牛膝多糖降血糖活性成分的分离鉴定.pdf

研究论文牛膝多糖降血糖活性成分的分离鉴定刘菲，唐年初，徐德平（江南大学食品学院，江苏无锡2 1412 2)摘要：研究牛膝多糖与降血糖活性的关系。牛膝粉碎后先经乙醇提取，再用热水提取，水提液减压浓缩后经醇沉得到牛膝水提醇沉物。采用链脲佐菌素（streptozocin，ST Z）诱导方法建立小鼠糖尿病模型，每日给药牛膝各分离组分，连续给药8 周，通过测定小鼠血糖、糖化血红蛋白，检测牛膝中具有降血糖活性的组分。采用DEAE、H W-55F、Se p h a c r y l S-40 0 等凝胶色谱柱对具有降血糖活性的牛膝多糖组分进一步分离。运用SephadexG-100凝胶色谱、飞行时间质谱（time offlight mass spectrometer,TOF-MS）、气相色谱（gas chromatography,GC)、核磁共振（nuclearmagnetic resonance,NMR)等手段鉴定多糖纯度、测定相对分子质量、分析结构。结果表明，牛膝的水提醇沉物能显著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)和糖化血红蛋白（H b A 1c）浓度（P0.05）。将水提醇沉部分进一步分离得到具有降血糖活性的牛膝多糖，并鉴定其纯度为均一多糖，相对分子质量为18 0 1.5，该多糖由1分子葡萄糖和10 分子果糖组成，以葡萄糖分子为起点，与果糖C2相连，果糖之间以-1,2糖苷键连接形成主链，支链连接在果糖的C6上，该研究明确了牛膝中具有降血糖活性的多糖分子结构。关键词：牛膝；多糖；降血糖；分离纯化；活性成分中图分类号：R284.2文章编号：16 7 3-16 8 9 2 0 2 3)0 7-0 10 4-0 8DOl:10.3969/j.issn.1673-1689.2023.07.012Isolation and Identification of Hypoglycemic Polysaccharidefrom Achyranthes bidentataLIU Shuofei,TANG Nianchu,XU Deping(School of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)Abstract:The study investigated the relationship between polysaccharides from Achyranthesbidentata and their hypoglycemic activity.The powder of Achyranthes bidentata was first extractedwith ethanol,followed by hot water extraction.The resulting water extract was concentrated underreduced pressure,and the Achyranthes bidentata water extract precipitate was obtained by ethanolprecipitation.Streptozocin(STZ)induction method was used to establish a diabetic mouse model,mice were given gastric medicine Achyranthes bidentata isolated components daily for eight weeks,and hypoglycemic components in Achyranthes bidentata were detected by measuring blood glucoselevels and glycated hemoglobin values in mice.Hypoglycemic polysaccharide components fromAchyranthes bidentata were further purified using DEAE,HW-55F and Sephacryl S-400 gel收稿日期：2 0 2 1-12-0 2基金项目：中央高校基本科研业务费项目（JUSRP21127)。*通信作者：徐德平（19 6 5一），男，博士，副教授，硕士研究生导师，主要从事天然产物化学研究。