苜蓿miR156及其靶基因生物信息学分析.pdf

2023年36 卷7 期Vol.36No.7引用格式：刘宝宝，孟桂智，刘祖江，贾晶莹，段红娟，马云，蔡小艳.首miR156及其靶基因生物信息学分析J.西南农业学报，2 0 2 3,36（7）：138 5-1392.Liu B B,Meng G Z,Liu Z J,Jia J Y,Duan H J,Ma Y,Cai X Y.Bioinformatics analysis of alfalfa miR156 and its target genesJ.Southwest China Jour-nal of Agricultural Sciences,2023,36(7):1385-1392.D0I:10.16213/ki.scjas.2023.7.004.西南农业学报Southwest China Journal of Agricultural Sciences首miR156及其靶基因生物信息学分析1385刘宝宝,孟桂智,刘祖江，贾晶莹,段红娟,马为云，蔡小艳（宁夏大学农学院/宁夏回族自治区反动物分子细胞育种重点实验室，银川7 50 0 2 1）摘要：【目的】分析首miR156（m t r-m i R156）基因家族的序列组成及基因表达功能，为mtr-miR156跨界调控的研究提供理论基础。【方法】应用PmiREN数据库检索并分析mtr-miR156家族成员成熟序列、茎环序列和成熟序列染色体定位信息，weblogo在线网站对mtr-miR156家族成熟序列、茎环序列进行保守性分析,DNAMAN软件分析茎环序列同源性，同时利用联川生物云平台和TargentScan在线网站预测并下载获得mtr-miR156a的靶基因、靶基因GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，通过RNAhybrid在线网站比对预测到的所有靶基因与mtr-miR156a的结合位点和结合自由能值，选择符合自由能值的靶基因进行靶基因功能分析。【结果】PmiREN数据库共检索到10 个mtr-miR156家族成员；10 个成员成熟序列共定位在3条染色体上；10 个成员中有8 个成员成熟序列完全一致，其余2 个成员成熟序列高度保守；10 个成员茎环序列中位于成熟序列位置的碱基与成熟序列完全一致；茎环序列同源树分析结果显示10 个成员共分为3个分支，mtr-miR156g与其他成员的亲缘关系最远；经过GO功能富集分析发现，预测到牛体内的靶基因显著富集于转录调控功能、细胞膜组成以及ATP合成等；利用KEGG通路注释表明，预测到牛体内的靶基因显著集中于脂肪酸降解通路和Ras信号通路调节等通路中。【结论】首miR156基因家族可能会通过相关靶基因跨界调控奶牛体内脂肪酸降解、ATP合成、细胞炎症、乳脂乳蛋白合成代谢等作用。关键词：首；miR156；生物信息学；奶牛；跨界调控中图分类号：S858.23Bioinformatics analysis of alfalfa miR156 and its target genes文献标识码：A文章编号：10 0 1-48 2 9(2 0 2 3)7-138 5-0 8LIU Bao-bao,MENG Gui-zhi,LIU Zu-jiang,JIA Jing-ying,DUAN Hong-juan,MA Yun,CAI Xiao-yan(School of Agriculture,Ningxia University/Key Laboratory of Ruminant Molecular and Cellular Breeding of Ningxia Hui Autonomous Region,Yinchuan 750021,China)Abstract:Objective)The present study aimed to analyze the sequence composition and gene expression function of alfalfa miR156(mtr-miR156)gene family,so as to provide a theoretical basis for the study of transboundary regulation of mtr-miR156.MethodPmiREN data-base was used to retrieve and analyze mature sequences of mtr-miR156 family members,stem loop sequences and the chromosome locationinformation of mature sequences.Weblogo online website was used to analyze the conservation of mature sequences and stem loop sequencesof mtr-miR156 family members.Stem-loop sequences homology was analyzed by the