葡萄糖酸钙注射液中细菌内毒素的定量检测.pdf

食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期 341道的五环三萜类成分较多，且得量较大，包括熊果酸、2-羟基乌苏酸、2-羟基齐墩果酸、齐墩果酸、桦木酸、3,24-二羟基-17,21-半缩醛基-12(13)齐墩果烯、2,3-二羟基5(6),2(13)-二烯熊果酸9-12等。因此，五环三萜类为野拔子中主要化学成分。参考文献 1 刘宪英,祁涛.中国彝医M.北京:科学出版社,1994:9,208-224.2（明）佚名彝医著,施文贵翻译整理,尹睿主编.齐苏书M.昆明:云南民族出版社,2010:102,115.3 云南省彝族医药研究所编,杨本雷主编.中国彝族药学M.昆明:云南民族出版社,2004:1-4,46-48.4 周杨晶,陈国强.彝药野坝子的化学成分、药理作用及综合应用研究进展J.中医药导报,2021,27(8):53-55.5 黄艳萍,宋家玲,吴继平,等.凉粉草化学成分分离鉴定J.中国实验方剂学杂志,2018,24(6):77-81.6 Liu J H,Steigel A,Reininger E,et al.Two new prenylated 3-benzoxepin derivatives as cyclooxygenase inhibitors from Perilla frutescens var.acutaJ.J Nat Prod,2000,63:403-405.7 李汝鑫,程锦堂,焦梦娇,等.钩藤叶化学成分研究J.中草药,2017,48(8):1499-1505.8 于明,李铣,张丽,等.黑果腺肋花楸果实的化学成分J.中草药,2010,41(4):544-546.9 刘莹.细皱香薷叶的化学成分研究J.中草药,2009,40(9):1356-1359.10 朱向东.野坝子化学成分研究D.昆明:西南林业大学,2003.11 来国防,朱向东,罗士德,等.野拔子化学成分研究J.中草药,2008,39(5):661-664.12 黄彬弟.细皱香薷化学成分的研究D.兰州:西北师范大学,2004.葡萄糖酸钙注射液中细菌内毒素的定量检测朱文娟，李锦妹，翁 嘉，陈文静，林凤屏，李红静，黄永德（惠州市食品药品检验所，广东 惠州 516003）摘 要：目的 建立葡萄糖酸钙注射液中细菌内毒素的定量检测方法，以便准确实时评估注射液中内毒素的含量变化。方法 采用微量动态显色法，选取2个不同厂家共6批样品，通过标准曲线可靠性试验、预干扰和干扰实验，确定样品不被干扰的稀释倍数，并将检测结果与凝胶法进行比较。结果 标准曲线可靠性回归方程为 lgT=2.8974-0.29133lgC，相关系数r=1.0000，本品稀释至50倍时无干扰，回收率值在60%70%之间；微量动态显色法与凝胶法检查结果一致。结论 微量动态显色法相较于凝胶法，操作更方便快捷，可实现定量检测，结果灵敏度更高。关键词：葡萄糖酸钙注射液；微量动态显色法；细菌内毒素；定量检测；凝胶法中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）04-0341-05DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.04.011Quantitative Determination of Bacterial Endotoxin in Calcium Gluconate Injection ZHU Wen-juan,LI Jin-mei,WENG Jia,CHEN Wen-jing,LIN Feng-ping,LI Hong-jing,HUANG Yong-de(Huizhou Institute for Food and Drug Control,Huizhou 516003,China)Abstract:Objective To establish a quantitative detection method for bacterial endotoxin in Calcium Gluconate Injection,and to evaluate the endotoxin content in the injection accurately and in real time.Methods Micro-kinetic chromogenic method was adopted,and six batches of samples from two different manufacturers were selected for detection.Through the standard