E-mail：x d p 12 19 s i n a.c o m104JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 7 2023研究论文刘菲，等：牛膝多糖降血糖活性成分的分离鉴定columns.The purity,relative molecular weight,and structure of the polysaccharides were determinedusing Sephadex G-100 gel chromatography,time of flight mass spectrometer(TOF-MS),gaschromatography(GC),and nuclear magnetic resonance(NMR).Results showed that the Achyranthesbidentata water extract precipitate significantly reduced fasting plasma glucose(FPG)and glycatedhemoglobin(HbAlc)levels in diabetic mice(P0.05).The hypoglycemic polysaccharides with arelative molecular weight of 1 801.5 from the water extract precipitate were identified as ahomogeneous polysaccharide composed of one glucose molecule and ten fructose molecules,connected to the glucose molecule as the starting point and to C2 of fructose.The main chain isformed by connecting the fructose molecules with-1,2 glycosidic bonds linkage,and the branchedchains are connected to Coof fructose.The molecular structure of the hypoglycemic polysaccharidesin Achyranthes bidentata was identified.Keywords:Achyranthes bidentata,polysaccharides,hypoglycemic,isolation and purification,activitycomponent牛膝（Achyranthes bidentata)为多年生草本植物，属苋科植物，广泛分布于河南、山东、四川等地叫。牛膝是保健食品生产原料，在河南焦作一带用作煲汤滋补佳品，主要成分有多糖、皂苷、蜕皮笛酮、黄酮类和生物碱类等3-4,具有多种药理活性,如消炎镇痛、抗骨质疏松、免疫调节等。现代药理研究发现牛膝具有降血糖活性5,成为中药降血糖方剂的高频用药，牛膝中具有降血糖活性的成分多指向多糖类物质,如牛膝粗多糖对血脂代谢的改善作用、牛膝粗多糖对糖尿病模型小鼠和大鼠的降血糖作用7-,以及在高脂饲料中，随着牛膝粗多糖添加量的增加，血鹦鹉的血糖含量显著降低，表现出降血糖作用等9,但有关牛膝多糖构成与降血糖活性的关系鲜有报道。牛膝多糖的降血糖活性研究不应仅仅局限在粗提物的活性上，应深人研究牛膝多糖降血糖作用的构效关系,为揭示牛膝降血糖机制和开发利用提供理论依据。因此，作者以牛膝为原料,通过水提醇沉法以及多种柱层析手段对牛膝多糖进行提取与纯化I,结合动物实验检测降血糖活性,筛选出牛膝中具有降血糖活性的多糖,为明确其在糖尿病治疗方面的作用提供理论依据。材料与方法1.17材料与试剂牛膝：购自亳州药材市场，经鉴定为怀牛膝(Achyranthesbidentata)；硅胶板：山东烟台芝果化工厂产品;DEAE-Cellulose色谱柱、HW-55F色谱柱、G-5000PWXL凝胶柱、G-3000PWXL凝胶柱：日本TOSOH公司产品;SephacryS-400色谱柱：美国GEHealthcare公司产品;SephadexG-100色谱柱：瑞典Pharmaeia公司产品；链脲佐菌素（s t r e p t o z o c i n,ST Z）：美国Sigma公司产品（批号：SLCF1289）；SPF级雄性ICR小鼠：浙江维通利华实验动物技术有限公司提供（合格证号：20201204Abzz0619000862)；实验用水为去离子水；其他试剂均为国产分析纯。1.2仪器RAT-100型萃取罐：无锡申科仪器有限公司产品；R-1002型旋转蒸发器：上海申顺生物科技有限公司产品；SYB206-100型恒流泵：天津市科器高新技术公司产品；UV-2450型紫外分光光度计：日本岛津公司产品Avance500MHz型核磁共振仪：美国Bruker公司产品；Voyager-DEPRO型质谱仪：美国ABI公司产品；TRACE1300型气相色谱仪：赛默飞世尔科技公司产品；卓越金采型血糖测定仪及试纸：上海罗氏制药有限公司产品；AU5800全自动生化分析仪：美国贝克曼库尔特有限公司产品。