DNAMAN.Meanwhile,the target genes of mtr-miR156a,target gene GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were predicted and downloaded by Lianchuan Bio-cloud platform and TargentScan online website.The binding sites and binding free energy values of all the predicted target genes and mtr-miR156a were compared by RNAhybrid online website,and the target genes meeting the free energy values were selected for functional anal-ysis of target genes.ResultA total of 10 mtr-miR156 family members were retrieved from PmiREN database.The mature sequences of 10members were co-localized on 3 chromosomes.The mature sequences of 8 out of 10 members were completely consistent,and the mature se-quences of the other 2 members were highly conserved.In the stem-loop sequence of 10 members,the bases located in the mature sequencewere identical with the mature sequence.Stem-loop sequence homology tree analysis showed that the 10 members were divided into threebranches,and mtr-miR156g was the furthest related to other members.GO functional enrichment analysis showed that the predicted target收稿日期：2 0 2 2-0 8-2 7基金项目：国家自然科学基金项目（319 6 0 6 8 0）；宁夏自然科学基金优秀青年项目（2 0 2 2 AAC05012）；宁夏重点研发项目引才专项(2018BEB04031)第一作者：刘宝宝（19 9 7），男，硕士，研究方向为动物分子营养与饲料。E-mail：l i u b a o b a o 0 8 0 6 16 3.c o m通讯作者：蔡小艳（19 8 2），女，博士，研究员，主要从事动物饲料与分子营养研究。E-mail:1386genes in bovine were significantly enriched in transcriptional regulatory function,cell membrane composition and ATP synthesis.KEGG path-way annotation showed that the predicted target genes in cattle were significantly concentrated in faty acid degradation pathway and Ras sig-naling pathway regulation.ConclusionThe alfalfa miR156 gene family may regulate fatty acid degradation,ATP synthesis,cellular inflam-mation,milk fat,milk protein anabolism and other effects in dairy cows through related target genes.Key words:Alfalfa;miR156;Bioinformatics;Cow;Cross-border regulation【研究意义】畜牧生产中，首（Medicago sati-v)作为奶牛重要的饲料来源之一,与产奶量和乳品质密切相关。而miR156家族作为首中表达最高的miRNA之一1,探究和挖掘其生物信息和调控功能具有潜在的研究意义。【前人研究进展】微小RNA（mi c r o RNA,mi RNA）是生物体内普遍存在的一种内源性的单链非编码RNA,长度大约为18 2 5nt。最初在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans，C.elegan)体内被发现2 。