curve reliability test,pre-interference and interference experiments,the dilution ratio of the samples without interference was determined,and the test results were compared with those of the gel clot method.Results The regression 收稿日期：2022-10-24作者简介：朱文娟，主管药师，主要从事食品、药品、化妆品微生物检测及相关研究，E-mail: 342 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期equation of the standard curve was lgT=2.8974-0.29133lgC,the correlation coefficient r was 1.0000.No interference when the sample was diluted for 50 times;the recoveries were 60%-70%.The results of micro-dynamic chromogenic method and gel clot method were consistent.Conclusion Compared with the gel clot method,the micro-kinetic chromogenic method is more convenient and quick to operate,has higher sensitivity,and can achieve quantitative detection.Key Words:Calcium Gluconate Injection;micro-dynamic chromogenic method;bacterial endotoxin;quantitative detection;gel clot method葡萄糖酸钙注射液临床主要用于治疗人畜钙缺乏症及过敏性疾病，也可用于镁、氟离子引起的中枢抑制的中毒解救1-2。微量动态显色法（micro-kinetic chromogenic method）是一种新型内毒素定量检测方法，具有灵敏度高、检测范围宽和鲎试剂用量少等优点，近年来受到越来越多的关注3。该方法使用酶标仪，通过检测鲎试剂与内毒素反应产生的凝固酶使特定底物释放出的对硝基苯胺（呈色团）的数量，依据呈色团的吸光度和内毒素浓度间对应关系，计算样品中的内毒素含量4-5。微量动态显色法不需要凝固蛋白原形成凝胶，直接通过仪器读取结果，实现精准定量；实验操作、数据记录实现了从手工到自动化，保障了实验过程的完整性和结果数据的可溯源性；96孔反应板可同时检测多个浓度样品，省时省力；此外，微量动态显色法灵敏度比凝胶法高，适用于内毒素限值低的样品的检测，能较好地消除实验中的干扰6。本研究采用微量动态显色法对葡萄糖酸钙注射液进行内毒素定量检测，同时与传统的凝胶法进行比较，建立该品的细菌内毒素定量检测方法，实现在线实时记录生产各环节样品内毒素含量的动态变化，有助于及时发现和分析潜在的污染来源，实现无菌药品安全生产的全过程控制，更好地保障临床安全用药。1 仪器与试药1.1 仪器Multiskan ET内毒素检测仪（美国赛默飞）；BioProbe生物探针5.2系统（湛江安度斯）；MS3漩涡混匀器（美国IKA）；TAL-96G试管恒温仪（湛江安度斯）。1.2 试药葡萄糖酸钙注射液6批（规格为10 ml:1 g5支，其中焦作市民康药业有限公司3批，批号：21060403，21060502，22061903；常州兰陵制药有限公司3批，批号：12104090，12104210，12104130）；细菌内毒素工作标准品（CSE，中国食品药品检定研究院，批号：150601-201987，规格：80 EU/ml；湛江安度斯生物有限公司，批号：2201260，浓度范围为0.022.0 EU/ml）；动态显色法鲎试剂（批号：2202230，规格：0.35 ml，定量范围：100.01 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；凝胶法鲎试剂（TAL，批号：2204190，规格：0.65 ml/支，灵敏度：0.25 EU/ml，湛江安度斯生物有限公司）；细菌内毒素检查用水（BET水，批号：2002260，湛江安度斯生物有限公司）。2 方法与结果2.1 细菌内毒素的限值 2020年版中国药典第二部品种项下规定：每1 mg葡萄糖酸钙中含内毒素的量应小于0.17 EU7。