1.3方法1.3.1牛膝各组分的提取与粗分离称取10 kg牛膝,粉碎后置于10 0 L萃取罐中,按照料液比1g:10mL加入体积分数为7 5%的乙醇，6 0 搅拌提取3h，过滤，取滤液，滤渣按照上述方法重复提取一次，合并两次滤液进行减压浓缩得到醇提物。滤渣继续按照料液比1g:10mL加人去离子水，相同条件下搅拌提取两次，合并滤液减压浓缩得到牛膝水提液，向食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期105RESEARCHARTICLELIU Shuofei,et al:Isolation and Identification of HypoglycemicPolysaccharide from Achyranthes bidentata水提液中边搅拌边加人3倍体积的无水乙醇，静置8h后过滤得到水提醇沉物和水提醇溶物。另取50 0 g牛膝，粉碎后置于10 L萃取罐中，按照料液比1g:10mL加入体积分数为7 5%的乙醇,6 0 旋转提取3h，过滤,取出醇提液后,滤渣按照料液比1g:10mL加入去离子水，相同条件下得到水提液，将水提液和醇提液合并浓缩至干，即得到牛膝原样。1.3.2牛膝提取物降血糖活性测定1)STZ溶液的配制参照段晖等的方法,准确称取2.10 g柠檬酸，加人10 0 mL双蒸水配成柠檬酸母液，称为A液；准确称取2.9 4g柠檬酸三钠，加人10 0 mL双蒸水配成柠檬酸钠母液，称为B液。将A、B液按体积比1.0 0:1.32 混合，用pH计测定pH,调溶液pH为4.0,得到0.1mol/L柠檬酸钠缓冲液。准确称取30 0 mgSTZ溶于30 mL柠檬酸钠缓冲液中，新鲜配制成10 mg/mL的STZ溶液，并用0.22m滤菌器过滤除菌，注意避光配制,现用现配。2)糖尿病模型的建立与分组取5周龄SPF级ICR雄性健康小鼠8 0 只，适应性喂养7 d后禁食12 h，随机取7 0 只小鼠按照150 mg/kg剂量腹腔注射STZ溶液，余下10 只小鼠注射相同剂量的柠檬酸钠缓冲液,记为空白组。3d后,用血糖仪检测各组小鼠空腹血糖，空腹血糖高于11.2 mmol/L即认为糖尿病模型建造成功。选造模成功的小鼠50 只，分为模型组、原样组（A）、水提醇沉组(B）、水提醇溶组（C)、醇提组(D)，每组10 只。分别取适量分离组分用去离子水配制成0.1g/mL的样品溶液，各给药组按照1.0 g/(kgd)剂量13-14灌胃相应的组分，模型组与空白组则灌胃饮用水，连续灌胃8 周。每周记录一次各组小鼠进食量、饮水量及体质量，并对小鼠毛色、尿量、精神状态等一般情况进行观察。给药前、给药第4周和第8 周测定小鼠空腹血糖。给药8 周后,对小鼠摘眼球采血,室温静置2h后于4下30 0 0 r/min离心15min提取血清,用全自动生化分析仪测定HbAlc，同时取小鼠肝、肾称质量,计算肝脏系数和肾脏系数。1.3.3水提醇沉组分的分离取水提醇沉组分，加人适量的去离子水至适宜体积，上样至DEAE柱(5cmx100cm）,流量恒定为5mL/min，分别用去离子水和0.0 5、0.10 mol/L的NaCl溶液洗脱，自动收106JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 7 2023集器收集洗脱液，每管10 mL。采用苯酚硫酸法检测，根据洗脱峰分别收集水洗脱液（M)和盐洗脱液，由于盐洗脱部分中糖组分极少，不足以支撑后续的分离，无法进一步研究。取适量水洗脱液，浓缩之后上样到HW-55F(5cmx150cm)色谱柱上，用去离子水以5mL/min的流量洗脱,每管10 mL,收集洗脱液。采用苯酚硫酸法检测洗脱组分，得到洗脱组分M1、M 2、M 3,经多次分离后得到用于动物实验的各组分的量。1.3.4HW-55F柱水洗脱组分降血糖活性检测按照1.3.2 的方法建立小鼠糖尿病模型，测定M1、M2、M 3组分的降血糖活性。1.3.5活性组分的纯化将具有降血糖活性的M2组分上样至Sephacryl S-400凝胶色谱柱（3cmx150cm）,继续用去离子水以2 mL/min的流量洗脱。采用苯酚硫酸法检测洗脱组分，收集主要组分并反复上此柱分离，直到洗脱峰为单一对称峰为止，最后得单一组分N。1.3.6多糖N的纯度鉴定将具有降血糖活性的多糖N用去离子水配制成质量浓度为5mg/mL的溶液，使用紫外分光光度计在波长2 0 0 40 0 nm进行扫描，检测其是否含有蛋白质吸收峰。另取适量多糖N溶液上样至SephadexG-100凝胶色谱柱(3cmx150cm），用去离子水以2 mL/min的流量洗脱。采用苯酚硫酸法测定洗脱液，以确定是否为单一峰。