其发挥作用的方式是通过miRNA与靶基因3非翻译区（Untranslated re-gions,UTR)抑制性结合,抑制该蛋白合成或诱导该mRNA 降解,从而对基因进行转录后表达调控3。miRNA参与包括细胞间信号传递，细胞增殖、分化、凋亡以及细胞代谢等多种生物进程4-5。植物miRNA与动物miRNA最大的区别在于植物miRNA3末端具有2 -0-甲基化修饰,甲基化修饰不仅能够增强miRNA的稳定性,还能保护甲基化修饰的miRNA不会被核酸外切酶降解6 。甲基化修饰使植物miRNA经过加工、烹饪和储存等预处理后不会被降解，依然可以进人人和动物体内跨界调控发挥一定作用7 。目前,植物跨界调控主要在抑制乳腺癌增长、促进细胞增殖、预防疾病等方面研究较多8-10 。【本研究切人点】首猎在畜牧生产中是非常重要的经济作物，有“牧草之王”之称的紫花首产草量高，适口性好，营养价值高，不仅含有丰富的蛋白质、矿物质和维生素等营养成分，而且富含动物所需的必需氨基酸、微量元素和未知生长因子1。首以其干草和青贮形式饲喂奶牛在奶牛瘤胃中更容易消化12 。在日粮中添加首饲喂荷斯坦奶牛，能够增加牛乳中乳蛋白率、提高消化率和产奶量13。因此,探究首猎中的非编码RNA 将具有非常大的潜力。首中miR156家族成员较多，且在奶牛体内具有复杂的调控关系。明确其家族基因的序列组成及调控功能，是畜牧生产中利用首藉非编码RNA的关键所在。【拟解决的关键问题】本研究将利用生物信息学方法,对mtr-miR156基因家族成员进行成熟序列和茎环序列保守性分析、成熟序列染色体定位、茎环序列同源树分析和靶基因预测，为mtr-miR156在奶牛体内的调控研究以及首优良品种选育等提供参考依据。西南农业学报1#材料与方法1.1数据来源在植物miRNA数据库PmiREN（h t t p:/w w t t p:/w e b l o g o.b e r k e l e y.e d u/l o-go.cgi)在线网站对mtr-miR156家族成员的成熟序列和茎环序列进行多序列比对，并绘制序列保守性分析图。Logo图可以显示出序列中每个位置上碱基出现的频率和序列保守程度,其中参数均设置为默认值。通过DNAMAN软件对mtr-miR156家族10名成员的茎环序列进行比对分析并绘制同源树,其中参数均设置为默认值。1.3靶基因预测及功能富集分析利用联川生物云平台（https：/w w w.o m i c s t u- a r g e t Sc a n、RNA h y b r i d 在线网站预测获得mtr-miR156家族成员在牛体内的靶基因信息以及靶基因Geng Ontology（G O）功能注释和京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genesand genomes,KECG)通路富集分析。2结果与分析2.11mtr-miR156家族成熟序列保守性分析及其基因定位利用PmiREN数据库共搜索到10 个mtr-miR156家族成员（表1）。结果显示，除了mtr-miR156g和mtr-miR156j的长度分别为2 2 和2 1nt外,其余8 个成员的长度均为2 0 nt。利用数据库对10个家族成员进行基因定位，发现10 个成熟序列共分布在3条染色体上，分别为染色体1、3和4。其中有5个成员位于染色体3上，分别是mtr-miR156c、m t r-m iR156 d、m t r-m iR156 e、m t r-m iR156 f、mtr-miR156g，有3个成员位于染色体1上，分别是mtr-miR156a、m t r-m iR156 b、m t r-m iR156 j,有2 个成员位于染色体4上，分别是mtr-miR156h、m t r-miR156i。利用DNAMAN软件对mtr-miR156家族成员成熟序列进行保守性分析（图1）,结果表明,除36卷7期2刘宝宝等：首猎miR156及其靶基因生物信息学分析表1mtr-miR156家族成熟序列及其基因定位Table 1 Maturation sequence and gene mapping of mtr-miR156 familymiRNAmicroRNAmtr-miR156amtr-miR156bmtr-miR156cmtr-miR156dmtr-miR156emtr-miR156fmtr-miR156gmtr-miR156hmtr-miR156imtr-miR156j1387miRNA成熟序列(5-3)基因定位miRNA mature sequenceGene mappingTGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体1:40 430 0 5-40 43130TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体1:40 430 2 0-40 43114TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体3：48 2 30 2 2 6-48 2 30 32 3TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体3:48 