2.2 微量鲎试剂动态显色法标准曲线可靠性试验及凝胶法鲎试剂灵敏度复核按使用说明，取3支湛江安度斯细菌内毒素工作标准品，浓度分别为0.02，0.2，2.0 EU/ml，用BET水复溶，并在漩涡混匀器上充分混匀30 s，同时用BET水作为阴性对照管。吸取上述系列浓度细菌内毒素标准溶液各25 l至96孔反应板中；取动态显色法鲎试剂，加BET水0.35 ml，充分复溶后吸取25 l，分别加入标准溶液进行反应，每个浓度平行3管。预设吸收度（A）值为0.1，反应时间T为3600 s，温度37，检测波长405 nm，以T的对数为横坐标，浓度（C）的对数为纵坐标，得出标准曲线和相关系数（r）值。回归方程为 lgT=2.8974-0.29133lgC，相关系数r=1.00000.980，变异系数（CV）值均10%，阴性对照反应时间3600 s，标准曲线可靠性试验各数据符合要求，结果见表1。食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期 343凝胶法鲎试剂按2020年版中国药典第四部通则1143要求进行灵敏度复核8，灵敏度为，符合规定。2.3 两种检测法最大有效稀释倍数（MVD）的确定根据MVD=cL/，c为样品溶液浓度（100 mg/ml），L为葡萄糖酸钙注射液细菌内毒素限值（0.17 EU/mg）；微量动态显色法中为0.02 EU/ml，凝胶法中为0.25 EU/ml，计算出MVD在动态显色法中为850，在凝胶法中为68。2.4 预干扰试验 分别选取2个厂家各1批样品，用BET水依次稀释至25，50，100，200倍（浓度分别为4，2，1，0.5 mg/ml），作为供试品溶液。按使用说明，吸取不同稀释倍数的供试品溶液各700 l，加入浓度为0.2 EU/ml的CSE干粉中，涡漩混匀30 s使其充分复溶，作为供试品阳性对照溶液。取上述制备的各溶液和标准曲线可靠性试验中的0.02，0.2，2.0 EU/ml系列浓度CSE溶液各25 l，加入96孔反应板，每个浓度平行2份；取BET水作为阴性对照。最后每孔加入25 l 动态显色法鲎试剂，用内毒素检测仪测定。不同的稀释倍数，样品回收率均在50%200%范围内，见表2。在稀释25倍时，不同样品的回收率分别为64.46%和56.13%，由于56.13%较低且接近最低限值，故选择50倍稀释的样品进行正式干扰试验。表2 预干扰试验结果（n=2）供试品生产厂家（批号）稀释倍数加入量/EUml-1回收率/%平均反应时间/sCV/%实测值/EUml-1焦作民康（21060403）2564.4636000.000.004 600.21310.51.240.133 525068.4336000.000.004 600.21288.00.550.141 4610070.0136000.000.004 600.21279.50.060.144 6120079.8436000.000.004 600.21231.50.630.164 27常州兰陵（12104090）2556.1336000.000.004 600.21364.01.350.116 855060.1136000.000.004 600.21335.00.950.125 5310080.9636000.000.004 600.21226.50.980.166 5120086.1336000.000.004 600.21204.50.880.176 862.5 正式干扰试验为确证葡萄糖酸钙注射液50倍稀释的有效性，进行2个不同厂家各3个批号样品的正式干扰试验。样品稀释50倍后，按预干扰试验的方法进行测定，计算样品内毒素加标回收率和本底内毒素含量。实验的回收率范围在63.49%69.55%，符合药典要求，结果见表3。结果显示，样品在50倍稀释下不存在抑制或增强的干扰作用；各试验组平行管的CV值均1.5%；供试品的平均反应时间均3600 s，实测值均0.00391 EU/ml。标准曲线的最小浓度为0.02 EU/ml，稀释倍数为50，因此6批葡萄糖酸钙注射原液内毒素结果均1.000 EU/ml，结果最后换算为0.01 EU/mg，符合药典规定的0.17 EU/mg。在本试验条件下，葡萄糖酸钙注射液的最大无干扰稀释倍数为50倍。如果采用的鲎试剂灵敏度不同，需按本试验方法重新确认稀释倍数。表 1 标准曲线的可靠性试验结果（n=3）加入量/EUml-1反应时间/s实测值/EUml-1CV/%阴性对照3600 0.005470.000.022467.00.020030.880.21263.00.199431.112.0645.02.002840.31344 食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期2.6 凝胶法检测用BET水将样品依次稀释至34，68倍，作为2倍供试品溶液和供试品溶液。