1.3.7多糖N的单糖组成分析按刘冰等的方法15,称取2 0 mg多糖N，加人2 mL1mol/L的硫酸,在安培管中用沸水浴水解5h,取出冷却后,水解液用BaCO3固体中和至pH为7,离心取上清液备用。将上述上清液移至具塞试管中，加人10 mg盐酸羟胺、适量肌醇和0.5mL无水吡啶溶解，加塞，90恒温水浴振荡30 min；冷却至室温后，加人0.5mL乙酸酐,加塞,9 0 恒温水浴振荡30 min，冷却至室温,即得单糖乙酰化衍生物。取6 种标准单糖：鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖各10 mg，按上述方法制备乙酰化衍生物。将1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化样品进行气相色谱分析，参数如下：DB-1701石英毛细管色谱柱（0.53mmx30mx1.5m）；检测器：FID（氢火焰离子化检测器）；柱温采用程序升温，起始温度为12 0，停留2 min后，以10/min升温研究论文刘菲，等：牛膝多糖降血糖活性成分的分离鉴定至19 5,停留1min后，以3/min升温至2 40，停留10 min。1.3.8多糖N的相对分子质量测定从色谱洗脱曲线中可知多糖N的保留时间较长，说明多糖N的相对分子质量较小,取多糖N直接进行质谱分析6,测定相对分子质量。1.3.99多糖N的核磁共振测定多糖N先进行重水(D2O)交换二次,再以重水为溶剂,进行 H-NMR和13C-NMR等分析。1.3.10数据处理数据采用SPSS26.0统计学软件分析，结果以平均值标准差表示。组间比较采用方差齐性检验,P0.05为差异显著。2结果与讨论2.1牛膝提取物不同组分降血糖活性与空白组相比，模型小鼠毛发干枯暗淡、精神不佳、垫料湿脏，出现明显的“三多一少”症状（即多饮、多食、多尿和体质量减轻），这是机体在长期高血糖状态下的典型表现7 ,主要是因为血糖过高造成渗透性利尿，导致“多尿”,进而引起口渴多饮，又因营养物质流失而出现多食却消瘦的现象。各组小鼠进食量、饮水量与体质量变化见图1 图3，前2 8d各给药组小鼠“三多一少”症状与模型组类似，随着给药的进行,后2 8 d有不同程度的改善,其中B组小鼠“三多一少”症状改善最为明显。糖尿病的“三多一少”症状,在中医理论中被称作“消渴症”,由淤血阻络、热毒内盛、伤阴耗气等所致，因此选用的治疗药物多为活血化瘀、清热解毒及补益类中草药18,牛膝也正是因为具有以上功效而被用于治疗糖尿病。根据小鼠“三多一少”症状的定量分析,活性组分主要存在于牛膝水提醇沉物中。各组小鼠肝脏系数、肾脏系数见表1。模型组肝脏系数和肾脏系数明显高于空白组，异常肥大,A组、B组和D组的肝脏系数和肾脏系数相比于模型组显著降低(P0.05）,与空白组接近,趋于正常,表明牛膝原样、水提醇沉物和醇提物可缓解糖尿病小鼠肝、肾病理性肥大。糖尿病小鼠在持续高血糖状态下会出现肝、肾病变,如异常的血脂代谢诱发肝硬化、脂肪肝等,肾小球基底膜增厚,系膜扩张,出现肾小球硬化和肾小管间质性纤维化等病理改变，导致肝脏、肾脏等脏器出现异常肥大。从各组小鼠肝脏系数、肾脏系数的比较结果上可以看出，牛膝原样、牛膝水提醇沉物和醇提物均具有缓解脏器肥大的作用。1614(P/)/鲁县含盘研121086420第1天第7 天第14天第2 8 天第35天第42 天第49 天第56 天图1各组小鼠进食量变化Fig.1Changes in food intake of mice in each group空白组?B组40模型组一米D组3832305一A组C组(P/同)/鲁4含每研0第1天第7 天第14天第2 8 天第35天第42 天第49 天第56 天图2 各组小鼠饮水量变化Fig.2Changes in water consumption of mice in eachgroup454035302520151050第1天第7 天第14天第2 8 天第35天第42 天第49 天第56 天图3各组小鼠体质量变化Fig.3Changes in body weight of mice in each group表1肾脏系数和肝脏系数Table 1Kidney and liver weight indexs组别模型组空白组A组B组C组D组注：*表示与模型组比较,P0.05;#表示与空白组比较,P0.05。食品5生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期空白组?B组一模型组一米一D组A组C组空白组1?B组模型组一*D组一A组C组肝脏系数/%7.220.334.540.27*5.040.32*5.170.38*5.970.30#4.940.42*肾脏系数/%2.980.421.830.26*2.000.52*2.050.42*2.200.71*1.980.33*107RESEARCHARTICLELIU Shuofei,et al:Isolation and Identification of HypoglycemicPolysaccharide from Achyranthes bidentataM3各组分对小鼠空腹血糖和糖化血红蛋白的影响见表2。