9 557 31-48 9 558 2 0TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体3:48 2 30 2 11-48 2 30 339TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体3:48 9 557 16-48 9 558 36TTGACAGAAGAGAGAGAGCAC染色体3:2 39 39 432-2 39 39 56 1TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体4:546 7 2 410-546 7 2 533TGACAGAAGAGAGTGAGCAC染色体4:546 7 2 42 5-546 7 2 517TTGACAGAAGAGGGTGAGCACA染色体1:3310 10 6-3310 2 0 80234567891011121314 15 1617181920212253图1mtr-miR156家族成熟序列的保守性分析Fig.1 Conservative analysis of mature sequences of mtr-miR156 familymtr-miR156g和mtr-miR156j外,其余成熟序列中2 0nt完全保守。2.2mtr-miR156家族成员茎环序列的保守性分析对mtr-miR156家族茎环序列进行保守性分析（表2）发现，碱基长度有4个组别（mtr-miR156d、mtr-miR156f 长度为 8 1 nt;mtr-miR156h、m t r-m i R156 i长度为 8 4 nt;mtr-miR156a、m t r-m i R156 b、m t r-m i R1miRNAmicroRNAmtr-miR156amtr-miR156bmtr-miR156cmtr-miR156dmtr-miR156emtr-miR156fmtr-miR156gmtr-miR156hmtr-miR156imtr-miR156j56j 长度为 8 6 nt;mtr-miR156c、m t r-m i R156 e、m t r-miR156g长度为8 9 nt）。通过DNAMNA软件比对（图2），mtr-miR156家族成员中茎环序列高度保守区域与成熟序列完全重合。而其余序列保守性差可能是因为miR156家族成员合成过程在首的不同组织和不同发育阶段造成。表2 mtr-miR156家族茎环序列Table2Stem-loop sequence of mtr-miR156 familymiRNA茎环序列(5-3)miRNA stem-loop sequenceTGACAGAAGAGAGTGAGCACACATGGTACTTTCGTGTATGATGTTTCATTCTCGAAGCTATGTGTGCTCACTCTCTATCTGTCACCTGACAGAAGAGAGTGAGCACACATGCTACTTTCGTGTATGATGTTTCATTCTCGAAGCTATGTGTGCTCACTCTCTATCTGTCACCTGACAGAAGAGAGTGAGCACACATGGTGTTTTCTTGCACGATTATGTTTCCTGCTTGAAGCTATATGTGCTTACTCTCTATCTGTCACCTGACAGAAGAGAGTGAGCACATAGACACTCGGTATAGATGTATATCGTTGCCTTTGCGTGCTCACTCATCTTTCTGTCAAATGACAGAAGAGAGTGAGCACACATGGTGTTTTCTTGCACGATTATGTTTCCTGCTTGAAGCTATATGTGCTTACTCTCTATCTGTCACCTGACAGAAGAGAGTGACCACATAGACACTCCGTATAGATGTATATCCTTCCCTTTGCCTGCTCACTCATCTTTCTGTCAAATTGACAGAAGAGAGAGAGCACAACCCGGGAATGGTTGTAAAGAGAGTCTTTGCCTTTGTTGGGAGTGTGCTCTCCCTTCTTCTGTCATCATGACAGAAGAGAGTGAGCACATGCTGCAGTGATTGTATGATAGCATACAATTCTTGGTGCGTGCTCACTTCTCTTTCTGTCATCTGACAGAAGAGAGTGAGCACATGCTGCAGTGATTGTATGATAGCATACAATTCTTGGTGCGTGCTCACTTCTCTTTCTGTCATCTTGACAGAAGAGGGTGAGCACAAAAAAAGTCTTTAGTATATAATGTTTATACCATTATTTTTGTGTGCTCATACTCTTCTGACAATT138821012345678910112131415161718192021222324252627282930313233343536373839404142434445464748495051525354565758596061626364656667686970717273747576777879808182838485868788899053图2 