用BET水将CSE标准品（80 EU/ml）稀释至1.0，0.5 EU/ml，作为4，2阳性对照溶液。取等量2倍供试品溶液和4阳性对照溶液充分混匀，作为供试品阳性对照溶液（2）。吸取0.05 ml鲎试剂溶液至各小试管，分别加入0.05 ml供试品溶液、供试品阳性对照溶液（2）、阳性对照溶液（2）、阴性对照溶液，每种平行两管，轻摇混匀，放入试管恒温仪中，37 孵育60 min后取出，观察凝胶成像结果。结果均符合规定，详见表4。表4 凝胶法检测结果厂家供试品批号阴性对照阳性对照供试品阳性供试品结论焦作民康21060403-+-符合规定21060502+-符合规定22061903+-符合规定常州兰陵12104090+-符合规定12104210+-符合规定12104130+-符合规定3 讨论葡萄糖酸钙注射液细菌内毒素检测结果，微量动态显色法与凝胶法一致，均符合中国药典2020年版品种项下规定7。相较凝胶法，微量动态显色法有以下优势：一是鲎试剂的使用量仅为凝胶法的1/4，可大大减少对国家二级保护动物鲎资源的需求；二是微量动态显色法的检测限宽，有利于一次性对各种潜在干扰浓度进行筛选，大幅减少鲎试剂的用量，实现大范围快速筛查；三是可实现实时定量检测，灵敏度高9，检测结果可以精确的数值表示，生产质控人员可了解产品中内毒素含量的变化趋势，有利于注射液生产全过程中的关键风险控制点的安全监控10-13；四是检测过程和数据处理皆由仪器自动化控制，可实时观察和监控动态反应，避免主观判断影响结果，实现数据的可溯源。除此之外，基于显色基质颜色的变化速率来定量检测内毒素的微量动态显色法，不受凝胶形成和浊度测定的的干扰因素影响14-15，同时具备动态浊度法和终点法的优点。葡萄糖酸钙注射液的临床用途和适用人群广泛，内毒素限值较低，更应严控质量，降低风险。本实验建立的微量动态显色法，实现了过程的可控和结果的精确定量，操作简便，可用于大批量检测，能更好地保障临床用药和药品的安全生产。参考文献1 艾婕,顾霄.葡萄糖酸钙注射液有关物质测定与高温降解杂质结构鉴定J.中国现代应用药学,2022,39(15):2001-2005.2 严宏凤,陈圆,于生兰.葡萄糖酸钙注射液的细菌内毒素检查J.中国农学通报,2009,25(24):24-27.3 李树馀,梁进.微量动态显色法定量检测3种大输液的细菌内毒素J.中国药师,2014,17(6):1052-1054.4 孔雯雯,张明森,林秀菁,等.动态显色法检测注射用重组人表3 正式干扰试验结果（n=2）供试品生产厂家（批号）稀释倍数加入量/EUml-1回收率/%平均反应时间/sCV/%实测值/EUml-1阴性对照36000.000.00391焦作民康（21060403）5063.4936000.000.003910.21346.00.840.130 89焦作民康（21060502）69.5536000.000.003910.21313.01.510.143 01焦作民康（22061903）65.4436000.000.003910.21335.00.950.134 78常州兰陵（12104090）5067.8336000.000.003910.21322.00.430.139 57常州兰陵（12104210）66.1636000.000.003910.21331.00.320.136 23常州兰陵（12104130）69.2636000.000.003910.21314.50.050.142 43食品与药品 Food and Drug 2023年第25卷第4期 345粒细胞巨噬细胞刺激因子中内毒素的含量J.中国当代医药,2014,21(7):12.5 朱昱,郭姣梅,张军霞,等.定量检测茵栀黄注射液细菌内毒素方法的建立及应用J.中国卫生检验杂志,2019,29(5):525.6 张虞婷,丁苏苏,李倚云.细菌内毒素的研究进展及其检查法的应用J.天津药学,2015,27(5):66.7 国家药典委员会.中华人民共和国药典.二部M.北京:中国医药科技出版社,2020:1520-1521.8 国家药典委员会.中华人民共和国药典.四部M.北京:中国医药科技出版社,2020:178-181.9 杨海燕,周继春,张军霞,等.微量动态显色法检测奥拉西坦注射液中细菌内毒素含量J.中国药事,2020,34(5):596-601.10 杨海燕,辛琰琰,周继春,等.冠心宁注射液中细菌内毒素含量的微量动态显色法定量检测研究J.中医药导报,2020,26(12):40-43.11 刘骅,王花花,王珺,等.