给药前，模型组小鼠和各给药组小鼠之间的空腹血糖无显著性差异，均高于空白组小鼠，说明糖尿病小鼠造模成功。在给药第4周,与模型组相比,B组小鼠血糖明显下降；在给药第8 周,B组小鼠血糖比模型组显著降低(P0.05),具有降血糖作用。A组小鼠在第8 周仍为高血糖状态,与模型组无差异，而牛膝经过水提醇沉得到的B组样品才表现出降血糖功效，出现这一结果的原因可能是经过提取分离,B组分富集了降血糖活性成分,故在相同给药剂量下,B组表现出优于A组的降血糖效果。Table 2 Effects of various components of Achyranthes bidentata on FBG and HbA1c in mice(n=10)组别空白组模型组A组B组C组D组注：与模型组比较，*表示P0.05,*表示P0.01。2.2牛膝水提醇沉组分的分离结果牛膝水提醇沉物经DEAE柱分离，其洗脱曲线如图4所示。水洗脱有一个主峰，而NaCl溶液洗脱只有一个很小的洗脱峰,表明水提醇沉物中多糖主要在水洗脱部分，进一步得出牛膝多糖以中性多糖为主，收集水洗脱物浓缩到适当体积。0.70.60.50.4B0.30.20.100Fig.4Elution curve of DEAE cellulose column将水洗脱物用HW-55F凝胶色谱柱继续用水洗脱分离，其洗脱曲线见图5。有3个不同保留时间的洗脱峰，依照洗脱顺序分别记为M1、M 2、M 3。从保留时间判断,3个洗脱组分的相对分子质量以M1为最大，M2介于中间，M3最小。108JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 7 2023HbAlc是由红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类发生非酶反应所产生的产物，其测定结果与检测前是否空腹、是否注射胰岛素、是否服用降糖药物等因素无关19 ,故比空腹血糖更能准确反应机体血糖水平。在第8 周时,B组小鼠的HbA1c显著低于模型组（P0.05）,进一步证明牛膝水提醇沉物具有降血糖效果。从以上结果可以看出，牛膝不同组分具有降血糖的作用,其中牛膝醇提物与水提醇沉物均具有缓解糖尿病小鼠脏器病变的效果,水提醇沉物同时具有降血糖活性。表2 牛膝各组分对小鼠FPG和HbA1c的影响（n=10)FPG浓度/(mmol/L）给药前给药第4周5.821.51*5.881.33*28.184.9328.004.2426.605.2521.663.8624.046.0917.826.2320.207.7923.146.6225.115.3022.954.760.12M0.100.080.0410.022040图4DEAE纤维素柱洗脱曲线HbAlc浓度/给药第8 周(mmol/L)5.941.43*3.400.20*25.306.226.830.9819.324.275.772.3110.443.89*4.301.28*22.785.566.771.8719.756.125.631.310.70.60.50.40.30.20.1F0Fig.5Elution curve of HW-55F gel column2.3M1、M 2、M 3组分降血糖活性检测将给药3个组分的小鼠分为M1组、M2组、M36080100120140洗脱管数M12040图5HW-55F凝胶柱洗脱曲线组,3个组分对小鼠FPG和HbA1c的影响见表3。在给药第4周,M2组小鼠的FPG呈下降趋势,在给药第8 周,M2组小鼠的FPG和HbA1c均显著低于模型组(P0.05),由此可得M2组分具有降血糖活性,而M1、M 3组分没有该活性。牛膝多糖中具有降血糖活性的组分主要为中等相对分子质量的M2,而大相对分子质量和小相对分子质量的组分都没有该活性。M26080洗脱管数100120140160研究论文刘菲，等：牛膝多糖降血糖活性成分的分离鉴定表3M1、M 2、M 3组分对小鼠FPG和HbA1c的影响（n=10)Table3Effects of components M1,M2 and M3 on FPG and HbA1c in mice(n=10)组别给药前空白组4.721.33*模型组24.184.26M1组25.663.67M2组27.055.85M3组28.112.82注：与模型组比较，*表示P0.05，*表示P0.01。