mtr-miR156家族茎环序列的保守性分析Fig.2Conservative analysis of stem-loop sequences of mtr-miR156 family100%90%80%70%60%50%1100%mtr-miR156amtr-miR156bmtr-miR156c100%mtr-miR156emtr-miR156d|100%mtr-miR156fmtr-miR156jmtr-miR156h 100%mtr-miR156imtr-miR156g图3mtr-miR156茎环序列同源树Fig.3mtr-miR156 stem-loop sequence homology tree生物学过程Biological process200西南农业学报2.3mtr-miR156家族茎环序列的同源树分析利用DNAMAN软件对mtr-miR156家族的茎环88%序列进行比对分析并绘制同源树（图3）。结果显示，mtr-miR156家族10 个成员除miR156g外，共分65%为3个分支：mtr-miR156a、m t r-m i R156 b、m t r-73%miR156c、m t r-m i R156 e（分支I）;m t r-m i R156 d、m t r-70%59%36卷CmiR156f、m t r-m i R156 j（分支）;m t r-m i R156 h、m t r-miR156i（分支）。从进化树上看，mtr-miR156a和mtr-miR156b、m t r-m i R156 c 和mtr-miR156e、m t r-miR156d 和 mtr-miR156f、m tr-m iR156 h 和mtr-miR156i亲缘关系分别都达到10 0%，成员彼此之间亲缘关系最近,而mtr-miR156g与其他序列差异较细胞组成 Cellular component分子功能Molecularfunction150100500wserdooponN SISASurpurgGO条目GO term图4mtr-miR156a在牛体内靶基因GO功能富集分析Fig.4Analysis of GO functional enrichment of mtr-miR156a target gene in catle7期大，与其他成员亲缘关系最远。进一步分析PmiREN数据库中成熟序列表达位置和RPM信息，发现mtr-miR156其他成员主要在植物的幼苗、嫩芽、叶中高表达。而mtr-miR156g在首藉的嫩芽和叶中极少表达,只有在首的幼苗中高表达,在首的种子中少量表达。结合同源树,分析mtr-miR156g在首不同组织中高表达可能会导致与其他成员成熟序列有所差异，亲缘关系较远。有研究表明，miR-NA在同一物种的不同细胞或组织中表达量显著差异,比如miR171在拟南芥的花序和花组织中表达量高，而在茎和叶组织中不表达14。这也表明miRNA的表达模式具有分化的组织特异性和时序性,即miRNA水平在不同组织、不同发育阶段中有显著差异。2.4mtr-miR156a靶基因GO功能富集分析miRNA与mRNA作用是通过miRNA成熟序列的种子区与mRNA的3 UTR结合，而mtr-miR156家族中种子区高度保守，因此使用mtr-miR156a在TargetScan、RNA h y b r id 和联川生物云平台进行牛体内靶基因预测。Gene Ontology（G O）功能富集分析（图4)发现，注释到生物学过程层面显著富集的功能为RNA聚合酶II转录正调控、转录调控-DNA-模板化、正调控GTRase活性，分别有44、36 和34条靶Inflammatory mediator regulation of TRPchannelsTRP通道的炎症介质调节HTLV-linfectionHTLV-I型感染Fatty acid degradation脂肪酸降解Chemokine signaling pathway趋化因子信号通路Axon guidance.轴突导向Apelin signaling pathwayApelin信号通路0.08图5mtr-miR156a在牛体内靶基因KEGG通路富集分析Fig.5Enrichment analysis of mtr-miR156a target gene KEGG pathway in cattle刘宝宝等：首miR156及其靶基因生物信息学分析通路富集图Statistics of pathway enrichmentbeta-Alanine melabolism-丙氨酸代谢Th17celldiferentiationTh17细胞分化Renal ell carcinoma肾细胞瘤Regulation of actin cytoskeleton肌动蛋白细胞骨架的调节Ras signaling.pathwayRas信号通路Rapl signaling pathwayRapl信号通路Proteoglycans in cancer癌症中的蛋白聚糖Phosphatidylinositol signaling system磷脂酰肌醇信号系统Peroxisome过氧化物酶PPAR signaling pathwayPPAR信号通路Neurotrophin signaling pathway神经营养蛋白信号通路MicroRNAs in cancer癌症中的微小RNAMAPK signaling.pathwayMAPK信号通路Inositol phosphatemetabolism磷酸肌醇代谢1389基因富集。注释到细胞组成层面显著富集的功能为膜的组成部分、细胞质、细胞核，分别有2 0 4、19 4和177条靶基因富集。注释到分子功能层面显著富集的功能为ATP合成、锌离子结合、金属离子结合、分别有8 0、7 3和7 2 条靶基因富集。2.5mtr-miR156a靶基因功能KEGG通路富集分析KEGG通路富集分析发现（图5），在靶基因注释的全部KEGG通路中,最显著富集的通路是脂肪酸降解（P0.001），其次是Ras信号通路的调节（P 0.0 0 1）,其中靶基因数量最多的是Ras信号通路，其次是MAPK信号通路，分别是有35和30 个。表明mtr-miR156a可能对牛体内脂肪酸降解、细胞生长、分化、蛋白质运输和分泌等都具有调控作用。2.6mtr-miR156a调控乳品质中蛋白质合成和脂类代谢相关靶基因预测乳蛋白是人类营养优质蛋白质的重要来源，乳蛋白合成和分泌是由奶牛乳腺上皮细胞完成，主要由高丰度蛋白和低丰度蛋白构成,其中高丰度蛋白以酪蛋白为主，低丰度蛋白主要包括乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白及乳铁蛋白等15。乳蛋白作为牛乳中主要的营养成分之一,其中高丰度的酪蛋白由-酪蛋白、-酪蛋白、k-酪蛋白共同完成，是决定牛乳品质的重要因素16 。乳脂也是牛奶的重要成分,是一P值Pvalue0.0050.0040.0030.0020.001基因数量Genenumber1015?2202530350.120.16富集因子Rich factor0.201390植物miRNAPlant miRNAmtr-miR156a种高质量的天然脂肪，消化率高达9 8%17 。乳脂乳蛋白率作为评判牛乳品质的重要指标之一，成为关注奶牛营养调控及分子调控的热点。为此，在预测到的所有靶基因中筛选出mtr-miR156a调控蛋白质合成和脂类代谢相关的靶基因,并在RNAhybrid在线网站上进行比对，最终筛选出符合自由能阈值的靶基因（表3）,预测其靶基因在奶牛体内参与乳脂乳蛋白合成代谢,为后续研究mtr-miR156a调控奶牛乳脂乳蛋白合成代谢奠定基础。3 讨 论在植物miRNA研究中,miR156是一种进化非常保守的miRNA【18 ,在拟南芥、首、大豆、水稻等多种植物中,均能检测到iR156,发现其对植物开花过程、生长发育、响应生物和非生物胁迫等都具有调控作用。miR156最早发现于拟南芥植物中，靶向squamosa启动子结合蛋白（Squamosa promoterbind-ing protein-lilke,SPL)基因家族参与植物表型改变和调控开花过程19-2 1,可以调节植物嫩芽从幼年期到成年期的过渡，伴随着植物营养形态的改变和生殖潜力的增加。植物开花易受外界因素的影响,温度、湿度等环境因素都会影响植物开花过程，延期开花会影响果实成熟和农作物产量，miRNA在植物开花过程中起重要调节作用。SPL家族是植物中特有的一类具有多功能的转录因子家族，具有高度保守的DNA结合区域SBP结构域2 2 。在拟南芥中,SPL基因家族成员有17 个，其中有11个基因受到miR156 调控,参与调节开花过程、代谢调节以及非生物胁迫等多种调节功能2 3。研究发现，miR156可以靶向SPL3基因控制叶片中的开花基因（Flow-eringlocus T,FT)表达以调节环境温度响应性开花，在低温（16）条件下,过表达miR156会抑制拟南芥开花，而过表达SPL3基因则会促进拟南芥开花2 4。在大豆（Clycine max）中,Gm-miR156b靶向SPL直系同源物，并负调控GmSPLs，从而上调大豆开花相关基因的启动子,延迟大豆开花时间2 5。在对SPL家族基因的研究中,发现其多个基因可以参与植物生长发育的调控。miR156通过靶向SBP/西南农业学报表3mtr-miR156a调控蛋白质合成和脂类代谢相关靶基因预测Table 3mtr-miR156a regulation protein synthesis and lipid metabolism related target genes信号通路Signal pathwayPI3K-Akt signaling pathwayPPAR signaling pathway36卷预测靶基因基因功能预测Predicted target geneGene function predictionHSP90AB1、EPH A 2、I L4R、PI K 3R2、G NB4、JA K 1、G NB5、VEGFA、PPP2 R5D、FG F2、M ET、PD G FA、FG F5、K I T LG、THBS2、JA K 3、RA C1PPAR、A CSL1、O LR1、LPL、EH H A D H、A CSL6、CPT 1A、FABP5Protein synthesisLipid metabolismSPL基因参与调控植物的生长发育过程2 6-2 7 。