C-17),14.6(C-18)。以上数据与文献14对照基本一致,故鉴定化合物 4为 linoleic acid。化合物 5:黄色无定型粉末,紫外灯 365 nm,254 nm 下不显色,香草醛-浓硫酸试剂显灰色。HR-ESI-MS m/z 413.3712M-H-,分子式 C29H50O。1H-NMR(CDCl3,400 MHz):5.36(1H,d,J=5.4 Hz),3.53(1H,m);13C-NMR(CDCl3,100 MHz):140.9(C-5),121.9(C-6),72.0(C-3),57.0(C-14),56.2(C-17),50.3(C-9),46.0(C-24),42.5(C-13),42.5(C-4),40.0(C-12),37.4(C-1),36.7(C-10),36.3(C-20),34.1(C-22),32.1(C-7),31.8(C-8),29.9(C-2),29.3(C-25),28.4(C-16),26.3(C-23),24.5(C-15),23.3(C-28),21.3(C-11),20.0(C-26),19.6(C-19),19.2(C-27),19.0(C-21),12.2(C-29),12.0(C-18)。以上数据与文献15对照基本一致,故鉴定化合物5 为-sitosterol。化合物 6:红色油状,紫外灯 365 nm,254 nm 下不显色,香 草 醛-浓 硫 酸 试 剂 显 灰 色。HR-ESI-MS m/z341.2310M-H-,分子式 C12H22O11。1H-NMR(CD3OD,400 MHz):5.12(1H,d,J=3.6 Hz,H-1),4.49(1H,d,J=7.8 Hz,H-1),3.88 3.27(10H,m,H-2 6,2 6);13C-NMR(CD3OD,100 MHz):98.1(C-1),93.9(C-1),78.0(C-3),77.9(C-3),76.2(C-5),74.8(C-2),73.8(C-5),72.9(C-4),71.8(C-2),71.7(C-4),62.8(C-6),62.7(C-6)。以上数据与文献16对照基本一致,故鉴定化合物 6 为-nigerose。化合物 7:无色油状物,紫外灯下 365 nm、254 nm 不显色,香草醛-浓硫酸试剂显灰蓝色。1H-NMR(CD3OD,400 MHz):7.68(2H,dd,J=5.7,3.3 Hz,H-3 和 H-6),7.57(2H,dd,J=5.7,3.3 Hz,H-4 和 H-5),4.25(4H,t,J=6.6 Hz,H-2和 H-2),1.68(4H,m,H-3和 H-3),1.42(4H,m,H-4和 H-4),0.94(6H,t,J=7.4 Hz,H-5和 H-5);13C-NMR(CD3OD,100 MHz):166.6(C-1和 C-1),132.6(C-1 和 C-2),131.4(C-4 和 C-5),130.1(C-3 和 C-6),66.9(C-2和 C-2),31.9(C-3和 C-3),20.5(C-4和C-4),14.2(C-5和 C-5)。以上数据与文献17对照基本一致,故鉴定化合物 7 为 dibutyl phthalate。化合物 8:无色油状物,紫外灯下 365 nm、254 nm 不显色,香草醛-浓硫酸试剂显灰蓝色。1H-NMR(CDCl3,400 MHz):7.72(2H,m,H-3 和 H-6),7.53(2H,dd,J=5.7,3.3 Hz,H-4 和 H-5),4.27(4H,m,H-2和 H-2),2.30(2H,dd,J=14.6,7.2 Hz,H-3和 H-3),0.94(12H,m,H-4,H-4,H-5 和 H-5);13C-NMR(CDCl3,100 MHz):168.0(C-1和 C-1),132.5(C-1 和 C-2),131.1(C-4 和 C-5),129.0(C-3 和 C-6),68.4(C-2和 C-2),28.6(C-3和C-3),19.4(C-4,C-4,C-5 和 C-5)。以上数据与文献18对照基本一致,故鉴定化合物 8 为 diisobutyl phthalate。化合物 9:白色粉末,紫外灯下 365、254 nm 不显色,碘蒸汽显黄色。1H-NMR(CDCl3,400 MHz):7.72(1H,dd,J=8.3,1.9 Hz,H-6),7.59(1H,d,J=1.9 Hz,H-2),6.98(1H,d,J=8.3 Hz,H-5),3.98(3H,s,OCH3-4);13C-NMR(CDCl3,100 MHz):169.0(-COOH),151.1(C-3),147.2(C-4),123.8(C-6),122.1(C-1),114.4(C-5),112.4(C-2),55.0(4-OCH3)。以上数据与文献19对照基本一致,故鉴定化合物 9 为 isovanillic acid。化合物 1 9 的结构式如图 1 所示。图 1 化合物 1 9 的结构式Fig.1 Structural formulas of compounds 1 92.2 葡萄籽提取物和化合物 1 6,9 的抗氧化活性经 DPPH,ABTS+,羟基自由基的测定,葡萄籽乙醇提取物发现具有显著的抗氧化活性,采用多种色谱方法对乙醇提取物进行分离纯化,从葡萄籽中分离得到 9 个化合物,对化合物1 6,9 和阳性对照 Vc 进行了 DPPH、ABTS+和 OH 自由基抗氧化活性测试。实验结果(表 1)显示,原花青素类化合物 1,2对 DPPH、ABTS+和 OH 自由基都有很强的清除自由基效果,化合物 4 和 5 对 OH 自由基有一定清除自由基效果,优于阳性对照。表 1 化合物对 DPPH、ABTS+、OH 自由基的抗氧化活性Table 1 Antioxidant activity of compounds against DPPH,ABTS+and OH radicals化合物IC50/(mg/mL)DPPHABTS+OHVc0.0160.0580.0170.8850.18310.0540.0250.0290.0050.0473.9720.2420.1281.6673505050424.867500.727550500.164636.241505095.0821.55250503 结 论本文中初步开展的葡萄籽的抗氧化活性成分研究结果显示,葡萄籽的乙醇提取物具有显著的抗氧化活性,对葡萄籽乙醇提取物进行分离纯化,一共获得 9 个化合物,化合物 6 首次从葡萄籽中分离出来。抗氧化活性表明,化合物 1,2 对DPPH、ABTS+和 OH 自由基都有很强的清除效果,化合物 4 和5 对 OH 自由基有一定清除效果,优于阳性对照。化合物 1 和 2均属于黄烷醇类,黄烷醇类化合物具有很多酚羟基,基于自由基理论20,酚羟基具有很强的还原性,故其抗氧化活性很强。本研究丰富了葡萄籽的化学成分,为后续葡萄籽的活性成分的80 广 州 化 工2023 年 5 月开发与利用奠定基础。参考文献1 堵年生,屈兰,热娜卡斯木,等.新疆葡萄籽化学成分的研究J.新疆医科大学学报,2003,26(6):577-578,580.2 Gao Y,Tollefsbol T O.Combinational proanthocyanidins and resveratrolsynergistically inhibit human breast cancer cells and impact epigenetic-mediating machineryJ.International Journal of Molecular Sciences,2018,19(8):2204.3Tomaru M,Takano H,Osakabe N,et al.Dietary supplementation withcacao liquor proanthocyanidins prevents elevation of blood glucose levelsin diabetic obese miceJ.Nutrition,2007,23(4):351-355.4 Da Silva J M R,Rigaud J,Cheynier V,et al.Procyanidin dimers 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