2.4活性组分的纯化具有降血糖活性的M2组分反复经SephacrylS-400凝胶色谱柱纯化,直到洗脱峰为单一对称峰，其洗脱曲线如图6 所示,结果表明得到了一个单一多糖,记为N。0.70.60.50.40.30.20.1000000图6 SephacrylS-400凝胶柱洗脱曲线Fig.6 Elution curve of Sephacryl S-400 gel column2.5多糖N的结构分析2.5.1纯度鉴定多糖N经过SephadexG-100(3cmx150cm)凝胶色谱柱洗脱，其洗脱曲线如图7所示。从图中看到也为单一对称峰。另外,在2 6 0 280nm下检测时无紫外吸收峰，表明N为纯多糖。100-980.3899.8818.7%/丰50539.105006007008009001000110012001300140015001600170018001900图8 多糖N的TOF-MSES图谱Fig.8TOF-MS ES spectra of polysaccharide NFPG浓度/(mmol/L）给药第4周4.921.20*27.004.2422.707.2321.684.0125.085.270.70.6F0.50.40.3F0.20.1N000000000000000001020304050600洗脱管数在49 0 nm下测定吸光度。图7 SephadexG-100凝胶柱洗脱曲线Fig.7 Elution curve of Sephadex G-100 gel column2.5.2单糖组成分析多糖N水解经乙酰化后气相色谱结果只看到一个峰,经与标准品对比，与葡2040洗脱管数818.2899.3737.2980.8 1,061.31.061.8737.7200.3819.3656.2738.2656.7657.2HbAlc浓度/给药第8 周(mmol/L)5.791.64*3.480.22*27.505.927.050.4818.415.906.480.7015.806.78*5.180.47*20.828.156.950.620000000000070809010060801001.062.3_1142.8143.313,13.41313.41314.41475:5,1351.41478:314,76.41 637.5m/z食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期萄糖峰一致,说明多糖N含有葡萄糖残基。结合核磁分析多糖N含有果糖，由于酮糖不易进行衍生化，实验中使用的PMP柱前衍生化法无法检测出果糖，而未呈现果糖的色谱峰。2.5.3相对分子质量测定结果图8 所示，分子离子峰（M-H-)质荷比为18 0 0.5,确定该多糖N相对分子质量为18 0 1.5，每组系列峰中相邻两峰之间的ml/z均相差16 2，表明多糖的109多糖N的质谱如1 800.5RESEARCHARTICLELIU Shuofei,et al:Isolation and Identification of HypoglycemicPolysaccharide from Achyranthes bidentata糖残基单元为已糖,即多糖N由11个糖残基组成，说明N的相对分子质量较小,这与前面的结果一致。2.5.4核磁共振分析多糖N为白色无定形粉末，其 H-NMR谱、C-NMR谱、13DEPT谱见图9、图10、图11。H-NMR图谱中仅在8 为5.2 9 0 处有一弱信号，为糖上的端基H信号，8 为4.7 8 0 处是重水残存的信号峰，8 为3.37 1 4.0 7 7 处的信号峰为糖上的端基H信号。在13C-NMR图谱中,8 为103.037104.067处有3组糖端基的碳信号，而 H-为10 3.0 37 处的碳信号与8 为9 2.36 7 处的碳信号接近,可以判断该果糖残基与葡萄糖相连,葡萄糖中其他碳并未成键，说明葡萄糖是该多糖的起点。为81.007和8 0.147 处的碳信号应为果糖C3、C s 的碳信号，果糖之间是以-1,2糖苷键连接构成主链，并在Cc位上形成侧链。该结构(见图12)与王昌盛报道的牛膝果聚糖完全一致2 0 43NMR谱无相应的端基H信号，说明多糖中是以酮糖为主要组成单元，结合135DEPT谱可见8 为63.21059.854处都是CH2上的碳信号，从化学位移进一步分析得出这些酮糖为果糖,有3个果糖残基且都为构型。碳谱中还存在一组弱的碳信号,分8别在为9 2.36 7、7 6.16 2、7 5.0 6 6、7 2.49 1、7 0.9 8 4、61.141处，这是一组葡萄糖信号，从8 为9 2.36 7 处的化学位移信号来看，葡萄糖为-构型。从丰度看87图9 多糖N的H-NMR图谱Fig.9H-NMR spectrum of polysaccharide N46O80651442i20650443210105808100Fig.103C-NMR spectrum of polysaccharide N200:18-5538020454208255743229590图10多糖N的13C-NMR图谱42329985807570656095110JOURNAL OF FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY Vol.42 IsSue 7 20239085Fig.11 13DEPT spectrum of polysaccharide N80图11多糖N的135DEPT图谱75706560研究论文刘菲，等：牛膝多糖降血糖活性成分的分离鉴定OHHOHOHOHOOHFig.12SStructural formula of polysaccharide N fromAchyranthesbidentata3结语通过STZ诱导糖尿病小鼠实验，筛选出牛膝中具有降血糖活性的多糖,并经分离纯化,鉴定多糖构成。经STZ诱导糖尿病小鼠实验证明水提醇沉物OH具有降血糖活性。水提醇沉物经DEAE-Cellulose、HOOHOHOHO7OH-OH图12 牛膝多糖N结构式HW-55F分离，得到相对分子质量不同的3个组OH分，经动物实验得出中等相对分子质量的多糖具有OHHO降血糖活性。OH作者将该活性组分经 Sephacryl S-400 凝胶柱进一步纯化,得到单一多糖N。在紫外分光光度计下鉴定不含蛋白质。经SephadexG-100凝胶柱鉴定为均一多糖，经质谱测定相对分子质量为18 0 1.5,该多糖由1分子葡萄糖和10 分子果糖组成，以葡萄糖分子为起点,与果糖C2相连,果糖之间以-1,2糖苷键连接形成主链，支链连接在果糖的C6上。经STZ诱导糖尿病小鼠实验证明其具有降血糖活性，是牛膝发挥降血糖作用的主要成分。参考文献：1尚风琴。怀牛膝与川牛膝功能活性成分的比较研究D.武汉：中国科学院,2 0 16.【2 国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部M.北京：中国医药科技出版社，2 0 2 0.3张格艳.牛膝化学成分及质量评价方法研究D.郑州：河南省中医药大学附属第二医院,2 0 13.【4 胡慧玲，王彦志，张磊.怀牛膝化学成分的提取分离与鉴定.中药材，2 0 19,42(1)：9 6-9 9.5董琴琴.牛膝化学成分的研究D.扬州：扬州大学,2 0 10.【6 郭晶，孙传鑫，王秋红，等.川牛膝化学拆分组分性味药理学评价：川牛膝化学拆分组分降血脂作用研究.辽宁中医药大学学报,2 0 16,18(7):16-19.7李金贵，袁楷,刘学忠，等.牛膝多糖对链佐星诱导性糖尿病小鼠的保护作用.中国药理学与毒理学杂志,2 0 10,2 4(1)：1-7.8杨旭东，张杰，申梅淑.牛膝多糖对2 型糖尿病大鼠脂肪分化相关蛋白表达的影响J.药物生物技术,2 0 10,17(4):334-336.【9 崔培，范耘硕，白东清，等.牛膝多糖对血鹦鹉部分非特异性免疫与脂类代谢指标的影响.大连海洋大学学报，2 0 16,31(4):397-403.10杨延超,徐德平.大麦芽多糖的降血糖活性及结构解析1.食品与生物技术学报,2 0 12,31(10)：10 8 7-10 9 2.11段晖,秦玉梅，熊艺姣，等.链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠轮廓状乳头中味蕾特征变化.食品与生物技术学报,2 0 13,32(6)：628-632.12钱明辉,达热卓玛，徐德平.荞麦蜂花粉多糖A的分离及其降血糖活性.食品与生物技术学报,2 0 19,38(6)：8 0-8 5.13王仁忠，季旭明.牛膝的毒性毒理研究 .山西中医，2 0 0 7,2 3(4):6 7-6 8.14杨青雅，张伟.牛膝多糖的急性毒性及其制剂的稳定性实验.医药导报,2 0 0 5,2 4(10):8 8 3.15刘冰,许程剑,卢士玲，等.阿魏菇多糖的相对分子质量及单糖组成的测定.食品与生物技术学报,2 0 14,33(10)：10 50-10 55.16廖俊昭.基于液相色谱-飞行时间质谱对三种中草药多糖的糖谱研究D.南昌：南昌大学,2 0 15.17熊韬，喻嵘，吴勇军.全国名中医王行宽治疗消渴（糖尿病)的数据挖掘.湖南中医药大学学报,2 0 2 1,41(5)：7 2 0-7 2 4.18丁英钩，王世东，王颖辉，等.糖尿病“内热伤阴耗气 基本病机探讨J.中医杂志,2 0 0 8,49(5)：38 9-39 1.19刘丽,郑淑君,何英.果糖胺和糖化血红蛋白测定对烧伤后高血糖鉴别的意义.中国药物与临床,2 0 13,13(5):6 47-6 48.20王昌盛.怀牛膝糖聚物的分离纯化、结构鉴定及生物活性测试D.广州：广东药科大学,2 0 16.食品与生物技术学报2 0 2 3年第42 卷第7 期111