多年生低温短日照植物草莓（Fragariaananassa）中miR156通过靶基因FaSPL9对草莓的生长发育呈负调控作用,抑制草莓的开花及生长发育2 8 。叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，在高等植物中叶绿素主要有叶绿素a和叶绿素b,叶绿素含量越多,植物光合作用能力越强。在水稻中SPL14能够直接结合叶绿素b还原酶（Non-yellow coloringl，NYCI）基因的启动子来抑制NYC的表达，而miR156可以抑制SPL14的表达，即miR156-SPL14-NYC1基因作用在同一信号通路上，从而对叶绿素含量起到负调控作用，进而影响水稻的生长发育2 9 。此外，miR156在转录水平还可以抑制SPL13,从而增加WD40-1基因表达来增强紫花首的抗早能力30 植物miR156除了可对植物的种子成熟过程、开花、抗旱能力进行调控外，还可以进人动物体内，被动物机体吸收，跨界调控动物细胞的生理功能。2012年首次研究发现，植物源外源性miRNA存在人体血清中,检测到miR168a和miR156a有较高的表达水平,其中大米来源的miR168a能够被消化道吸收进入肝脏靶向低密度脂蛋白受体衔接蛋白1(Low-density lipoprotein receptor adapter protein I,LD-LRAP1),导致小鼠血浆中LDL含量升高31。这一现象的发现,使研究人员对植物miRNA跨界调控的研究产生了兴趣,因此有更多的人开始对植物miR-NA跨界调控动物基因表达机制进行深人研究。在之后几年的研究中，miR156a-5p在小麦32 和玉米33 等经济作物中高表达，小麦和玉米作为人类食品和动物饲料的重要来源，被人和动物大量摄食，其所含的miR156a-5p也可能随着饮食进人人和动物体内发挥跨界调控作用。在最近的研究报道中,植物miR156a-5p可以靶向通路上游基因Wnt家族成员10 b(Wntfamilymember10b,Wnt10b）在细胞水平抑制Wnt/-catenin信号通路活性，抑制肠道上皮细胞增殖,影响小鼠肠道发育34。在成年母猪体内也检测到了玉米来源的miR156a-5p,并发现玉米衍生的miR156a-5p可以穿过胃肠道并留存在母猪体内，7期表明外源性miRNA具有调节哺乳动物基因表达的潜力35。此外,在甘草水煎剂中发现的miR156,通过靶向Toll样受体（Toll-likereceptor,TLR）家族基因从而在小鼠和人体内抑制炎症、抑制细胞调亡、促进细胞增殖、调节肠道菌群的组成以及肠道免疫系统的作用36-38 。研究还发现,miR156可以靶向鲍曼不动杆菌（Acinetobacterbaumanni,AB），调节AB菌的生长,通过调节肠道菌群来调节肠道免疫；与对照组相比,miR156灌胃组能显著提高小鼠肠道内优势菌群的存活，不仅可以影响自身的肠道菌群和肠道免疫，还会影响同笼饲养互食粪便共培养未灌胃小鼠的肠道菌群和肠道免疫。miR156可以靶向Cd28和 Cd79a基因并使之上调,激活脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞信号通路,促进小鼠脾脏免疫39 。Cd28分子是一种广泛存在于T细胞表面的I型跨膜蛋白受体,属于免疫球蛋白家族，参与共刺激信号通路40 1,促进T淋巴细胞增殖,在免疫应答中发挥重要作用41。Cd79a 是B细胞标志物,与 B细胞受体结合后产生信号转导。研究表明，植物miR156a对人结肠腺癌细胞（Human colorectal adenocarcinomacells,Caco-2)中 JAM-A(Junction adhesion molecule-A,JAM-A)基因有直接靶向作用，miR156a可以抑制人Caco-2 细胞中 JAM-A 的表达。而对小鼠主动脉内皮细胞中JAM-A基因的mRNA水平没有明显变化42 。推测植物miR156在哺乳动物中与JAM-A潜在靶点不完全保守，说明植物miR156与JAM-A结合跨界调控可能具有种属性。连接粘附分子A(Junction adhesion molecule-A,JAM-A)是免疫球蛋白超家族跨膜粘附分子成员，主要存在于内皮和上皮紧密连接处，也存在于循环白细胞和血小板上43。它发挥着广泛的功能，包括调节细胞极性、细胞迁移、血管完整性和细胞旁通透性44-48 。因此,植物miR156a抑制人体内JAM-A的表达，可能会增强内皮细胞的迁移，从而减少人体内动脉粥样硬化斑块的形成49 。本研究利用生物信息学方法对mtr-miR156基因家族的成熟序列和茎环序列进行保守性分析、同源树分析、成熟序列染色体定位、靶基因预测。发现mtr-miR156基因家族共有10 个家族成员，其中8 个成员成熟序列完全一致，其余2 个成员成熟序列保守性较高。在茎环序列中,10 个成员中位于成熟序列位置的碱基与成熟序列一致。通过对mtr-miR156基因家族茎环序列进行同源树分析发现，在进化过程中茎环序列碱基发生了突变和缺失,产生了茎环序列只有成熟序列区高度保守