微量鲎试剂动态显色法定量检测重组新型冠状病毒疫苗（CHO 细胞）细菌内毒素的研究J.中国药理学通报,2022,38(7):1110-1113.12 裴宇盛,陈晨,耿颖,等.微量动态显色法与动态显色法的等效性评价J.中国药理学通报,2022,38(7):1107-1109.13 Tom M,Ryan P,Naira S.Saving the horseshoe crab:A synthetic alternative to horseshoe crab blood for endotoxin detectionJ.PLoS Biol,2018,10(12):1-10.14 马莉,张凇,王安航,等.细菌内毒素定量检测方法的常见问题剖析J.中国医院药学杂志,2013,33(9):733-734.15 Fingola F F,Albertino S R,Abrantes S M P,et al.Intralaboratory validation of kinetic chromogenic Limulus Amebocyte Lysate assay for bacterial endotoxin determination in anti-bothropic serumJ.J Pharm Biomed Anal,2013,85(8):93-98.ICP-MS测定红花续断膏中铅砷镉汞铜含量黄焕霞1，刘金磊2，陆蓉蓉1，赵晓辉1*（1.山东明仁福瑞达制药股份有限公司，山东 济南 250104；2.山东古金中医药科技有限公司，山东 济南 250104）摘 要：目的 建立红花续断膏中铅、砷、镉、汞、铜元素的测定方法。方法 采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）对黑膏药中铅、砷、镉、汞、铜元素进行测定。结果 铅、砷、镉、汞、铜分别在050 ng/ml，020 ng/ml，02 ng/ml，02 ng/ml，0200 ng/ml范围内呈良好的线性关系，相关系数（r）均大于0.995；系统精密度、重复性结果RSD均小于10%；各元素检测限为0.0050.11 ng/ml，定量限为0.010.90 ng/ml；平均加样回收率为91.99%111.16%（RSD10.0%，n=6）。结论 本法简便、准确、重复性好，可作为红花续断膏中铅、砷、镉、汞、铜检测方法。关键词：红花续断膏；重金属；电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）；测定中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1672-979X（2023）04-0345-04DOI：10.3969/j.issn.1672-979X.2023.04.012Determination of Lead,Arsenic,Cadmium,Mercury and Copper in Safflower Dipsacus Ointment by ICP-MSHUANG Huan-xia1,LIU Jin-lei2,LU Rong-rong1,ZHAO Xiao-hui1(1.Shandong Mingren Freda Pharmaceutical Co.,Ltd.,Jinan 250104,China;2.Shandong Gujin Chinese Medicine Technology Co.,Ltd.,Jinan 250104,China)Abstract:Objective To establish a method for determination of lead,arsenic,cadmium,mercury and copper in Safflower Dipsacus Ointment.Methods Lead,arsenic,cadmium,mercury and copper in black plaster were determined using an inductively coupling plasma mass spectrometry(ICP-MS).Results The linearity of Pb,As,Cd,Hg and Cu were good in the range of 0-50 ng/ml,0-20 ng/ml,0-2 ng/ml,0-2 ng/ml and 0-200 ng/ml,respectively,收稿日期：2022-02-11作者简介：黄焕霞，主管药师，从事中药新药研究，E-mail:*通讯作者：赵晓辉，硕士，副主任药师，从事中药质量研究，E-mail: